小眼畸形相关转录因子转录调控与白癜风临床类型的相关性研究

目的 研究小眼畸形相关转录因子(MITF)及其转录调控的酪氨酸酶相关蛋白(TRPs)与白癜风临床类型的相关性.方法 选择非节段型白癜风(NSV)17例和节段型白癜风(SV) 13例,对所有病例均取白斑区、远离白斑正常肤色区的表皮片,首先应用免疫组织化学方法原位检测黑素细胞的MITF及其主要转录调控分子酪氨酸酶(TYR)、酪氨酸酶相关蛋白1(TYRPI)和酪氨酸酶相关蛋白2(TYRP2)的表达情况,并对所有30例远离白斑正常肤色区的表皮黑素细胞进行培养,应用免疫印迹方法检测培养的黑素细胞MITF及TYR、TYRP1和TYRP2的表达情况.结果 (1)原位表达结果:白斑区:所有病例MITF及TYR、TYRP1和TYRP2的表达均为阴性;正常肤色区:SV的MITF表达显著抑制,与NSV及正常人对比均具有统计学差异(P＜0.05),NSV的MITF、NSV与SV的TYR、TYRP1和TYRP2表达与正常人对比均没有统计学差异(P＞0.05).(2)培养黑素细胞的蛋白表达结果:NSV的TYRP2表达下调,与正常人对比具有统计学差异(P＜0.05),而MITF、TYR和TYRP1表达正常;SV的MITF与NSV及正常人对比均具有统计学差异(P＜0.05),而TYR、TYRP1和TYRP2正常表达.结论 NSV和SV可能存在不同的MITF转录调控机制.     

白及多糖对酪氨酸酶活性及黑色素生成的影响

目的:观察白及多糖对酪氨酸酶(TYR)活性及黑色素形成相关蛋白TYR、小眼畸形相关转录因子(MITF)表达的影响。方法:超声提取白及多糖粗品。用不同浓度的白及多糖(0.05、0.1、0.2、0.4、0.8 g/L)和曲酸(阳性对照,0.1、0.2、0.4 g/L)作用于小鼠B16黑色素瘤细胞,用于检测细胞活性、TYR活性;各组细胞分别加入α-黑色素细胞刺激素(α-MSH)及不同浓度药物共培养后检测黑色素含量;将细胞分为空白组、模型组(α-MSH)、曲酸组及白及多糖低、中、高剂量组,予相应干预48 h后,应用Western blot检测B16细胞TYR和小眼畸形相关转录因子(MITF)的蛋白表达情况。结果:不同浓度曲酸组、白及多糖(0.05~0.8 g/L)组、空白组间的细胞活性差异无统计学意义(P0.05)。与空白组比较,白及多糖在浓度0.1~0.8 g/L对TYR的活性有显著抑制作用(P0.05,P0.01),其作用与阳性对照曲酸相当;白及多糖在浓度0.1~0.8 g/L有较高的抑制黑色素生成作用(P0.05,P0.01);白及多糖浓度0.2~0.4 g/L对TYR、MITF蛋白表达水平有明显抑制作用(P0.05)。结论:白及多糖可能通过抑制TYR的活性和蛋白表达及MITF的蛋白表达,起到抑制黑色素生成的作用。     

核转录因子NFAT5对LPS致伤小鼠肾集合管细胞iMCD3的影响

目的 研究核转录因子激活T细胞核因子(NFAT5)在脓毒症并发急性肾损害调节炎症瀑布效应的作用.方法 体外培养小鼠肾集合管细胞iMCD3,用LPS(10 ng/ml)刺激细胞,同时加入 NFAT5 siRNA,12 h 后,qRT-PCR 和 ELISA检测炎症因子TNFα和MCP-1的基因水平和蛋白水平,Western blot检测细胞核内NFAT5蛋白表达水平,并用染色质免疫共沉淀(ChIP)分别检测NFAT5和TNFα及MCP-1启动子片段结合的富集倍数.结果 LPS(10ng/ml)刺激肾集合管细胞导致炎症因子TNFα和MCP-1的转录合成显著升高(P＜0.05),利用 siRNA 沉默 NFAT5后,TNFα 和 MCP-1的转录及合成均下降.虽然使用Western blot未能检测到LPS刺激iMCD3其核内NFAT5蛋白表达水平增加,但是使用ChIP探测到NFAT5可以分别与TNFα和MCP-1启动子片段结合,开启炎症因子转录及蛋白合成.结论 核转录因子NFAT5参与调节脓毒症并发肾损害的炎症瀑布效应,通过直接结合肾小管细胞中炎症因子TNFα和MCP-1的启动子发挥独特作用.     

正常人黑素细胞MITF对酪氨酸酶相关蛋白的转录调控研究

目的 研究正常人黑素细胞小眼畸形相关转录因子(MITF)对与黑素生成密切相关的酪氨酸酶相关蛋白(TRPs)家族的转录调控.方法 应用小RNA干扰技术(慢病毒感染),对培养的原代正常人黑素细胞进行MITF基因沉默,然后应用实时定量PCR和免疫印迹方法,分别检测MITF基因沉默前后,MITF、酪氨酸酶(TYR)、酪氨酸酶相关蛋白1(TYRP1)和酪氨酸酶相关蛋白2(TYRP2)的基因与蛋白表达水平.结果 正常人黑素细胞具有显著表达的MITF、TYR、TYRP1和TYRP2; MITF基因沉默后,MITF、TYR和TYRP1的基因表达水平分别下降2倍(P =0.001)、1.5倍(P=0.05)和5倍(P =0.005),TYRP2的表达水平上调3倍(P =0.004);而MITF基因沉默后的MITF、TYR、TYRP1的蛋白表达也显著下降,TYRP2蛋白显著升高.结论 黑素细胞TRPs家族与MITF转录调控密切相关,TYRP2可能存在不依赖于MITF的转录调控.     

Smads蛋白结构与功能的研究进展

目的：综述Smads蛋白结构和调节核内特异基因表达机制的最新研究成果。资料来源：MEDLINE/CD-ROM(1997-2000)和中期刊索引（1997-2000）。研究选择：选择国内和国外新近发表的关于TGF-β超家族信号传导方面的原始件。资料录：资料主要引自与本目的密切相关的22篇献。结果：TGF-β家族成员与细胞膜上受体结合后，通过Smads蛋白，调节细胞核内特异的基因表达。从结构和功能上看，Smads蛋白可以分为三类：受体调节-Smads(R-Smads)作为具有Ser/Thr激酶活性的受体-I的直接底物，磷酸化后被激活，通过MH2结构域，与共同介导的Smads(Co-Smads)相互作用，形成异聚体，进入细胞核内，直接与目的基因启动子相结合，影响基因表达；而抑制转录Smads(I-Smads)能够拮抗R-Smads的生物活性。在细胞内，Smads蛋白通过与不同的转录蛋白或转录共调节因子相互作用，在不同类型的细胞内介导特的基因表达。改变Smads蛋白的正常结构和功能能引起人体发生各种病变，如：组织纤维化、瘢痕和肿瘤发生等等。结论：Smads蛋白的结构决定其作为信使分子介导外界信号进入核内。在细胞核内，Smads蛋白能够调节TGF-β超家族依赖的基因表达。     

Smads蛋白结构与功能的研究进展

目的　综述Smads蛋白结构和调节核内特异基因表达机制的最新研究成果.资料来源　MEDLINE/CD-ROM(1997-2000)和中文期刊索引（1997-2000）.研究选择　选择国内和国外新近发表的关于TGF-β超家族信号传导方面的原始文件.资料摘录　资料主要引自与本文目的密切相关的22篇文献.结果　TGF-β家族成员与细胞膜上受体结合后,通过Smads蛋白,调节细胞核内特异的基因表达.从结构和功能上看,Smads蛋白可以分为三类：受体调节-Smads (R-Smads)作为具有Ser/Thr激酶活性的受体-Ⅰ的直接底物,磷酸化后被激活,通过MH2结构域,与共同介导的Smads(Co-Smads)相互作用,形成异聚体,进入细胞核内,直接与目的基因启动子相结合,影响基因表达；而抑制转录Smads(I-Smads)能够拮抗R-Smads的生物活性.在细胞内,Smads蛋白通过与不同的转录蛋白或转录共调节因子相互作用,在不同类型的细胞内介导特异的基因表达.改变Smads蛋白的正常结构和功能能引起人体发生各种病变,如：组织纤维化、瘢痕和肿瘤发生等等.结论　Smads蛋白的结构决定其作为信使分子介导外界信号进入核内.在细胞核内,Smads蛋白能够调节TGF-β超家族依赖的基因表达.     

神经分化因子-1/B细胞E盒转录激活因子2基因与糖尿病

神经分化因子1(NeuroD-1)又名B细胞E盒转录激活因子2(BETA-2),以往也称为NeuroD,属B类碱性螺旋-环-螺旋(bHLH)转录因子家族,作为转录因子,其能高亲和力地与胰岛素基因的E盒结合,在胰岛B细胞中激活胰岛素基因的转录,对胰腺B细胞的发育及生理功能具有重要的作用;也可与其他转录因子相互作用,协同调节胰岛素基因的最终活性状态,故被认为是糖尿病的候选基因之一.现将NeuroD-1的特点及其与糖尿病的关系综述如下.     

干扰素调节因子4与T细胞分化及免疫性疾病的研究进展

干扰素调节因子4(IRF4)是IRFs家族一员,经一系列信号转导作用发挥转录激活或阻遏,调节干扰素的表达、淋巴细胞的分化发育及活性,参与免疫调控。IRF4与白细胞介素、信号转导及转录激活因子、活化T细胞核因子等细胞因子相互作用调节T细胞分化,形成复杂的平衡网络调控系统,平衡网络遭到破坏则免疫功能紊乱,并诱发免疫性疾病,如哮喘、炎症性肠病、关节炎、自身免疫性疾病,其与复发性流产的关系正在探索之中。     

MALAT1调控肿瘤细胞中免疫相关蛋白IRF3的表达

【】 目的 验证长链非编码RNA(long noncoding RNA,lncRNA) MALAT1与干扰素调节因子3(Interferon regulation factor 3,IRF3)的靶向调控关系。方法 将人IRF3启动子荧光素酶报告基因重组质粒pGL3-56与将MALAT1敲降的siRNA阴性对照物(siNC)或siMALAT1-1、siMALAT1-2瞬时共转染A549细胞,检测相对荧光素酶活性。同样使用siNC或siMALAT1-1、siMALAT1-2瞬时共转染A549细胞,反转录-实时荧光定量PCR检测IRF3 mRNA表达水平,western blot 检测IRF3蛋白表达水平。结果 1. 检测相对荧光素酶活性的结果：siNC组、siMALAT1-1组和siMALAT1-2组的相对荧光素酶活性分别是17.19±0.96、11.98±2.31和14.26±0.8,均有统计学意义(P＜0.05)；2.MALAT1与IRF3 mRNA水平检测结果：siNC组、siMALAT1-1组和siMALAT1-2组的MALAT1 mRNA相对表达量分别为1.01±0.01、0.52±0.12以及0.60±0.08,均有统计学意义(P＜0.05)。siNC组、siMALAT1-1组和siMALAT1-2组的IRF3 mRNA相对表达量分别为1.00±0.01、0.66±0.05和0.80±0.05,均有统计学意义(P＜0.05)；3.IRF3蛋白表达水平结果：siNC组、siMALAT1-1组和siMALAT1-2组的IRF3蛋白表达水平分别是0.79±0.09、0.59±0.08和0.62±0.09,均有统计学意义(P＜0.05)。结论 IRF3是MALAT1的靶基因,MALAT1通过调控IRF3启动子区来影响IRF3的转录与表达。     

核转录因子KLF4与VEGF启动子上游DNA序列相互作用研究

目的研究体内核转录因子KLF4是否与血管内皮生长因子（VEGF）启动子上游DNA序列相互作用。方法采用染色质免疫沉淀法鉴定人胃癌AGS细胞内KLF4与VEGF启动子上游DNA序列的相互作用,通过检索VEGF基因序列,发现在VEGF基因转录起始位点上游存在3个KLF4结合位点,针对这3个KLF4结合位点核心DNA序列（CACCC）设计3对PCR引物,利用KLF4抗体进行染色质免疫沉淀,PCR扩增。结果针对VEGF上游启动序列3个潜在的KLF4结合位点设计的引物,以KI。F4特异性结合的DNA片段为模板,能够扩增出目的条带,与阴性对照组比较差异有显著性意义（P〈0．05）。结论体内KLF4可能与VEGF启动子上游DNA序列相互作用。     

染色质免疫沉淀分析胰岛β细胞中TCF7L2与GPR40的结合

目的探讨转录因子TCF7L2与GPR40基因启动子的相互作用。方法采用染色质免疫沉淀(CHIP)技术,在胰岛βTC6细胞株中,用TCF7L2特异性抗体沉淀DNA,聚合酶联式反应(PCR)检测GPR40基因5′特异性序列。结果在TCF7L2特异性抗体免疫沉淀的DNA片段中,扩增出GPR40基因5′特异性序列。结论在胰岛βTC6细胞中,转录因子TCF7L2与GPR40基因启动子存在特异的结合区域,TCF7L2可能参与GPR40的表达调控。     

蟛蜞菊乙醇提取物促进黑色素生成及其机理的初步研究

目的观察中药蟛蜞菊乙醇提取物促进黑色素生成的作用,并初步探讨其作用机理。方法 MTT法、L-Dopa氧化法、NaOH裂解法探讨不同浓度蟛蜞菊乙醇提取物作用于小鼠恶性黑色素瘤细胞(B16)72 h后,对细胞增殖、酪氨酸酶活性及黑色素含量的影响。RT-PCR检测药物作用前后酪氨酸酶、小眼相关转录因子(MITF)等基因表达的影响。结果与对照组比较,蟛蜞菊乙醇提取物能促进B16细胞的增殖,促进酪氨酸酶活性增加和黑色素生成增多;可剂量依赖性上调酪氨酸酶和MITF的mRNA表达。结论蟛蜞菊乙醇提取物可促进B16细胞黑色素生成,其机制可能是通过促进B16细胞增殖、增强酪氨酸酶和MITF的基因表达来实现。     

肝癌细胞核蛋白对白蛋白增强子／启动子序列的体外转录调控作用

目的：研究肝癌细胞核蛋白调控白蛋白＂持家基因＂转录调控序列对目的基因转录的作用。方法：分别从小鼠肝癌细胞、肝细胞和黑色素瘤细胞中提取核蛋白组分,用于体外启动白蛋白增强子／启动子的转录作用。结果：发现某些肝癌细胞和肝细胞核蛋白组分具有明显的转录作用,而细胞浆蛋白和其他肿瘤核蛋白组分没有转录作用,将同一肝癌细胞某些核蛋白组分合并可使转录活性增强。结论：本研究在基因转录调控水平部分解释了应用白蛋白增强子／启动子调控目的基因于肝癌细胞中特异表达的机理。     

热休克因子1对FasL的调控作用

目的研究人热休克因子1(HSF1)对Fas配体(FasL)启动子转录活性的影响。方法用在线启动子分析软件分析FasL启动子区转录因子结合位点;凝胶阻滞实验(EMSA)研究内源性HSF1与FasL启动子区的热休克元件(HSE)结合能力;将组成型活化的HSF1突变体与FasL启动子表达载体FasL-luc共同转染HeLa细胞,采用双荧光素酶报告基因检测系统,检测荧光索酶活性。结果在FasL启动子区发现HSE核心序列(nGAAnnTTCn),HSF1可以与该HSE体外结合;荧光素酶活性测定发现HSF1明显上调FasL-luc转录活性,突变该HSE,则转录激活作用消失。结论 HSF1对FasL具有转录调控作用。     

CDC25B与CDK2/Cyclin A蛋白相互作用研究

目的:研究双特异性蛋白磷酸酶B（CDC25B）与细胞周期素 A(Cyclin A)和细胞周期素依赖性激酶2（CDK2）蛋白发生相互作用的结构基础。方法:应用Discovery Studio (DS) v3.5中的ZDOCK模块对CDC25B与CDK2/Cyclin A蛋白进行对接。应用“Analyze Protein Interface”模块计算CDC25B蛋白和CDK2/Cyclin A蛋白的溶剂可及表面积（SAS）并分析CDC25B蛋白和CDK2/Cyclin A蛋白相互作用界面的关键氨基酸残基。应用“Calculate Interaction Energy”模块计算 CDC25B蛋白和CDK2/Cyclin A蛋白相互作用界面处的关键氨基酸残基间的相互作用能。结果:对pose 1的疏水相互作用、氢键相互作用、相互作用能进行计算分析,预测得到CDC25B-CDK2/Cyclin A复合物的结合模式及起相互作用的氨基酸残基（CDC25B: GLY380,TYR382, ARG485, ARG488,GLU489,ARG490,ARG492,TYR497;CDK2/Cyclin A:THR165, TRP167,ASP206,SER207,ASP210, PHE213）。结论:该结果为今后深入研究 CDC25B通路和发挥协同刺激作用的信号体系以及基于该信号途径新型分子靶向药物的设计提供了理论基础。     

cAMP对lac基因启动子体外转录影响的研究

目的：研究ｃＡＭＰ对ｌａｃ基因启动子体外转录的影响作用。方法：以含ｌａｃ基因启动子及其Ｚ结构基因的线性ｐＵＲ２２２ＤＮＡ为模板，观察Ｅ．ｃｏｌｉＲＮＡ聚合酶受ｃＡＭＰ作用后的转录强度。结果：０．１０～０．８０ｍｍｏｌ／Ｌ的ｃＡＭＰ对ｌａｃ基因启动子体外转录有明显的促进作用，低于０．１０ｍｍｏｌ／Ｌ对体外非特异性转录有促进作用；浓度进一步增高对转录起抑制作用。ｃＡＭＰ作用下特异性与非特异性转录产物放射活性间无相关性。结论：ｃＡＭＰ对转录有双重作用，这种作用可能与启动子区的构象特点及ＲＮＡ聚合酶与启动子的特异结合有关。     

异丙酚对脂多糖诱导人脐静脉内皮细胞内皮源型一氧化氮合酶基因启动子转录活性的影响

目的 探讨异丙酚对脂多糖(LPS)诱导人脐静脉内皮细胞(HUVEC)内皮源型一氧化氮合酶(heNOS)基因启动子转录活性的影响.方法 以基因重组技术构建heNOS基因启动子区(-1～-1600 bp)驱动的萤火虫荧光素酶报告基因载体pGL2-Basic,得到质粒peNOS-Luc.采用脂质体介导的细胞基因共转染技术将peNOS-Luc、空载体pGL2-Basic和?-半乳糖苷酶表达质粒pCMV-?共转染HUVEC,用LPS、LPS 异丙酚和LPS 转移生长因子?1(TGFb1)分别刺激转染后的HUVEC,检测并比较荧光素酶/?-半乳糖苷酶活性,以确定LPS、异丙酚和TGF?1对heNOS基因启动子转录活性的影响.结果 (1)酶切和测序结果均证实重组载体peNOS-Luc构建正确;(2)重组载体peNOS-Luc在HUVEC中有效表达;(3)与未加刺激组比较,LPS刺激组heNOS启动子的转录活性降低.与LPS刺激组比较,LPS 异丙酚和LPS TGF?1组heNOS启动子的转录活性增强.结论 异丙酚能明显增强heNOS基因启动子的转录活性,可初步证实异丙酚在转录水平通过上调heNOS基因启动子的转录活性而影响NO的生成和释放,这可能是异丙酚防治LPS诱导引起炎症反应的机制之一.