含人干细胞白血病基因慢病毒载体转染Cajal样间质细胞的效果研究

目的 观察携带增强绿色荧光蛋白（GFP）的含人干细胞白血病（SCL）基因慢病毒载体转染体外培养的豚鼠膀胱Cajal样间质细胞（ICC）的效果。方法 2014年10月-2015年8月,选取普通级成年健康豚鼠16只。构建含人SCL基因的慢病毒载体,并标定病毒滴度;采用随机数字表法选取健康豚鼠4只,采用颈椎脱臼方法将其杀死,体外培养豚鼠膀胱ICC。设置不同感染复数（MOI）（0.5、1.0、5.0、10.0、50.0、100.0）,利用含人SCL基因的慢病毒载体转染ICC,在激光共聚焦显微镜下观察ICC生长状态并计算转染效率,确定最佳MOI。采用随机数字表法将ICC分为正常对照组、空白质粒对照组与慢病毒转染组,其中正常对照组加入1%磷酸盐缓冲液（PBS）,空白质粒对照组加入空慢病毒,慢病毒转染组按最佳MOI加入含人SCL基因的慢病毒载体,计算各组转染效率,确定最佳转染时间。采用反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）法检测SCL mRNA表达情况。上述实验均独立重复4次。结果 经测定,病毒滴度为5×108 TU/ml。倒置显微镜下发现一些特征性梭形细胞,其两侧有显著外凸分枝,细胞核较大,其外形规则,有序地实现细胞贴壁,而其他未贴壁细胞则呈现与ICC不一样的形态,胞体多为椭圆形,细胞两极无突起,整体形状扁平。激光共聚焦显微镜下可以发现酪氨酸蛋白激酶生长因子受体（c-kit）受体成功表达,证实培养的细胞是膀胱ICC。观察各组ICC生长状态,当MOI为0.5、1.0、5.0、10.0时,细胞生长状态较好,无细胞死亡,当MOI为50.0、100.0时,可见部分细胞死亡,细胞活性降低;MOI为1.0、5.0、10.0、50.0、100.0时的转染效率高于MOI为0.5时（P＜0.05）;MOI为5.0、10.0、50.0、100.0时的转染效率高于MOI为1.0时（P＜0.05）;MOI为10.0、50.0、100.0时的转染效率高于MOI为5.0时（P＜0.05）;MOI为50.0、100.0时的转染效率高于MOI为10.0时（P＜0.05）;综合ICC生长状态及转染效率,确定含人SCL基因慢病毒载体转染ICC的最佳MOI为10.0。正常对照组、空白质粒对照组ICC中无GFP表达;慢病毒转染组转染3 d时ICC中GFP表达强度高于转染2 d、转染5 d时,确定含人SCL基因慢病毒载体转染ICC的最佳转染时间为3 d。慢病毒转染组中扩增产物大小与目的片段大小1 036 bp一致,而正常对照组及空白质粒对照组均未见特异性条带表达,表明SCL基因成功导入ICC。结论 利用含人SCL基因慢病毒载体能高效转染体外培养的ICC,并成功介导SCL基因在ICC中的表达,为下一步研究利用SCL基因进行体内转染实验奠定基础。     

人干细胞白血病基因重组慢病毒载体的构建及其在Cajal样间质细胞中的表达

摘要：目的  构建含人干细胞白血病（SCL）基因的重组慢病毒载体,并转染体外培养的Cajal样间质细胞（ICC）,为进一步利用慢病毒表达载体行体内实验奠定基础。方法  通过聚合酶链反应（PCR）将人SCL基质粒内的遗传物质扩增,与慢病毒载体质粒GV287-EGFP结合,构建重组质粒GV287-EGFP/SCL,通过Western blot检测及基因测序对阳性克隆进行鉴定,并测定病毒滴度。体外分离、培养及鉴定ICC,重组慢病毒载体以感染复数（MOI）值为0.5、1.0、5.0、10.0、50.0和100.0时,分别转染ICC,通过激光共聚焦显微镜观察,计算不同MOI值的转染效果,确定最佳MOI值。重组慢病毒载体以最佳MOI值感染ICC作为实验组,以空载体转染的ICC（空载体组）及未转染的ICC（空白组）作为对照,通过逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测SCL基因在ICC中的表达。结果  经Western blot检测及基因测序鉴定SCL重组慢病毒表达载体构建成功,并成功转染ICC,激光共聚焦显微镜下可观察到强绿色荧光。MOI为10时转染效果最佳,转染效率>85%;RT-PCR结果表明,实验组SCL基因的表达量高于空载体组和空白组。结论  成功制备人SCL基因重组慢病毒载体,并能高效转染ICC,介导SCL基因在ICC中表达。

     

体外Cajal样细胞c-kit基因mRNA在高糖环境下表达变化及意义

目的：观察体外高糖环境下Cajal样细胞（interstitial cells of Cajal-like,ICCs）c-kit mRNA表达变化。方法：胶原酶消化法原代分离培养豚鼠膀胱ICCs,加入含葡萄糖浓度分别为5mmol/L、15mmol/L、30mmol/L培养基培养24h、48h、72h后,应用逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）法检测高糖环境下c-kit基因mRNA表达水平的变化。结果：RT-PCR电泳经分析显示15mmol/L、30mmol/L组ICCs c-kit mRNA表达较5mmol/L组降低（P〈0.01）,72h组较24h组、48h组表达降低。结论：高糖环境造成ICCs c-kit基因mRNA表达水平降低,可导致ICCs的SCF/c-kit信号通路异常,ICCs功能及结构障碍,可能是糖尿病膀胱病变的发病机制之一。     

高糖对人肾小管上皮细胞肌醇加氧酶表达的影响

目的:研究高糖环境下人近端肾小管上皮细胞肌醇加氧酶(MIOX)的表达.方法:将人近端肾小管上皮细胞株HK-2分组培养,正常对照组培养基含5.5 mmol/L D-葡萄糖,渗透浓度对照组培养基含19.5 mmoL/L甘露醇和5.5 mmoL/L D-葡萄糖,高糖组培养基含25 mmol/L D-葡萄糖.分别于培养12、24、48、72 h后取出爬片,应用免疫荧光细胞化学法检测MIOX蛋白的表达.结果:正常对照组和渗透浓度对照组HK-2细胞胞质MIOX蛋白微弱表达,各时间点表达量差异无统计学意义(P>0.05).高糖组培养12 h时,HK-2细胞MIOX蛋白表达即增高,随培养时间的延长,MIOX蛋白表达量逐渐升高,于48 h达高峰.高糖组MIOX蛋白表达水平较正常对照组升高(P<0.01).结论:高糖能促进人近端肾小管上皮细胞MIOX的表达,从而介导糖尿病患者体内肌醇耗竭.     

高糖对体外培养的Cajal间质细胞nNOS?HO-2表达的影响

目的:观察高糖对体外培养的Cajal间质细胞(interstitial cells of Cajal,ICC)的nNOS、HO-2表达的影响,探讨NO、CO在糖尿病胃肠功能紊乱的细胞机制.方法:以小鼠小肠为ICC的组织来源,应用酶解法分离、培养ICC.实验分组:正常对照组(葡萄糖浓度为5.5 mmol/L);甘露醇渗透压对照组(葡萄糖浓度为5.5 mmol/L、甘露醇浓度为27.5 mmol/L);高糖组(葡萄糖浓度为33 mmoI/L).通过倒置显微镜观察细胞形态、MTT比色法检测细胞活力、用Western-Blot方法对细胞内的nNOS、HO-2的表达进行分析.结果:与正常组比较,加入葡萄糖后的ICC细胞变圆,突起变短,与周围的邻近细胞网络不明显、细胞活力也下降,而加入甘露醇后的ICC基本没有变化.免疫印迹法检测到甘露醇组的nNOS、HO-2的表达与正常组无明显差异,而高糖组的nNOS、HO-2与正常组比较其表达明显下降.结论:高糖改变了体外培养的ICC的细胞形态、降低了ICC的细胞活力及其细胞内nNOS、HO-2的表达,提示胃肠道组织中的ICC的形态、活力及其胞内的NO、CO可能涉及糖尿病胃肠功能紊乱的发病机制.     

RNA干扰下调Gremlin表达对高糖培养的大鼠肾小球系膜细胞分泌FN、ColⅣ的影响

目的探讨在高糖培养条件下,应用慢病毒介导的RNA干扰下调Gremlin表达对大鼠肾小球系膜细胞(RMCs)分泌纤维连接蛋白(FN)、Ⅳ型胶原(ColⅣ)的影响及机制。方法构建Gremlin基因特异性的短发夹双链RNA(shRNA)慢病毒GREM1-RNAi-LV,感染RMCs后,分为5.5 mmol/L葡萄糖组、30 mmol/L葡萄糖组、30 mmol/L葡萄糖+GREM1-RNAi-LV组及30 mmol/L葡萄糖+NC-GFP-LV(感染携带绿色荧光蛋白的阴性对照慢病毒)组,分别处理48 h,RT-PCR检测Gremlin mRNA表达,Western Blot检测Gremlin蛋白表达,ELISA法检测细胞上清FN、ColⅣ蛋白表达变化。结果与5.5 mmol/L葡萄糖组相比,30 mmol/L葡萄糖组Gremlin mRNA和蛋白水平显著升高(P均<0.05),细胞外基质分泌FN、ColⅣ蛋白增加(P均<0.05),而RNA干扰能下调高糖诱导的Gremlin mRNA与蛋白高表达(P<0.05),降低细胞外基质FN、ColⅣ蛋白分泌(P<0.05)。结论慢病毒介导的RNA干扰可明显抑制高糖诱导的Gremlin高表达,降低细胞外基质分泌,改善肾脏纤维化,可能是一个预防和治疗糖尿病肾病新型的潜在靶点。     

siRNA沉默CTGF表达对高糖诱导人肾小管上皮细胞转分化的影响

目的探讨针对结缔组织生长因子(CTGF)基因的siRNA对高糖条件培养下的人肾小管上皮细胞株HK-2细胞向间充质细胞转分化(EMT)的影响。方法将体外培养的HK-2细胞分为6组:(1)正常对照组,培养基含D-葡萄糖1g/L;(2)等渗对照组,培养基含D-葡萄糖1g/L,甘露醇3.5 g/L;(3)高糖组,培养基含D-葡萄糖4.5 g/L;(4)高糖+空白对照组:细胞转染空白质粒后于高糖培养基中培养;(5)高糖+阴性对照组:细胞转染含无关序列的重组质粒后于高糖培养基中培养;(6)高糖+干扰组:细胞转染针对CTGF的siR-NA表达质粒后于高糖培养基中培养。应用RT-PCR检测CTGF mRNA水平,Western blot法检测CTGF、E-钙黏蛋白(E-cadherin)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)蛋白水平。结果高糖刺激可上调HK-2细胞的CTGFmRNA及蛋白水平,并呈时间依赖性降低HK-2细胞的E-cadherin蛋白表达水平,升高α-SMA蛋白表达水平。而通过特异性siRNA抑制CTGF mRNA表达后,细胞的CTGF蛋白表达随时间延长进行性降低,同时伴有细胞E-cadherin蛋白表达升高,α-...     

大鼠BMP-7基因慢病毒载体构建及其在肝星状细胞中的表达

目的 构建携带大鼠BMP-7基因的慢病毒载体并实现该基因在肝星状细胞株HSC-T6中的稳定高表达,为进一步研究BMP-7的抗肝纤维化功能奠定基础.方法 从大鼠细胞基因中提取并用PCR方法扩增BMP-7目的基因,构建BMP-7重组表达载体Lenti-copGFP/puro-BMP7,脂质体法将重组慢病毒载体和包装质粒混合物共转染293TN工具细胞,包装产生慢病毒颗粒.慢病毒感染H1299细胞,根据细胞绿色荧光蛋白（GFP）的表达水平测定病毒滴度.将HSC-T6细胞分为空白组、空病毒对照组及BMP-7慢病毒感染组,分别用Real-Time PCR和Western blotting方法检测BMP-7 mRNA和蛋白的表达.结果 PCR扩增检测阳性菌落和测序证实,成功构建大鼠BMP-7基因重组慢病毒载体.倒置荧光显微镜下观察可见,H1299细胞呈绿色荧光,并测得病毒滴度为1×104 ifμ/μL.重组慢病毒感染HSC-T6后,Real-time PCR和Western blotting方法分别检测到BMP-7 mRNA和蛋白均稳定高表达.BMP-7慢病毒感染组与空病毒对照组比较,差异有统计学意义（P〈0.01）;空病毒对照组与空白组比较,差异无统计学意义（P〈0.05）.结论 成功构建了带有大鼠BMP-7基因的慢病毒载体,并实现其在HSC-T6的稳定高表达.     

IL-22重组慢病毒促进肝细胞再生的作用研究

目的：研究 IL-22重组慢病毒对肝细胞再生的作用。方法体外培养人正常肝细胞 L02,荧光显微镜下观察感染IL-22重组慢病毒后1、3、5 d 的感染效率,ELISA 检测 L02中 IL-22的表达。设置3个处理组,分别为感染 IL-22重组慢病毒组、感染空慢病毒组及未感染组。处理后48 h,RT-PCR 检测 L02细胞中结合珠蛋白 mRNA 的表达;MTT 法检测处理后48、72、96 h L02细胞的增殖活性;免疫细胞化学检测处理后24 h L02细胞中增殖核抗原(PCNA)的表达。结果IL-22重组慢病毒组感染L02细胞第3天的感染效率最高,可达(90.12±3.45)%。ELISA 检测感染后第3天,L02细胞中 IL-22的表达明显高于第1天和第5天(P <0.05)。感染 IL-22重组慢病毒组 L02细胞中结合珠蛋白 mRNA 表达显著高于其他两组(P <0.01),而感染空慢病毒组和未感染组 L02细胞中结合珠蛋白 mRNA 的表达差异无统计学意义(P >0.05)。感染 IL-22重组慢病毒组 L02细胞各时间点的增殖活性均明显高于感染空慢病毒组及未感染组(P <0.05);感染 IL-22重组慢病毒组 L02细胞中 PCNA 的表达显著高于感染空慢病毒组及未感染组(P <0.01),而感染空慢病毒组和未感染组 L02细胞中 PCNA 的表达差异无统计学意义(P >0.05)。结论IL-22可以促进 L02细胞结合珠蛋白 mRNA 及 PCNA 的表达,并能增强 L02细胞的增殖活性,可能对肝细胞再生有促进作用。     

高糖通过结缔组织生长因子诱导足细胞减少podocalyxin的表达

摘要：目的探讨高糖对小鼠足细胞podocalyxin表达的影响及结缔组织生长因子（CTGF）参与其损伤的可能机制。方法
构建针对CTGF基因的特异性siRNA质粒并转染至小鼠足细胞。将体外培养的足细胞分为6组( 1)正常对照组,正常足细
胞其培养基含D-葡萄糖1 g/L;(2)等渗对照组,正常足细胞其培养基含D-葡萄糖1 g /L,甘露醇3.5 g/L;(3)高糖组,正常足
细胞其培养基含D-葡萄糖4.5 g/L;(4)高糖+空白对照组：足细胞转染空白质粒后于高糖培养基中培养;(5)高糖+阴性对照
组：足细胞转染含无关序列的重组质粒后于高糖培养基中培养;(6)高糖+干扰组：足细胞转染针对CTGF的siRNA表达质
粒后于高糖培养基中培养。Western blot 方法检测小鼠足细胞Podocalyxin、CTGF 蛋白表达及细胞外信号调节激酶
（ERK1/2）磷酸化水平。结果高糖培养足细胞24、48 h时均可下调其Podocalyxin蛋白表达量（P<0.05）,并可诱导CTGF
蛋白表达增加（P<0.05）。同时高糖可以活化足细胞ERK1/2信号途径,在高糖刺激30 min时开始活化,持续活化至24 h。
特异性siRNA干扰CTGF合成后,ERK1/2活化减少,并且足细胞Podocalyxin表达升高。结论CTGF是高糖诱导小鼠足
细胞损伤的重要介质,可通过ERK1/2途径诱导podocalyxin表达下降,针对CTGF的siRNA能明显改善podocalyxin表达
量,为DN的治疗提供新的思路。     

过表达Mxi1对人胃癌SGC-7901细胞增殖和凋亡的影响

目的：构建含有Max结合蛋白1（Mxi1）基因的重组慢病毒载体,并探讨过表达Mxi1基因对人胃癌SGC-7901细胞增殖和凋亡的影响。方法：利用DNA重组技术将Mxi1基因克隆至慢病毒载体,经酶切和测序鉴定后,将重组质粒与慢病毒辅助包装元件质粒共转染293T 细胞,获得含 Mxi1基因的重组慢病毒。重组慢病毒感染人胃癌SGC-7901细胞,荧光显微镜下观察感染效率,逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测Mxi1、cyclinB1和caspase-8的基因表达,免疫印迹法（Western blot）检测Mxi1蛋白的表达。CCK-8比色法和流式细胞术分别检测Mxi1 基因对人胃癌SGC-7901细胞增殖和凋亡的影响。结果：成功构建含 Mxi1基因的慢病毒表达载体,RT-PCR和Western blot检测到Mxi1 基因和蛋白的表达。RT-PCR结果显示,过表达Mxi1 的SGC-7901细胞与空白对照细胞及过表达空病毒对照细胞相比,细胞内cyclinB1的mRNA表达水平明显降低,而caspase-8的 mRNA表达水平显著升高。CCK-8实验和流式细胞术检测结果显示,过表达Mxi1的SGC-7901细胞与空白对照细胞及过表达空病毒对照细胞相比,细胞增殖活性明显降低,细胞凋亡率显著升高。结论：成功构建Mxi1慢病毒载体且有效转染SGC-7901细胞,过表达Mxi1 可以抑制胃癌细胞增殖并促进其凋亡。     

高糖环境下Lipin1对神经元代谢组学的影响

目的 探讨高糖环境下磷脂酸磷酸酶(Lipin1)对PC12细胞代谢组学的影响。方法 构建感染慢病毒的PC12细胞。用25 mmol/L正常糖浓度孵育感染空壳病毒的PC12细胞(WT组)和感染低表达Lipin1病毒的PC12细胞(D-WT组),用100 mmol/L高糖浓度孵育感染空壳病毒的PC12细胞(HG组)和感染过表达Lipin1病毒的PC12细胞(G-HG组),48 h后,使用蛋白免疫印迹法对Lipin1的表达进行验证(n≥6)。WT组、HG组和G-HG组处理48h,收集细胞。细胞进行液相色谱串联质谱,比较代谢组学差异(n=6)。结果 与WT组相比,D-WT组和HG组的Lipin1表达明显降低(P<0.05);G-HG组与HG组相比,Lipin1表达明显升高(P<0.01)。以VIP>1,P<0.05,差异倍数(FC)>1.5或<0.65为差异代谢物筛选标准,与WT组相比,HG组谷氨酸明显下降;与HG组相比,G-HG组甘油二酯(DAG)、2-花生酰基甘油(2-AG)等明显上升。高糖孵育和调控Lipin1后的认知相关通路涉及到逆行内源性大麻素信号...     

大鼠BMP-7基因慢病毒载体构建及其在肝星状细胞中的表达

目的 构建携带大鼠BMP-7基因的慢病毒载体并实现该基因在肝星状细胞株HSC-T6中的稳定高表达,为进一步研究BMP-7的抗肝纤维化功能奠定基础。方法 从大鼠细胞基因中提取并用PCR方法扩增BMP-7目的基因,构建BMP-7重组表达载体Lenti-copGFP/puro-BMP7,脂质体法将重组慢病毒载体和包装质粒混合物共转染293TN工具细胞,包装产生慢病毒颗粒。慢病毒感染H1299细胞,根据细胞绿色荧光蛋白（GFP）的表达水平测定病毒滴度。将HSC-T6细胞分为空白组、空病毒对照组及BMP-7慢病毒感染组,分别用Real-Time PCR和Western blotting方法检测BMP-7 mRNA和蛋白的表达。结果 PCR扩增检测阳性菌落和测序证实,成功构建大鼠BMP-7基因重组慢病毒载体。倒置荧光显微镜下观察可见,H1299细胞呈绿色荧光,并测得病毒滴度为1×104 ifμ/μL。重组慢病毒感染HSC-T6后,Real-time PCR和Western blotting方法分别检测到BMP-7 mRNA和蛋白均稳定高表达。BMP-7慢病毒感染组与空病毒对照组比较,差异有统计学意义（P<0.01）;空病毒对照组与空白组比较,差异无统计学意义（P<0.05）。结论 成功构建了带有大鼠BMP-7基因的慢病毒载体,并实现其在HSC-T6的稳定高表达。     

高浓度葡萄糖对膀胱癌T24细胞增殖及β-catenin表达的影响

目的 探讨高浓度葡萄糖对膀胱癌T24细胞增殖的影响,并探讨其可能的作用机制.方法 用含10% FBS的DMEM培养液体外培养膀胱癌T24细胞,将细胞分为5组:空白组(5.5 mmol/L葡萄糖)、对照组(5.5 mmol/L葡萄糖+25 mmol/L甘露醇)、高糖组(10、20、30 mmol/L葡萄糖).采用MTT法及克隆形成实验检测高浓度葡萄糖对膀胱癌T24细胞增殖的影响;通过实时定量PCR检测膀胱癌T24细胞β-catenin mRNA的表达水平;通过Western blot法检测高浓度葡萄糖对膀胱癌T24细胞β-catenin蛋白表达的影响.结果 MTT法及克隆形成实验结果显示,高浓度葡萄糖显著促进膀胱癌T24细胞的增殖(P<0.01);Western blot检测结果显示,高浓度葡萄糖促进T24细胞β-catenin蛋白的表达.实时定量PCR检测结果显示,高浓度葡萄糖促进T24细胞β-catenin mRNA的表达.结论 高浓度葡萄糖明显促进膀胱癌T24细胞的增殖,并促进T24细胞β-catenin蛋白和其mRNA的表达,该作用机制可能与β-catenin表达上调有关.     

miR-146a在HepG2.2.15细胞中对c-Myc基因表达影响的研究

目的 构建has-miR-146a真核过表达载体pmR-146a,探究其在HepG2.2.15肝癌细胞中对c-Myc基因的表达调控作用.方法 PCR扩增has-miR-146a的前体基因片段(pre-has-miR-146a),双酶切后连接到pmR-mCherry载体上,通过菌落PCR、双酶切和测序验证重组载体的准确性;将重组载体转染到HepG2.2.15肝癌细胞中作为实验组,同时设空载体组(转染pmR-mCherry空质粒组),空白组(转染试剂Lipofectamin0 2000+ PBS),24、48 h后观察载体荧光蛋白表达量,qPCR检测各组细胞has-miR-146a表达情况;转染24、48 h后qPCR检测c-Myc基因mRNA表达量,48 h后Western blot检测c-Myc蛋白表达水平.结果 经菌落PCR、双酶切和测序证实,pre-has-miR-146a基因片段插入pmR-mCherry载体中;实验组和空载体组转染24、48 h荧光显微镜观察可见强荧光,与非荧光条件下作对比,转染效率在50％～60％;实验组has-miR-146a表达量明显高于空载体组和空白组(P＜0.01);转染24、48 h后实验组细胞c-Myc基因mRNA表达量较空载体组和空白组低(P＜0.05);转染48 h后,蛋白表达量较空载体组和空白组低(P＜0.01).结论成功构建has-miR-146a真核过表达载体pmR-has-146a,该重组载体可稳定表达has-miR-146a;has-miR-146a可以下调c-Myc癌基因的表达,可以作为治疗原发性肝癌的潜在靶点之一.