siRNA介导survivin基因沉默诱导人前列腺癌PC3、LNCaP细胞凋亡的研究

目的 研究siRNA对survivin基因表达和前列腺癌PC3、LNCaP细胞凋亡的影响.方法 应用siRNA设计软件,设计针对survivin基因的2个siRNA序列,体外转录合成;PC3、LNCaP细胞培养,通过脂质体将siRNA转入PC3、LNCaP细胞;MTT法检测细胞增殖的抑制率(IR);流式细胞术检测细胞的凋亡;半定量RT-PCR检测survivin mRNA表达水平;Western Blotting检测survivin蛋白表达强度.结果 转染后siRNA 2组的PC3细胞增殖的抑制率(IR)分别为43.84％、54.31％;凋亡指数(AI)分别为22.3％、30.34％;显著高于正常对照组PC3细胞增殖的IR(2.40％)和AI(3.81％);LNCaP细胞增殖的IR分别为41.78％、53.31％;AI分别为18.33％、28.44％;显著高于正常对照组LNCaP细胞增殖的IR(1.97％)和AI(3.43％).结论 siRNA可抑制PC3、LNCaP细胞survivin的表达,诱导细胞凋亡,为前列腺癌尤其是激素非依赖前列腺癌治疗提供试验依据.     

靶向TRPV6的siRNA对前列腺癌LNCaP细胞抑制作用的体外研究

目的:运用RNA干扰(RNAi)技术阻断前列腺癌LNCaP细胞中瞬时感受器电位离子通道蛋白V亚家族6(TRPV6)基因的表达,探讨TRPV6基因沉默对LNCaP细胞增殖、细胞周期及凋亡的影响。方法:针对TR-PV6基因,构建2条小干扰RNA(siRNA)序列;在脂质体介导下转染前列腺癌LNCaP细胞,用RT-PCR测定TRPV6mRNA的表达;MTT法和流式细胞技术测定siRNA对LNCaP细胞增殖、细胞周期及凋亡的影响。结果:两条siRNA序列均能有效地阻断LNCaP细胞中TRPV6基因在mRNA水平上的表达(P<0.01),且mRNA表达随着转染时间的延长而减少,转染72h后TRPV6mRNA的表达减少至对照组的27%和23%;siRNA转染能显著抑制LNCaP细胞增殖,转染48h细胞增殖抑制率最高,分别为34.53%和29.32%,与转染24h和72h比较有统计学意义(P<0.05);转染48h后,siRNA转染组G0～G1期细胞增多,S期细胞数量明显减少,与空白对照组及阴性对照组相比有统计学差异(P<0.01);siRNA转染组细胞的凋亡率分别为14.45%和12.73%,显著高于空白对照组及阴性对照组3.78%和5.22%(P<0.05)。结论:针对TRPV6的siRNA在体外能有效地抑制LNCaP细胞TRPV6mRNA的转录,同时能够抑制前列腺癌LNCaP细胞增殖,使细胞周期出现G0/G1期阻滞,细胞凋亡率显著增加。     

Apogossypolone诱导前列腺癌PC-3细胞自噬的机制

目的:研究ApoG2对前列腺癌PC-3细胞在体外的作用机制.方法;采用AO染色、TUNEL染色、半定量RT-PCR、Western blot、Caspase-3,-8活性测定等方法研究ApoG2对PC-3细胞的自噬与凋亡的诱导作用.结果:ApoG2可明显抑制PC-3细胞增殖；诱导细胞自噬,加入自噬抑制剂3-MA可增强其诱导凋亡作用；ApoG2作用后,PC-5细胞中Bcl-2 mRNA表达水平降低；Bak mRNA表达水平升高；caspase-3、caspase -8的活性升高.结论:ApoG2诱导PC-3细胞发生自噬,其作用机制可能与Bcl-2下调、Bak上调有关.     

人抑癌基因PTEN对前列腺癌细胞系生物学行为的影响

目的　探讨外源性人抑癌基因PTEN表达对前列腺癌细胞系LNCaP、DU 14 5细胞增殖和侵袭转移能力的影响。　方法　利用携带人PTEN基因的可调控性腺病毒 (Ad PTEN ) ,体外转染人前列腺癌细胞系LNCaP、DU 14 5,RT PCR、Westernblot检测目的基因不同水平的表达 ,通过细胞生长试验、流式细胞仪分析技术以及Boyden小室法检测LNCaP、DU 14 5转染前后细胞增殖、细胞周期、细胞凋亡和细胞体外侵袭力的变化。　结果　转染Ad PTEN后LNCaP、DU 14 5细胞的PTEN表达由阴性转为阳性 ,转染后对LNCaP、DU 14 5细胞生长有抑制作用 ,阻滞于G0 ～G1期 ,早期细胞凋亡率增加 ,LNCaP细胞 (6.89± 0 .51) % ;DU14 5细胞 (5.44± 1.13 ) % ,与对照组相比差异有显著性 ,Boyden小室法检测转染后体外侵袭力受到明显抑制。 　结论　重组腺病毒介导的人PTEN基因在体外对前列腺癌细胞系LNCaP、DU 14 5的细胞增殖和体外侵袭力有明显抑制作用 ,可望作为前列腺癌基因治疗的有效工具     

靶向沉默核干因子对前列腺癌PC-3细胞增殖能力的影响

目的:检测前列腺癌PC-3、LNCaP及DU145细胞中核干因子(Nucleostemin,NS)基因的表达,研究NS基因沉默后对PC-3细胞增殖能力的影响。方法:采用免疫细胞化学法及逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)分别检测NS蛋白及mRNA在3种前列腺癌细胞中的表达。用NS特异性小发夹RNA表达质粒转染PC-3细胞,分别用RT-PCR及Western印迹方法检测转染后细胞(简称NS-shRNA-PC-3)中NSmRNA及蛋白的变化。比较NS基因沉默前后PC-3细胞体外、裸鼠体内增殖能力及凋亡情况的变化。结果:3种细胞中均显示NS基因高表达。转染后NS-shRNA-PC-3细胞中NS表达显著降低,细胞增殖速度减慢,G0/G1期细胞百分率显著升高,早期凋亡细胞增多。体内致瘤实验显示,NS基因沉默后,PC-3细胞在裸鼠体内增殖能力显著降低。结论:NS在前列腺癌细胞系中呈高表达,RNA干扰沉默NS基因后PC-3细胞增殖能力显著降低,凋亡细胞增多。     

左旋棉酚对前列腺癌PC-3细胞增殖的体内外抑制作用

本文研究左旋棉酚在体内外对前列腺癌PC－3细胞的抗增殖活性,并阐明其可能的分子机制。使用MTT法测定了细胞的生长与活性,用TUNEL与透射电镜检测了细胞的凋亡,用免疫组织化学技术检测了肿瘤组织中PCNA、Bcl－2、CD31、caspase-3与caspase-8的表达。结果表明左旋棉酚的IC。值为4．74mgmL-1。在体内实验中,给予荷瘤裸鼠左旋棉酚（〉5mgkg-1）,每日一次,共7天,结果发现左旋棉酚以剂量依赖方式显著抑制肿瘤生长,免疫组化分析发现左旋棉酚增强caspase－3与caspase－8的表达,降低PCNA、Bcl－2、与CD31的表达。结果提示左旋棉酚可以通过诱导前列腺癌细胞凋亡和抑制血管生成而起到抗肿瘤作用。     

异甘草素和Flutamide联合应用对人前列腺癌细胞体外增殖的抑制作用

目的观察异甘草素(ISL)和Flutamide联合应用对人前列腺癌细胞体外增殖的抑制作用。方法采用MTT法测定细胞增殖,流式细胞仪检测细胞凋亡,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)分析Bcl-2表达。结果ISL和不同浓度Flutamide联合用药比单独应用Flutamide对前列腺癌PC-3细胞增殖抑制作用明显增强(P<0.01),同时显著下调Bcl-2基因表达,增加癌细胞凋亡。结论ISL和Flutamide联合应用对前列腺癌PC-3细胞增殖抑制作用明显增强,其机制可能与下调Bcl-2基因表达及增加癌细胞凋亡有关。     

下调PAR基因表达对前列腺癌PC3细胞凋亡及凋亡相关蛋白Bcl-2/Bax的影响

目的:本研究以RNA干扰技术下调PAR(prostate androgen regulated)基因表达,探讨其对前列腺癌PC3细胞增殖、凋亡及其相关蛋白Bcl-2/Bax表达水平的影响。方法:PC3细胞转染靶向PAR基因的siRNA,MTT法检测细胞增殖,用流式细胞术检测细胞凋亡,Western印迹检测Bcl-2和Bax蛋白表达水平。结果:PC3细胞PAR基因表达水平下调,此时处于G2-M期的细胞增加,为(29.95±3.25)%;细胞凋亡率亦明显增加,为(20.61±2.73)%,与对照组比较差异有显著性意义(P<0.01),同时Bcl-2蛋白表达下降,Bax表达水平升高,Bax/Bcl-2比值升高。结论:PAR基因表达下调可诱导细胞G2-M期阻滞和凋亡,其机制为抑制凋亡相关蛋白Bcl-2表达,同时促进Bax表达。     

去雄激素协同辐射诱导前列腺癌细胞凋亡及凋亡通路基因的表达

目的 研究辐射和去雄激素对前列腺癌细胞凋亡通路基因表达的影响，探讨其协同诱导凋亡的机制。方法 辐射与去雄激素作用前列腺癌细胞LNCaP，MTT实验和凋亡细胞染色分别评价细胞毒性和诱导凋亡作用。收集细胞提取总RNA并合成cDNA探针，在凋亡通路特异基因cDNA膜上进行杂交反应检测基因mRNA表达，并以RT-PCR确认有关基因mRNA表达。结果 辐射与去雄激素可协同诱导前列腺癌细胞凋亡。辐射使DFFA、LTbR、mdm2、Myd88、TNFRSF8Ⅱ、TNFRSF14和TNFSF4基因mRNA表达上调，使Survivin和Bar基因mRNA表达下调。去雄激素使Mcl-1、TNFRSF14、MyD88和TNFSF4基因mRNA表达上调，使Bar、Survivin和TRAIL—R3基因mRNA表达下调。结论 去雄激素和辐射对前列腺癌细胞凋亡通路基因的表达改变不同，这与两者协同诱导凋亡作用有关。     

细胞内胆固醇代谢在前列腺癌神经内分泌转化中的变化及意义

目的:建立前列腺癌雄激素非依赖进展过程中的神经内分泌转化(NED)体外细胞模型,分析前列腺癌NE细胞转化时细胞内胆固醇代谢及其调控可能的变化及意义。方法:去雄激素诱导建立前列腺癌LNCaP细胞NE模型,通过细胞形态学观察、蛋白印迹检测多种NE标记物(SgⅢ、NSE、CgA)表达、体外细胞增殖实验检测NE的发生;利用免疫荧光染色检测细胞内胆固醇和SgⅢ的表达及分布;利用半定量RT-PCR检测多种参与胆固醇合成、摄取相关蛋白基因(LDL-R、SREBP-1、SREBP-2)的表达。结果:去除雄激素后体外培养,LNCaP细胞胞体缩小,轴突增长,呈NE样改变;SgⅢ、NSE、CgA等多种NE标记物表达上调,并随着时间延长逐渐增多;同时细胞增殖能力显著降低(P<0.05)。NE转化后的LNCaP细胞内胆固醇分布呈现明显的轴突末端聚集趋势,但表达量并无显著改变,相应的细胞内参与胆固醇合成、摄取相关蛋白基因的表达也无显著性差异(P>0.05)。结论:短期去雄激素体外培养可成功诱导雄激素依赖的前列腺癌LNCaP细胞发生NED,NED后的细胞内胆固醇分布发生显著的轴突末端聚集趋势,以增强细胞内多种神经内分泌颗粒的形成。     

弓形虫ROP16蛋白诱导肝癌细胞凋亡的检测

目的观察弓形虫ROP16蛋白转染肝癌细胞Hep G2后,肝癌细胞的凋亡比率的变化以及细胞凋亡蛋白的表达水平变化。方法克隆弓形虫ROP16基因,构建真核转染质粒,并用脂质体转染的方式转染Hep G2细胞,48小时后,用流式细胞仪检测细胞凋亡比率,用western blotting和RT-PCR的方法检测细胞凋亡相关蛋白caspase-9、Bax、Bcl-2等的表达水平。结果与未转染细胞组相比,弓形虫ROP16转染Hep G2细胞后,肝癌细胞的凋亡比率明显升高。促细胞凋亡蛋白caspase-9、Bax的蛋白表达水平和基因转录水平均升高,而抑制细胞凋亡蛋白Bcl-2的表达水平和转录水平下降。结论 ROP16蛋白可以诱导肝癌细胞Hep G2发生凋亡。     

缺氧诱导因子1α诱导人前列腺癌细胞上皮间质化改变的研究

目的:研究人前列腺癌细胞在缺氧诱导因子1α(HIF-1α)诱导下能否发生上皮细胞间质转化态(EMT)改变,进而致侵袭能力增强,并初步分析其分子机制。方法:应用RT-PCR技术检测LNCaP细胞及其亚细胞系C4、C4-2、C4-2B这4种EMT阴性的人前列腺癌细胞中波形蛋白(vimentin)mRNA表达情况,并凭此筛选出适合于进一步作转染诱导试验的细胞。用脂质体Lipofectamine2000包装重组真核表达载体pCDNA3.1(-)/HIF-1α和pCD-NA3.1(-)空质粒后,分别转染上步试验所挑选出的人前列腺癌细胞LNCaP,600μg/mLG418筛选抗性克隆。免疫荧光及Western印迹法鉴定HIF-1α表达,Western印迹法检测EMT标志蛋白——上皮型钙粘素(E-cadherin)和vimentin的表达,Transwell验证转染后LNCaP细胞侵袭能力的改变。结果:RT-PCR证实4种EMT阴性的细胞中,仅LNCaP表达有vimentin编码基因,适合作转染诱导试验。免疫荧光也观察到HIF-1α转染细胞胞质中荧光亮度较空质粒转染细胞和未转染细胞明显增强。Western印迹法证实HIF-1α转染细胞发生了EMT转化,其E-cad-herin表达缺失,而vimentin表达增加。同时,Transwell体外侵袭试验也发现,LNCaP/HIF1α细胞的体外侵袭能力显著高于LNCaP细胞和LNCaP/pCDNA3.1(-)细胞。结论:HIF-1α过表达可以通过调节两种EMT相关蛋白诱导人前列腺癌细胞LNCaP发生EMT改变并致其侵袭能力增强。     

Bcl-2和Bax在前列腺癌不同周期时相的表达

目的 探讨凋亡相关基因Bel-2和Bax在前列腺癌不同周期时相的差异表达及意义.方法 应用改良的胸腺嘧啶核苷和高压笑气双阻断法把前列腺癌细胞系PC-3同步在不同的周期时相,应用流式细胞术检测同步化的效率.进而应用RT-PCR及Western blot方法检测不同周期时相Bcl-2和Bax在mRNA和蛋白水平的表达.结果 前列腺癌细胞系PC-3的M、G1、S和G2期细胞同步化效率分别为92.1%、87.0%、80.2%和75.9%;Bcl-2在不同周期时相均有表达且存在差异,G1期表达水平最高,S、M和G2期表达水平显著降低,mRNA和蛋白水平表达具有一致性;Bax在各周期的mRNA水平及蛋自水平表达没有明显差别.结论 细胞周期对凋亡相关基因Bel-2的表达有显著影响,对Bax无影响,对于采用Bcl-2途径治疗前列腺癌具有指导意义.     

姜黄素抑制肾癌ACHN细胞增殖及促凋亡的实验研究

目的观察姜黄素对人肾癌ACHN细胞株增殖及细胞凋亡的影响,探讨姜黄素诱导ACHN细胞株凋亡的作用机制。方法不同浓度姜黄素作用人肾癌ACHN细胞24 h后,应用MTT比色法检测姜黄素对人肾癌ACHN细胞的增殖抑制率;流式细胞术检测姜黄素诱导细胞的凋亡率;RT-PCR检测姜黄素对ACHN细胞Bcl-2、Bax、NF-κBP65 mRNA表达的影响;Western blot方法检测其对细胞Bcl-2、Bax、NF-κBP65I、κB蛋白表达的影响。结果姜黄素对人肾癌ACHN细胞有明显的抑制作用,可引起细胞凋亡,并且存在剂量和时间依赖;不同浓度姜黄素作用细胞24 h后,Bcl-2、NF-κBP65 mRNA水平下降,Bax mRNA水平升高(P0.05),Bcl-2、NF-κBP65蛋白表达量下降,BaxI、κB蛋白表达量升高(P0.05)。结论姜黄素通过上调IκB,下调NF-κB活性,调控凋亡基因Bcl-2/Bax的表达,抑制人肾癌ACHN细胞的增殖,诱导人肾癌ACHN细胞的凋亡。     

矢车菊素-3-葡萄糖苷诱导人胃癌细胞株SGC7901凋亡及其机制

目的 观察矢车菊素-3-葡萄糖苷(C3G)在体外诱导人胃癌SGC7901细胞凋亡的生物学效应,并初步探讨其分子机制.方法 分别采用不同浓度梯度的C3G处理SGC7901胃癌细胞,MTT比色法检测细胞生长率;激光共聚焦显微镜观察细胞形态改变;TUNEL法分析细胞凋亡率;Western blot法检测凋亡相关基因Bcl-2、Bax、Caspase-3、ICAD蛋白表达的情况.结果 C3G在体外能明显抑制人胃癌SGC7901细胞的生长增殖,且呈浓度、时间依赖性(P＜0.01).激光共聚焦显微镜下可见Hoechst33258荧光染色细胞呈凋亡特征性改变;TUNEL法检测实验组细胞凋亡率均明显高于阴性对照组(P＜0.01);C3G可下调Bcl-2蛋白表达,上调Bax蛋白表达,降低Bcl-2/Bax蛋白的比值,促使Caspase-3酶原蛋白活化,下调ICAD蛋白表达(P＜0.01).结论 C3G具有在体外抑制胃癌细胞增殖的作用,并能诱导其凋亡,其机制可能与Bcl-2/Bax降低导致Caspase-3活化、ICAD蛋白表达下降相关.     

IL-6影响骨髓基质细胞凋亡机理的初步探讨

目的通过观察IL-6对体外培养骨髓基质细胞凋亡的影响，探讨骨髓基质细胞凋亡的机理。方法取1月龄SD大鼠的骨髓基质细胞进行体外培养，通过透射电子显微镜观察、bax、bcl-2蛋白免疫组化染色、流式细胞仪检测凋亡细胞周期变化及线粒体跨膜电位改变、RT—PCR法检测凋亡细胞bax、bcl-2 mRNA表达等指标进行观察。结果IL-6组细胞G1期、凋亡率和线粒体膜电位改变均非常显著高于对照组；随着诱导时间的延长，Bcl-2 mRNA表达呈逐渐下降趋势，BaxmRNA表达呈逐渐升高趋势。Bcl-2／Bax：随着诱导时间的延长呈下降趋势。结论IL-6使大量细胞停留在G1期，阻滞细胞进入S期，使DNA合成受阻；IL-6促进凋亡的作用是通过1促进bax从胞浆中移至线粒体膜上而使bax在与bcl-2形成的异二聚体中占据优势来促进线粒体上的PT孔道开放，使内膜离子通道改变，线粒体内膜电位下降或丧失，导致Cyto c等蛋白的释放来调节细胞凋亡。     

前列腺癌细胞凋亡通路基因表达与凋亡反应性的关系

目的　探讨凋亡通路基因表达改变与前列腺癌细胞凋亡反应性的关系。　方法　凋亡诱导剂鬼臼乙叉甙分别作用前列腺癌激素敏感与不敏感细胞LNCaP和PC 3,Hoechst 332 5 8染色检测凋亡发生率。收集LNCaP和PC 3细胞后提取总RNA ,合成cDNA探针并以生物素标记 ,在凋亡通路特异基因寡核苷酸片段cDNA膜上进行杂交反应 ,检测基因mRNA表达。　结果　鬼臼乙叉甙能诱导两种细胞凋亡 ,但PC 3细胞的凋亡反应性小于LNCaP细胞。与LNCaP细胞比较 ,PC 3细胞显著下调的基因为Bcl1 0、CIDE A、GADD4 5a和RIP2 ,以及Caspase 4、5和 6 ,显著上调的基因为TRAF4。两种细胞均强烈表达Caspase 1 4和TNFR2。　结论　凋亡通路基因表达改变与前列腺癌细胞凋亡反应性不同有关 ,在前列腺癌激素敏感性转化中可能有重要作用     

前列腺雄激素调节基因:一个新的雄激素非依赖性前列腺癌治疗的潜在靶点(英文)

目的:初步研究前列腺雄激素调节基因(PAR)与雄激素—雄激素受体信号转导通路的关系及其在前列腺癌细胞恶性转化过程中的作用,探讨通过抑制 PAR 基因治疗雄激素非依赖性前列腺癌的可能性。方法:用 RT-PCR 检测 LNCaP、PC3细胞中 PAR 基因 mRNA 表达水平的差异。分别用 RT-PCR 检测双氢睾酮对LNCaP、PC3及稳定转染了 pcDNA3-AR 的 PC3细胞株 PC3-AR 的 PAR 基因 mRNA 表达的调节作用,并观察这一调节作用是否可被雄激素受体拮抗剂氟他胺阻断。进一步用 RNA 干扰技术下调 PC3细胞 PAR 的表达,用细胞计数、软琼脂克隆形成实验、流式细胞术研究 PAR 基囚表达下调对 PC3细胞生长的抑制作用。结果:PC3细胞 PAR 基因 mRNA 的表达是 LNCaP 细胞的3倍;双氢睾酮可调节 LNCaP 和 PC3-AR 细胞株PAR 基因 mRNA 表达水平,此种对 PAR 表达的调节作用可被氟他胺阻断:双氢睾酮对 PC3细胞 PAR 基因mRNA 表达无明显影响。RNA 干扰可抑制 PC3细胞 PAR 基因表达,使细胞增殖受抑制,细胞周期阻滞于G_2-M 期,凋亡增加。结论:PAR 可能是雄激素—雄激素受体信号转导通路下游的与雄激素非依赖性前列腺癌恶性表型密切相关的癌基因,有望成为其基冈和药物治疗的靶点。     

RNA干扰技术沉默STAT3对人前列腺癌细胞生长的抑制作用

目的: 探讨RNA干扰技术沉默STAT3基因表达对人前列腺癌细胞PC3及LNCaP的生长抑制作用。　方法: 针对STAT3mRNA序列设计合成 3对编码小干扰RNA(siRNA)的DNA模板,构建pSilencer1. 0 U6 siRNA STAT3重组质粒,转染PC3及LNCaP细胞;采用Western印迹、Northern印迹等技术观察重组质粒对STAT3基因表达的影响;用MTT法观察重组质粒对PC3及LNCaP细胞体外生长抑制作用;用流式细胞术(FCM)及吖啶橙染色检测重组质粒诱导细胞凋亡。　结果: 成功构建pSilencer1. 0 U6 siRNA STAT3重组质粒,并成功转染PC3及LNCaP细胞;Western印迹,Northern印迹结果证实重组质粒在mRNA及蛋白水平分别显著抑制STAT3基因表达,抑制率为60% ~75%;MTT及FCM结果证明上述重组质粒可显著抑制PC3及LNCaP细胞的体外生长并诱导PC3细胞凋亡。结论: pSilencer1. 0 U6 siRNA STAT3可抑制STAT3在人前列腺癌细胞中的表达,并抑制肿瘤细胞的生长,促进其凋亡。     

选择性COX-2抑制剂NS398对前列腺癌PC-3细胞增殖与凋亡的影响

目的观察环氧化酶-2(COX-2)抑制剂NS398对前列腺癌细胞PC-3增殖和凋亡的影响。方法采用四甲基偶氮唑蓝法(MTT法)检测不同浓度和不同时间NS398对PC-3细胞增殖的影响;RT-PCR法检测不同浓度NS398作用PC-3细胞24h后COX-2 mRNA的表达;酶联免疫测定法(ELISA)检测不同浓度NS398作用PC-3细胞24h后PGE2释放水平;流式细胞仪检测不同浓度NS398作用PC-3细胞24h后细胞凋亡情况。结果NS398可以抑制PC-3细胞的增殖,呈时间和剂量依赖性;RT-PCR和ELISA法检测结果显示,随着NS398浓度增高,PC-3细胞COX-2 mRNA表达和PGE2释放水平呈下调趋势;细胞凋亡检测结果显示100、200μmol/LNS398对PC-3细胞具有诱导凋亡的作用。结论NS398可能通过COX-2依赖性途径抑制前列腺癌PC-3细胞增殖,促进肿瘤细胞凋亡。