益肾通络方对膜性肾病大鼠的肾保护作用及足细胞骨架相关蛋白的影响

目的探讨益肾通络方对膜性肾病大鼠的肾脏保护作用及可能的机制。方法健康雄性SD大鼠60只随机分为对照组10只和造模组50只,造模组采用尾iv阳离子化牛血清白蛋白(C-BSA)的方法复制膜性肾病大鼠模型。造模成功后再随机分为模型组、盐酸贝那普利组和益肾通络方低、中、高剂量(6.61、13.22、26.44 g/kg)组,各组按照相应剂量ig给药,每天1次,连续给药4周。给药结束后检测大鼠24 h尿蛋白定量(UTP)、血清总胆固醇(TC)、总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、尿素氮(BUN)、肌酐(Scr)水平;免疫荧光检测各组大鼠肾组织Ig G免疫复合物沉积情况,电镜下观察肾小球基底膜及足细胞形态结构;免疫组化及实时荧光定量PCR(q RT-PCR)法检测各组大鼠肾足细胞骨架相关蛋白ezrin、synaptopodin的表达。结果与模型组比较,各治疗组大鼠UTP、TC水平均显著下降(P0.01),TP、ALB水平均显著上升(P0.01);益肾通络方中、高剂量组与盐酸贝那普利组疗效相当,效果优于益肾通络方低剂量组;各组大鼠BUN、Scr相比无明显差异。与对照组比较,模型组大鼠肾足细胞骨架相关蛋白ezrin、synaptopodin m RNA表达显著减少(P0.01);与模型组比较,各治疗组大鼠肾足细胞相关蛋白ezrin、synaptopodin m RNA表达均有不同程度增加(P0.01);益肾通络方中、高剂量组大鼠肾组织ezrin、synaptopodin m RNA表达量与盐酸贝那普利组相当,均高于益肾通络方低剂量组。结论益肾通络方对膜性肾病大鼠具有治疗作用,其机制可能与防止足细胞骨架相关蛋白ezrin、synaptopodin降解、维持足细胞骨架及足突结构完整性相关。     

护心通络方对高脂血症大鼠内皮细胞凋亡及Bax、Bcl-2蛋白表达的影响

目的:观察护心通络方对高脂血症大鼠内皮细胞凋亡及Bax、Bcl-2蛋白表达的影响。方法:采用高脂饲料喂养建立高脂血症病理模型;50只高脂血症模型大鼠随机分为模型对照组、护心通络方低剂量组、护心通络方中剂量组、护心通络方高剂量组和辛伐他汀组,每组10只。采用Western blot测定凋亡蛋白Bcl-2/Bax表达,同时利用透射电镜观察细胞凋亡、细胞结构的特征性变化。结果:随着护心通络方药物浓度的增加,凋亡抑制蛋白Bcl-2表达水平呈现上升趋势,而促凋亡蛋白Bax呈现下降趋势(P0.05);电镜下内皮细胞凋亡小体数目不断减少,核固缩逐渐减弱,细胞间隙减少,线粒体数目上升。结论:护心通络方能通过调整Bax和Bcl-2的蛋白表达强度降低大鼠内皮细胞凋亡率。     

姜黄素对小鼠肾足细胞系(MPC5)自噬作用的影响

目的:通过研究姜黄素(curcumin)对小鼠肾足细胞系(MPC5)自噬作用的影响,探讨姜黄素对糖尿病肾病足细胞保护作用的可能机制。方法:将足细胞分为6组:正常对照组(5.5 mmol/L)、高糖组(30 mmol/L)、姜黄素低、中、高浓度组(1μmol/L、5μmol/L、10μmol/L)、雷帕霉素组(10 nmol/L)。Western blot分别检测LC3B、Beclin-1、Synaptopodin及Nephrin蛋白表达。将足细胞分为6组:正常对照组(5.5 mmol/L)、高糖组(30 mmol/L)、姜黄素低、中、高浓度组(1μmol/L、5μmol/L、10μmol/L)、LY294002组(10μmol/L)。Western blot检测PI3K/Akt/mTOR信号通路中p-mTOR、p-Akt蛋白表达水平。结果:高糖组自噬相关蛋白LC3II/I比值及Beclin-1蛋白表达明显低于正常对照组(P0.05);姜黄素组LC3B、Beclin-1等自噬标志性蛋白表达均高于高糖组(P0.05);姜黄素组足细胞功能性标志蛋白表达水平明显高于高糖组(P0.05);姜黄素组p-mTOR、p-Akt蛋白表达水平均低于高糖组(P0.05)。结论:姜黄素能明显改善高糖刺激对小鼠肾足细胞的自噬抑制作用,并且通过抑制P13K/Akt/mTOR信号途径减轻足细胞损伤。     

保肾通络方对高糖培养下肾小球系膜细胞外基质增生及外泌体miR-192表达的影响

目的观察保肾通络方对高糖培养下肾小球系膜细胞外基质增生及外泌体miR-192表达的影响,探讨其防治糖尿病肾病(DN)的作用机制。方法将20只SD大鼠随机分为正常对照组、保肾通络方低剂量组、保肾通络方中剂量组及保肾通络方高剂量组,每组5只。保肾通络方低、中、高剂量组大鼠分别予浓度为0.5、1.0、2.0 g/mL的保肾通络方颗粒剂药液灌胃,正常对照组大鼠予等容积蒸馏水灌胃。各组大鼠均连续灌胃7 d,通过腹主动脉取血并分离出含药血清。将永生化小鼠肾小球系膜细胞分为正常对照组、高糖对照组、保肾通络方低剂量组、保肾通络方中剂量组及保肾通络方高剂量组。正常对照组肾小球系膜细胞予DMEM低糖培养基+正常对照组大鼠血清培养,高糖对照组肾小球系膜细胞予含30 mmol/L葡萄糖的高糖培养基+正常对照组大鼠血清培养,保肾通络方低、中、高剂量组肾小球系膜细胞分别予高糖培养基+10%的保肾通络方低、中、高剂量含药血清培养。培养24 h后,采用CCK-8法检测各组细胞增殖活性情况,免疫荧光法检测细胞外基质蛋白胶原蛋白Ⅳ(CollagenⅣ)及纤维连接蛋白(FN)表达情况,实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)法检测CollagenⅣ、FN及外泌体miR-192的mRNA表达情况。结果高糖对照组培养后肾小球系膜细胞增殖活性与正常对照组比较明显升高(P 0.05),保肾通络方低、中、高剂量组培养后肾小球系膜细胞增殖活性与高糖对照组比较明显降低(P 0.05),但保肾通络低、中、高剂量组细胞增殖活性组间比较差异均无统计学意义(P0.05)。高糖对照组培养后CollagenⅣ及FN灰度值与正常对照组比较均升高(P 0.05),保肾通络方低、中、高剂量组培养后CollagenⅣ及FN灰度值与高糖对照组比较均降低(P 0.05),但保肾通络方低、中、高剂量组CollagenⅣ及FN灰度值组间比较差异均无统计学意义(P0.05)。高糖对照组培养后CollagenⅣ、FN及外泌体miR-192的mRNA表达与正常对照组相比均明显上调(P 0.05),保肾通络方低、中、高剂量组培养后CollagenⅣ、FN及外泌体miR-192的mRNA表达与高糖对照组比较均明显下调(P 0.05),但保肾通络方各剂量组CollagenⅣ、FN及外泌体miR-192的mRNA表达组间比较差异均无统计学意义(P0.05)。结论保肾通络方可以降低DN肾小球系膜细胞增殖活性,抑制细胞外基质增生,减少CollagenⅣ及FN蛋白的表达,并能够下调CollagenⅣ、FN及外泌体miR-192的mRNA表达,从多途径对DN进行干预治疗。     

益气化瘀方对子宫复旧不全大鼠子宫内膜细胞凋亡与产后子宫内膜增殖影响研究

目的:通过对比分析益气化瘀方对子宫复旧不全SD级大鼠子宫内膜细胞凋亡及子宫内膜增殖影响的研究,为孕妇产后疾病的治理提供理论依据。方法:选取试验用无特定病原体级实验动物(SPF级动物)SD大鼠为研究对象,按照实验需求,分为5组,除去空白组以外的四组进行子宫内接种大肠杆菌,进行造模,然后给药,观察大鼠子宫内膜细胞凋亡率、大鼠子宫内膜细胞凋亡因子Bcl-2和Bax的表达情况。结果:(1)与模型组对比,新生化颗粒组、益气化瘀方低剂量组和益气化瘀方高剂量组大鼠子宫内膜凋亡率降低,P0.05;与新生化颗粒组比较,益气化瘀方高剂量组大鼠子宫内膜细胞凋亡率无统计学差异,P0.05,益气化瘀方低剂量组大鼠子宫内膜凋亡率升高,P0.05;与空白组比较,模型组大鼠子宫内膜凋亡率显著升高,P0.05。(2)与模型组对比,新生化颗粒组、益气化瘀方低剂量组和益气化瘀方高剂量组Bcl-2蛋白表达增加,Bax表达减少,P0.05;与新生化颗粒组比较,益气化瘀方高剂量组Bcl-2蛋白表达和Bax表达无统计学差异,P0.05,益气化瘀方低剂量组Bcl-2蛋白表达减少,Bax表达增加,P0.05;与空白组比较,模型组Bcl-2蛋白表达明显下降,Bax表达增加,P0.05。结论:益气化瘀方能通过调节使Bax蛋白表降低,使Bcl-2蛋白表达增加,从而降低子宫内膜细胞凋亡率,促进产后子宫增殖恢复。     

活血解毒方对糖尿病视网膜病变细胞凋亡及相关细胞因子的影响

目的观察中药复方活血解毒方(HXJD)对糖尿病大鼠视网膜细胞凋亡及凋亡相关因子NF-κB和Caspase-3 mRNA和蛋白表达的影响。方法采用链脲佐菌素(65 mg/kg)一次性腹腔注射的方法,建立糖尿病大鼠模型,将50只SD大鼠随机分为模型组和HXJD高剂量组(15.4 g/kg)、中剂量组(7.70 g/kg)、低剂量组(3.85 g/kg)及导升明组(0.167 g/kg),每组10只,另设10只正常对照组。造模成功后,灌胃给药,20周后处死动物。应用TUNEL法检测细胞凋亡程度,免疫组化和蛋白印迹技术检测视网膜全层中NF-κB和Caspase-3的表达;采用Real-time PCR法检测视网膜NF-κB和Caspase-3 mRNA的表达。同时,体外培养大鼠视网膜神经节细胞株(RGC-5),制备HXJD含药血清。利用55.5 mmol/L葡萄糖浓度模拟高糖环境诱导,将细胞分为5组:空白组、高糖组、含药血清低剂量组、含药血清中剂量组、含药血清高剂量组。采用CCK-8和AnnexinⅤ-FITC法检测不同血清干预高糖诱导下RGC细胞24 h增殖活性及细胞凋亡的影响。结果与正常对照组比较,模型组凋亡细胞增加,大鼠视网膜组织NF-κB和Caspase-3蛋白及mRNA的表达明显升高(P0.05);与模型组比较,活血解毒方各剂量组和导升明组视网膜细胞凋亡的程度、视网膜NF-κB和Caspase-3蛋白和mRNA的表达量均降低(P0.05)。与空白组比较,高糖组细胞活性降低,细胞凋亡比例增加(P0.05)。与高糖组比较,含药血清高、中剂量组细胞活性增高(P0.05),含药血清各剂量组细胞凋亡比例减少(P0.05,P0.01)。结论活血解毒方可能通过改善糖尿病大鼠视网膜中细胞凋亡的相关细胞因子NF-κB和Caspase-3的表达,同时调节视网膜神经节细胞活力,改善高糖条件下RGC细胞的凋亡程度。     

通络益肾方对高糖诱导肾小球系膜细胞GRP78 mRNA及JNK mRNA表达的影响

目的探讨通络益肾方治疗糖尿病肾病的可能作用机制。方法 35只SD大鼠随机分为空白组、西药组及中药大、中、小剂量组,每组7只。中药大、中、小剂量组小鼠每日分别给予6.20、3.10、1.55 g/ml的通络益肾方2 ml灌胃;西药组小鼠每日灌胃洛汀新(0.09 mg/ml)、糖适平(0.27 mg/ml)混合液2ml。每日1次,连续给药10天。于末次灌胃2 h后制备含药血清。大鼠肾小球系膜细胞株HBZY-1细胞分正常组、模型组、西药组及中药大、中、小剂量组,同步化24 h后,正常组加5.6 mmol/L低糖+10%的胎牛血清100μl,模型组加30 mmol/L高糖+10%的空白血清100μl,中药大、中、小剂量组加30 mmol/L高糖及10%的中药大、中、小剂量含药血清100μl,西药组加30 mmol/L高糖+10%的西药血清100μl。分别培养12 h、24 h、48 h和72 h后,采用流式细胞术检测系膜细胞凋亡情况,RT-PCR检测各组系膜细胞葡萄糖调节蛋白78(GRP78)、c-Jun氨基末端激酶(JNK)mRNA的表达水平。结果与正常组同时间点比较,模型组系膜细胞在24 h、48 h和72 h凋亡率持续增加(P0.01)。与模型组同时间点比较,各给药组24 h、48 h和72 h时系膜细胞凋亡率均明显下降(P0.01);中药大、中、小剂量组在各时间点系膜细胞凋亡率随着药物剂量升高而降低,呈剂量依赖性(P0.01)。与正常组同时间点比较,模型组GRP78 mRNA在24 h、48 h持续升高,而72 h明显下降,JNK mRNA表达在48、72 h时明显增加(P0.05或P0.01)。与模型组同时间点比较,各给药组系膜细胞GRP78 mRNA、JNK mRNA在48 h、72 h时明显减低,且以中药大剂量组最低(P0.05或P0.01)。结论通络益肾方可抑制肾小球系膜细胞凋亡,其作用机制可能与延缓GRP78 mRNA增幅、下调JNK mRNA表达有关。     

活血通络利水方含药血清在高浓度谷氨酸环境下 对Müller细胞谷氨酸-天冬氨酸转运体、谷氨酰胺合成酶蛋白表达及活性的影响

目的 研究活血通络利水方含药血清在高浓度谷氨酸(GLU)环境下对Müller细胞谷氨酸-天冬氨酸转运体(GLAST)、谷氨酰胺合成酶(GS)蛋白表达及活性的影响。方法 将40只健康SD大鼠按照随机数字表法分为正常组、银杏叶组、活血通络利水方低剂量组和活血通络利水方高剂量组,每组10只。银杏叶组予银杏叶片水溶剂5. 2 mg/kg灌胃,活血通络利水方低剂量组予活血通络利水方合剂20 g/kg灌胃,活血通络利水方高剂量组予活血通络利水方合剂40 g/kg灌胃,正常组予等容积0. 9%氯化钠注射液灌胃,每日1次,连续灌胃7 d后,腹主动脉取血后离心收集血清备用。培养Müller细胞,分别用不同浓度的GLU(0、0. 1、0. 5、1、10、20、25、30 mmol/L)干预24 h,采用噻唑蓝(MTT)法检测Müller细胞存活率。Müller细胞分为正常组、模型组、银杏叶组、活血通络利水方低剂量组和活血通络利水方高剂量组,正常组和模型组每孔加入正常血清0. 5 m L、培养基2 m L,银杏叶组每孔加入银杏叶含药血清0. 5 m L、培养基2 m L,活血通络利水方低、高剂量组每孔分别加入活血通络利水方20、40 g/kg含药血清0. 5 m L、培养基2 m L。除正常组外,其余4组均加入GLU 25 mmol/L。相同条件下培养24 h后提取总蛋白,采用免疫印迹法(Western Blot)检测各组Müller细胞中GLAST、GS蛋白表达水平;用高效液相色谱法(HPLC)检测各组细胞培养液中GLU含量。结果 MTT实验结果显示,GLU干预24 h后,与0 mmol/L浓度GLU比较,10 mmol/L及以下低浓度GLU细胞存活率升高(P 0. 05); 20、25、30 mmol/L浓度GLU细胞存活率逐渐降低(P 0. 05),其中25 mmol/L浓度GLU细胞存活率下降至约0. 67。Western Blot检测结果显示,与正常组比较,模型组GLAST、GS蛋白表达水平均降低(P 0. 05);与模型组比较,银杏叶组和活血通络利水方低、高剂量组GLAST、GS蛋白表达水平均升高(P 0. 05),且活血通络利水方高剂量组的上调高于银杏叶组(P 0. 05),与正常组比较差异无统计学意义(P0. 05)。高效液相色谱(HPLC)检测结果显示,与模型组比较,银杏叶组和活血通络利水方低、高剂量组的胞外GLU含量均降低(P 0. 05);与银杏叶组比较,活血通络利水方低、高剂量组Müller细胞胞外GLU含量比较差异无统计学意义(P0. 05)。结论 在25 mmol/L GLU浓度环境下,活血通络利水方能够上调Müller细胞GLAST、GS蛋白表达和活性,促进细胞摄取胞外GLU,以维持GLU代谢平衡。     

清热消癥方对高糖刺激下HK-2细胞自噬相关蛋白表达的影响

目的 探讨清热消癥方对高糖刺激下HK-2细胞自噬相关蛋白表达的影响。方法以人近端肾小管上皮细胞系HK-2细胞为干预对象,采用CCK-8法检测细胞活力对高糖模型造模条件和清热消癥方最佳干预浓度进行筛选;采用Western blot法对海藻糖干预浓度进行筛选。将HK-2细胞分为对照组、模型组、清热消癥方组、海藻糖组、清热消癥方+海藻糖组,分别予含有24.4 mmol/L甘露醇的完全培养基、30 mmol/L高糖培养基、30 mmol/L高糖+200μg/mL清热消癥方培养基、30 mmol/L高糖+50 mmol/L海藻糖培养基、30 mmol/L高糖+50 mmol/L海藻糖+200μg/mL清热消癥方培养基培养48 h。采用Western blot法和Immunofluorescence法检测HK-2细胞自噬相关蛋白表达情况。结果 与对照组比较,模型组p62蛋白相对表达量和阳性表达平均荧光强度均明显升高(P均<0.05),溶酶体相关膜蛋白1(LAMP1)、B细胞淋巴瘤2(Bcl-2)蛋白相对表达量均明显降低(P均<0.05)。与模型组比较,清热消癥方组自噬相关蛋白7(Atg...     

益精方对不育症大鼠睾丸生精细胞凋亡及Bcl-2、Bax蛋白表达的影响

目的观察益精方对腺嘌呤法不育症大鼠睾丸生精细胞凋亡及Bcl-2/Bax蛋白表达的影响。方法Wistar大鼠75只随机分为空白组,模型组,益精方高、中、低剂量组,每组15只。除空白组外,其余各组均以腺嘌呤连续灌胃10天;从第11天开始,空白组及模型组用等量生理盐水灌胃,益精方高（3.38 g/100 g）、中（1.69 g/100 g）、低剂量（0.85 g/100 g）组分别以益精方各剂量灌胃,每天1次,连续20天。实验结束后将大鼠全部处死,摘取睾丸,采用原位缺口末端标记法（TUNEL）和免疫组化SABC法分别检测各组动物生精细胞的凋亡情况及Bcl-2/Bax蛋白的表达。结果与空白组比较,模型组Bcl-2蛋白表达降低,Bax蛋白表达升高,细胞凋亡数升高,差异均有统计学意义（P〈0.01）。与模型组比较,三个剂量组Bcl-2蛋白表达均升高（P〈0.01,P〈0.05）,高、中剂量组Bax蛋白表达均降低（P〈0.01,P〈0.05）,中剂量组细胞凋亡数降低（P〈0.01）。结论益精方能够通过调控睾丸组织Bcl-2及Bax蛋白的表达,抑制生精细胞的凋亡。     

活血醒脑方对颅脑损伤大鼠模型神经细胞凋亡的影响

目的:探究活血醒脑方对颅脑损伤大鼠模型神经细胞凋亡的影响。方法:选40只6周龄SPF级大鼠体质量200±30g,采用改良的Feeney's自由落体打击装置造重度颅脑损伤大鼠模型,并随机分为4组,空白对照组(control)、模型组(model)、低剂量活血醒脑方组(Low HXXNF)和高剂量活血醒脑方组(High HXXNF);使用TUNEL法原位检测损伤区神经细胞的凋亡情况;使用Western blot检测大鼠颅脑组织Bcl-2、Bax、Caspase-3、Caspase-9蛋白表达量;使用流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果:相比空白对照组,模型组大鼠神经细胞的凋亡数目、凋亡细胞指数(ACI)、Caspase-3、Caspase-9和Bcl-2蛋白表达量显著增加,Bax蛋白表达量显著降低,且差异有统计学意义(P0.05);相比模型组,活血醒脑方组大鼠神经细胞的凋亡数目、凋亡细胞指数、Caspase-3、Caspase-9和Bcl-2蛋白表达量显著降低,且高剂量活血醒脑方组上述指标显著低于低剂量活血醒脑方组,差异有统计学意义(P0.05),Bax蛋白表达量显著升高,且高剂量活血醒脑方组Bax蛋白表达量显著高于低剂量活血醒脑方组,差异有统计学意义(P0.05)。结论:活血醒脑方可以通过调节细胞凋亡因子抑制颅脑损伤大鼠模型神经细胞凋亡,且在一定浓度范围内呈浓度依赖性。     

糖痹康对高糖培养雪旺细胞自噬相关蛋白的影响

目的:研究发现细胞自噬是糖尿病周围神经病变(diabetic peripheral neuropathy,DPN)的重要发病机制之一,本研究探讨治疗DPN的中药复方糖痹康(Tangbikang,TBK)对高糖环境下大鼠雪旺细胞(rat Schwann cells,RSC)自噬相关蛋白的影响。方法:利用SD大鼠制备TBK含药血清,并采用50 mmol·L~(-1)的葡糖糖(Glu)RSC细胞培养基制备高糖RSC细胞模型。实验总共分为6组:正常组(Con,20%正常大鼠血清),高糖组(Glu,50 mmol·L~(-1)Glu+20%正常大鼠血清);弥可保组(MKB,50 mmol·L~(-1)Glu+20%弥可保含药血清);TBK高剂量组(TBKH,50 mmol·L~(-1)Glu+20%TBK含药血清);TBK中剂量组(TBKM,50 mmol·L~(-1)Glu+10%TBK含药血清+10%正常大鼠血清);TBK低剂量组(TBKL,50 mmol·L~(-1)Glu+2.5%TBK含药血清+17.5%正常大鼠血清)。干预48 h后,采用细胞增殖实验细胞增殖与活性检测(CCK-8)法检测RSC细胞增殖活性,流式细胞术检测细胞凋亡率,蛋白免疫印迹法(Western blot)检测自噬蛋白(Beclin 1)和微管相关蛋白1轻链3Ⅱ(LC3Ⅱ)的表达水平。结果:与Con组比较,高糖因素使得Glu组RSC增殖活性显著降低(P0.01),细胞凋亡率显著增加(P0.01),且自噬相关标志蛋白Beclin 1和LC3Ⅱ显著下降(P0.01);与Glu组比较,MKB组与TBKH组RSC细胞增殖显著减弱(P0.01),MKB组,TBKH和TBKM组RSC细胞凋亡率显著减小(P0.01),MKB组和TBKH组RSC细胞自噬标志蛋白Beclin 1和LC3Ⅱ的表达水平显著升高(P0.01)。结论:TBK能够促进高糖环境下RSC细胞自噬,减少凋亡,具有一定的神经保护作用,该研究为DPN新药研发奠定基础。     

滋阴益气、息风活血通络法对糖尿病大鼠坐骨神经雪旺细胞凋亡影响的实验研究

目的 观察滋阴益气、息风活血通络法对糖尿病大鼠坐骨神经雪旺细胞凋亡的影响.方法 将60只SD雄性大鼠随机分为正常组、模型组、西药组、中药(降糖舒络方)高、中、低剂量组,采用STZ腹腔注射,建立糖尿病大鼠模型.以实验大鼠精化血红蛋白、血清胰岛素、坐骨神经雪旺细胞凋亡及介导细胞凋亡的caspase-3和调控细胞凋亡的基因蛋白Bcl-2、Bax的表达为观察指标,以达美康加弥可保为对照进行观察.结果 模型组大鼠坐骨神经雪旺细胞凋亡、caspase-3、Bax基因蛋白表达较正常组明显增强,Bcl-2明显下降.中药组和西药组对雪旺细胞凋亡、caspase-3、Bax和Bcl-2基因蛋白的影响与模型组相比均有显著差异;中药中剂量组和大剂量组对雪旺细胞凋亡、caspase-3、Bax和Bcl-2的影响优于西药组.中药组间比较以大剂量组疗效为佳.结论 滋阴益气、息风活血通络法可以改善糖尿病大鼠血清胰岛素水平,降低糖化血红蛋白水平,抑制雪旺细胞凋亡.其作用机制与抑制caspase-3活性和Bax蛋白表达及促进Bcl-2蚩白表达有关,并且对各观察指标的影响基本呈剂量依赖性.     

糖肾方含药血清对高糖诱导肾小管上皮细胞增殖作用及对TGF-β1、HO-1干预作用的研究

[目的]探讨糖肾方含药血清对高糖诱导肾小管上皮细胞增殖作用及对转化生长因子(TGF)-β1、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、血红素氯合酶-1(HO-1)干预作用。[方法]制备小鼠含药血清;培养肾小管上皮细胞分为:空白对照组、高糖组(30 mmol/L葡萄糖)、空白血清组(30 mmol/L葡萄糖+10%空白血清)、糖肾方低剂量血清组(30 mmol/L葡萄糖+10%低剂量含药血清)、糖肾方高剂量血清组(30 mmol/L葡萄糖+10%高剂量含药血清)。使用4-甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测糖肾方含药血清对高糖诱导肾小管上皮细胞增殖的影响。运用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和蛋白免疫印迹法(Western blotting)检测肾小管上皮细胞中TGF-β1、HO-1和α-SMA蛋白的表达。[结果]高糖诱导下,肾小管上皮细胞呈成纤维细胞样的长梭形,细胞核呈梭形改变。MTT检测:与空白组比较,高糖组光度值明显增高(P0.05);与高糖组比较,高低剂量含药血清组在培养24 h后吸光度值均有下降,吸光度差异有统计学意义(P0.05),且高剂量组光度值下降强于低剂量组(P0.05)。Western blotting及RT-PCR测定实验结果显示:与空白对照组细胞对比,高糖组中TGF-β1、α-SMA含量增加;经过含药血清干预后,高糖诱导的HK-2细胞TGF-β1、α-SMA含量降低,差别有统计学意义(P0.05);糖肾方高、低剂量组血清比较,在降低TGF-β1方面,高剂量组效果较好(P0.05),在降低α-SMA方面没有统计学差异(P0.05)。HO-1在高糖诱导后含量稍升高,与空白对照组对比,差异有统计学意义(P0.05);在经过糖肾方含药血清干预后,含量升高,与高糖组对比,差异有统计学意义(P0.05),糖肾方高低剂量组血清比较,升高HO-1含量方面没有统计学差异(P0.05)。[结论]糖肾方通过抑制高糖诱导的肾小管上皮细胞增殖和干预TGF-β1、α-SMA、HO-1相关分子的表达,可以抑制细胞外基质成分沉积,减少氧化应激反应,减轻细胞损伤,逆转上皮-间质转分化,从而抑制肾间质纤维化,延缓糖尿病肾病病情进展。     

益肾通络方对雄性苯并(a)芘染毒大鼠DFI、XRCC1、OGG1蛋白表达的影响

目的:观察益肾通络方对雄性苯并(a)芘(benzo(a)pyrene,Ba P)染毒大鼠精子DNA碎片指数(DNA fragmentation index,DFI)、X线修复交叉互补蛋白1(X-ray repair cross-complementing group 1,XRCC1)、8-羟基鸟嘌呤DNA糖苷酶(8-Oxoguanine DNA glycosylase,OGG1)蛋白表达的影响,探讨Ba P染毒大鼠精子DNA损伤机制及益肾通络方对Ba P染毒大鼠精子DNA损伤的防护作用。方法:选取SPF级雄性SD大鼠100只,按体质量进行编号,并按照随机数字表法随机分为5组:溶剂对照组、Ba P染毒组、益肾通络方低剂量组、益肾通络方中剂量组、益肾通络方高剂量组。除溶剂对照组外,其余各组均按1 mL·kg~(-1)腹腔注射经Ba P固体稀释成的0.1 mg·L~(-1)工作液染毒60 d,染毒浓度100μg·(kg·d)~(-1),中药组均自Ba P染毒第31天开始灌胃,时间为30 d,灌胃剂量按《实验动物学》相关比例折算后,低剂量组给予益肾通络方0.522 g·L~(-1)并按10 mL·(kg·d)~(-1)灌胃,中剂量组给予益肾通络方1.044 g·L~(-1)灌胃,高剂量组给予益肾通络方2.088 g·L~(-1)灌胃。5天称质量一次,末次给药后5组大鼠均采用水合氯醛(8 mL·kg~(-1))腹腔注射麻醉并收集睾丸组织、精子悬液,检测大鼠DFI、XRCC1、OGG1。结果:(1)大鼠DFI的变化:与溶剂对照组比较,Ba P染毒组DFI显著升高(P0.05),益肾通络方各组DFI均低于Ba P染毒组(P0.05),且益肾通络方中剂量组、益肾通络方高剂量组DFI显著降低(P0.05);(2)XRCC1蛋白表达水平变化:与溶剂对照组比较,Ba P染毒组雄性大鼠睾丸内XRCC1蛋白表达降低(P0.05),益肾通络方各组XRCC1蛋白表达均高于Ba P染毒组(P0.05),且益肾通络方高剂量组XRCC1蛋白表达水平明显高于益肾通络方低剂量组(P0.05);(3)OGG1蛋白表达水平变化:与溶剂对照组比较,Ba P染毒组雄性大鼠睾丸内OGG1蛋白表达降低(P0.05),益肾通络方各组OGG1蛋白表达均高于Ba P染毒组(P0.05),且益肾通络方高剂量组OGG1蛋白表达水平明显高于益肾通络方低剂量组,差异均有统计学意义(P0.05)。结论:实验性Ba P染毒大鼠DFI增加、XRCC1蛋白表达降低、OGG1蛋白表达降低,这可能是影响精子DNA完整性的机制之一。益肾通络方能够降低实验性染毒大鼠DFI,提升染毒大鼠睾丸内XRCC1蛋白、OGG1蛋白表达水平,对睾丸内精子DNA完整性具有保护作用,从而提升雄鼠的生殖机能。     

益肾通络方抑制EGFR及下游信号途径对膜性肾病大鼠肾脏保护作用的研究

目的探究益肾通络方对膜性肾病大鼠肾组织表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)及足细胞和肾小管上皮细胞凋亡的影响。方法 SD大鼠尾ⅳ阳离子牛血清白蛋白(cationic bovine serum albumin,C-BSA)建立膜性肾病大鼠模型,给予益肾通络方和盐酸贝那普利进行干预,检测各组大鼠24 h尿蛋白(urinetotal protein,UTP)、血清中白蛋白(albumin,ALB)和总胆固醇(total cholesterol,TC)水平;观察各组大鼠肾组织病理变化;采用TUNEL法检测各组大鼠肾组织足细胞和肾小管上皮细胞凋亡情况;采用免疫组化法检测各组大鼠肾组织磷酸化EGFR (p-EGFR)和剪切型半胱氨酸蛋白酶-3 (cleaved Caspase-3)的表达情况;采用Western blotting法检测各组大鼠肾组织p-EGFR、Ras相关的C3 肉毒素底物 1 (Ras-related C3 botulinum toxin substrate l,Racl)、c-jun、c-fos、FasL 和 cleaved Caspase-3 蛋白表达情况。结果与对照组比较,模型组大鼠24 h UTP以及血清中TC水平明显升高(P0.01),ALB水平显著降低(P0.01);肾小球基底膜、足细胞结构发生改变;肾组织足细胞和肾小管上皮细胞凋亡明显增多(P0.01);肾组织p-EGFR、Racl、c-jun、c-fos、FasL和cleaved Caspase-3蛋白表达水平显著升高(P0.01)。与模型组比较,益肾通络方中、高剂量组大鼠24 h UTP以及血清中TC水平明显降低(P0.01),ALB水平明显升高(P0.01);肾组织病理损伤得到改善;肾组织足细胞和肾小管上皮细胞凋亡明显减少(P0.05、0.01),肾组织p-EGFR、Racl、c-jun、c-fos、FasL和cleaved Caspase-3蛋白表达水平明显降低(P0.05、0.01)。结论益肾通络方可以减轻膜性肾病大鼠肾脏病理损伤,抑制肾组织足细胞和肾小管上皮细胞凋亡,其机制可能与抑制EGFR及下游Racl/c-jun、c-fos/FasL信号途径有关。     

糖肾平胶囊通过PI3K/Akt信号通路干预高糖+LPS诱导足细胞凋亡的机制

目的:观察糖肾平对高糖环境下脂多糖(LPS)对足细胞凋亡的影响,并探讨其作用机制。方法:利用雄性Wistar大鼠,分别用糖肾平小、中、大剂量(0. 525,1. 05,2. 1 g·kg-1),厄贝沙坦(17. 5 mg·kg-1)灌胃给药,制备相应药物血清。采用高糖,LPS体外刺激大鼠足细胞建立模型。并分为正常组(5%正常大鼠血清),高糖组(5%模型大鼠血清+4. 5‰葡萄糖),高糖+LPS组(5%模型大鼠血清+4. 5‰葡萄糖+LPS 1 mg·L-1),厄贝沙坦组(5%厄贝沙坦组大鼠血清+4. 5‰葡萄糖+LPS1 mg·L-1),糖肾平小剂量组(5%糖肾平小剂量大鼠血清+4. 5‰葡萄糖+LPS 1 mg·L-1),中剂量组(5%糖肾平中剂量大鼠血清+4. 5‰葡萄糖+LPS 1 mg·L-1),大剂量组(5%糖肾平大剂量大鼠血清+4. 5‰葡萄糖+LPS 1 mg·L-1)。采用蛋白免疫印迹法(Western blot)及逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测足细胞中CD2相关蛋白(CD2AP),nephrin和磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信号转导通路中关键因子的蛋白和mRNA的表达水平。结果:与正常组比较,高糖组和高糖+LPS组足细胞nephrin,CD2AP,PI3K,Akt蛋白及mRNA表达明显减少(P 0. 05,P 0. 01); B淋巴细胞瘤-2相关凋亡蛋白(Bad蛋白)及mRNA表达明显增加(P 0. 05,P 0. 01)。与高糖+LPS组比较,厄贝沙坦组足细胞CD2AP,PI3K,Akt蛋白及mRNA表达明显增加(P 0. 05,P 0. 01); nephrin mRNA表达增加; Bad蛋白及mRNA蛋白表达减少。糖肾平各组足细胞CD2AP,PI3K,Akt蛋白及mRNA表达明显增加(P 0. 05,P 0. 01); Bad蛋白及mRNA蛋白表达减少(P 0. 05,P 0. 01)。结论:糖肾平维持足细胞裂孔隔膜蛋白稳定表达,保护肾小球滤过屏障,同时进一步激活PI3K/Akt信号通路,抑制足细胞凋亡;是其多靶点防治糖尿病肾病的作用机制之一。     

芦荟大黄素通过Bax/Caspase-3 信号通路调控肝癌细胞自噬作用研究

目的：探讨芦荟大黄素通过B 淋巴细胞癌-2 基因（Bcl-2） 相关X 蛋白（Bax） /半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（Caspase-3） 信号通路调控肝癌细胞自噬的作用。方法：选用肝癌SMMC-7721 细胞，设置SMMC-7721 组、5 氟尿嘧啶组、芦荟大黄素低、高剂量组（低、高剂量组）。5 氟尿嘧啶组加入5 氟尿嘧啶至终浓度为80 μg/mL，低、高剂量组加入芦荟大黄素至终浓度分别为100 μg/mL、200 μg/mL。以上各组每孔设6 个平行样，培养72 h。试验结束后，采用MTT 法测定细胞增殖水平，吖啶橙染色观察细胞自噬水平，流式细胞仪测定细胞凋亡水平，RT-PCR 法及Western-blot 法测定细胞Bax、Caspase-3 基因和蛋白水平。结果：与SMMC-7721 组比较，其余各组细胞存活率降低（P＜0.05），自噬小体、凋亡率、Bax、Caspase-3 mRNA 及蛋白表达水平升高（P＜0.05）；与低剂量组比较，高剂量组存活率降低（P＜0.05），自噬小体、凋亡率、Bax、Caspase-3 mRNA 及蛋白表达水平升高（P＜0.05）；与5 氟尿嘧啶组比较，低、高剂量组细胞存活率升高（P＜0.05），自噬小体、凋亡率、Bax、Caspase-3 mRNA 和蛋白表达水平降低（P＜0.05）。结论：芦荟大黄素能明显抑制肝癌SMMC-7721 细胞增殖，诱导该细胞发生自噬和凋亡，且其机制与芦荟大黄素能促进Bax、Caspase-3 mRNA 及蛋白表达有关。     

百事乐加味方对脑卒中后抑郁模型大鼠海马-前额叶皮层神经细胞凋亡蛋白的影响

目的观察百事乐加味方对脑卒中后抑郁(PSD)大鼠神经功能、形态学及海马(HP)、前额叶皮层(PFC)组织Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白表达的影响,从神经细胞凋亡方面探讨百事乐加味方防治PSD作用机制。方法采用MCAO+CUMS+孤养法复合因素建立PSD模型。分组前进行行为学评分,随机分为假手术组、抑郁组、卒中组、PSD组、阳性药组和百事乐加味方高、低剂量组,各给药组给予相应药物,连续28 d。采用HE和Nissl染色观察HP、PFC组织形态学;采用免疫组化检测大鼠HP、PFC组织Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白表达。结果对神经功能缺损评分的影响:与PSD组大鼠比较,百事乐加味方高、低剂量组第21、28日神经功能缺损评分显著改善(P0.05,P0.01);对HP、PFC组织形态学的影响:与PSD组比较,百事乐加味方高、低剂量组大鼠病变明显改善。对凋亡蛋白的影响:百事乐加味方高剂量组大鼠HP、PFC组织Bax、Caspase-3蛋白表达显著降低,Bcl-2蛋白表达显著升高,Bcl-2/Bax比值显著增大(P0.01);百事乐加味方低剂量组大鼠HP、PFC组织Bcl-2蛋白表达显著升高,Caspase-3蛋白表达显著降低,HP组织Bax蛋白表达显著降低,Bcl-2/Bax比值显著增大(P0.05,P0.01)。结论百事乐加味方通过调控凋亡蛋白表达,抑制细胞凋亡,减少神经病变,改善神经功能,从而发挥治疗作用,是其抗PSD主要作用机制之一。     

苍菊清肝降脂方对非酒精性脂肪性肝炎大鼠肝组织SIRT1、SIRT2和SIRT3表达的影响

目的观察苍菊清肝降脂方对非酒精性脂肪性肝炎(NASH)大鼠肝组织沉默信息调节因子2相关酶类1(SIRT1)、SIRT2和SIRT3表达的影响。方法将40只SPF级雄性Wistar大鼠按照随机数字表分为4组,即正常组、模型组、苍菊清肝降脂方低剂量组及苍菊清肝降脂方高剂量组,每组各10只。正常组大鼠予普通饲料喂养;其余3组大鼠第1~2周予高脂低蛋白饲料,第3~4周予纯玉米粉饲料喂养,同时予40%四氯化碳橄榄油溶液1 m L/kg腹腔注射造模,每周2次。造模的同时,正常组及模型组大鼠分别予0.9%氯化钠注射液1 m L/100 g灌胃,苍菊清肝降脂方低剂量组及苍菊清肝降脂方高剂量组分别予相应浓度的苍菊清肝降脂方药液(每m L生药含量分别为0.45、0.90 g)1 m L/100 g灌胃,均每日1次,连续4周。4周后获取4组大鼠肝组织,分别采用实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)法和蛋白质印迹(Western blot)法检测肝组织SIRT1、SIRT2和SIRT3 mRNA和蛋白表达。结果与正常组比较,模型组大鼠肝组织SIRT1、SIRT2和SIRT3 mRNA及蛋白表达均显著降低(P0.05);与模型组比较,苍菊清肝降脂方低剂量组及苍菊清肝降脂方高剂量组大鼠肝组织SIRT1、SIRT2和SIRT3 mRNA及蛋白表达均显著升高(P0.05),苍菊清肝降脂方低剂量组与苍菊清肝降脂方高剂量组之间比较差异均无统计学意义(P0.05)。结论苍菊清肝降脂方可显著增加NASH大鼠肝脏组织SIRT1、SIRT2和SIRT3 mRNA和蛋白表达。