丹参多酚酸盐减轻糖尿病肾病小鼠肾纤维化的机制研究

【目的】 探讨丹参多酚酸盐对小鼠糖尿病肾病的干预作用及机制。【方法】 将60只C57BL/6小鼠随机分为正常组、模型组、贝那普利组、丹参多酚酸盐组，每组15只。除正常组，其他组别采用腹腔注射链脲佐菌素（STZ）的方法复制糖尿病肾病小鼠模型。造模成功后随机分为模型组、贝那普利组、丹参多酚酸盐组，丹参多酚酸盐组、贝那普利组分别灌胃相应的药物，正常组和模型组灌胃等体积蒸馏水，共4周。给药结束后，检测24 h尿蛋白定量（UTP），血清空腹血糖（FBG）、尿素氮（BUN）、血清肌酐（SCr），酶联免疫吸附分析（ELISA）检测小鼠肾组织中超氧化歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）水平，分别采用过碘酸六胺银（PASM）染色和Masson 染色法观察肾脏病理学变化，采用蛋白免疫印迹（Western Blot）法分别检测小鼠肾脏组织中p-Smad2/3、Smad2/3、Smad7蛋白表达水平，逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）法检测小鼠肾脏组织中Smad7、Smad2/3、TGF-β1 mRNA表达水平。【结果】 与正常组比较，模型组FBG、UTP均显著增加（P <0.05），肾脏组织可见明显病理改变，肾脏组织中的MDA 含量显著升高，SOD、GSH-Px 活性下降，p-Smad2/3/Smad2/3比值，Smad2/3、TGF-β1 mRNA表达水平明显升高，Smad7蛋白与mRNA表达水平明显下降（均P < 0.05）；与模型组比较，丹参多酚酸盐组、贝那普利组UTP降低（P < 0.05），受损的肾组织得到改善，肾组织中MDA含量下降，SOD、GSH-Px活性升高，p-Smad2/3/Smad2/3 比值，Smad2/3、TGF-β1 mRNA 表达水平显著降低，Smad7 蛋白与 mRNA 表达水平升高（均 P <0.05）。【结论】 丹参多酚酸盐可明显改善糖尿病肾病小鼠肾功能，其机制可能与抑制氧化应激反应和调控TGF-β1/Smad信号通路，从而减轻肾纤维化有关。     

基于mTORC1/p70S6K通路探讨大黄泄浊方对慢性肾衰竭大鼠自噬和凋亡的影响

目的 观察大黄泄浊方对5/6肾切除大鼠mTORC1/p70S6K信号通路蛋白的影响，进一步研究其在保护肾脏功能可能的作用机制。方法 随机将90只雄性SD大鼠分为假手术组与造模组，其中假手术组15只，造模组75只。造模组大鼠采用5/6肾切除方法建立慢性肾衰竭模型，造模成功后，将75只大鼠随机分为模型组、尿毒清颗粒组(2.60g·kg^-1)、大黄泄浊方低剂量组(6.825g·kg^-1)、大黄泄浊方中剂量组(13.650g·kg^-1)和大黄泄浊方高剂量组(27.30g·kg^-1),每组均为15只。连续给药8周后，检测血尿素氮(BUN)、血肌酐(SCr)、β2-微球蛋白(β2-MG)含量；Masson染色光镜下观察肾组织的病理形态改变；免疫组织化学(IHC)检测Bcl-2、cleaved-caspase3、BAX、Beclin-1、LC3、P62蛋白表达；蛋白免疫印迹法(Western-blot)检测p-mTORC1、mTORC1、p-p70S6K、p70S6K蛋白表达。结果 与假手术组比较，模型组大鼠β2...     

降脂通络软胶囊调控SIRT1/FoxO3通路对膜性肾病大鼠细胞凋亡的影响

目的 通过观察降脂通络软胶囊对膜性肾病（MN）大鼠肾组织中沉默信息调节因子2相关酶1（SIRT1）/叉头转录因子O3（FoxO3）蛋白表达及足细胞凋亡的影响,探讨其治疗MN的可能分子机制。方法 将60只雄性SD大鼠随机分为6组,每组10只,随机选取1组作为正常组,其余5组分别为模型组、盐酸贝那普利（西药）组（10 mg·kg^-1）和降脂通络软胶囊低、中、高剂量（中药低、中、高剂量）组（25、50、100 mg·kg^-1）,并通过尾静脉注射阳离子化牛血清白蛋白（C-BSA）的方法造模。造模成功后,各组按照相应比例剂量连续4周灌胃给药,并在第4周末留取肾组织,采用电镜、免疫荧光观察肾脏病理学变化,蛋白免疫印迹法（Western blot）检测大鼠肾脏SIRT1、FoxO3蛋白的表达情况,免疫组化（IHC）检测B细胞淋巴瘤-2（Bcl-2）、Bcl-2相关X蛋白（Bax）、死亡启动子重组蛋白（Bad）、足细胞裂孔膜蛋白（Nephrin）、膜蛋白（Podocin）的蛋白表达情况。结果 与正常组比较,模型组大鼠肾组织中促凋亡因子Bax、Bad、FoxO3蛋白表达均明显增加（P<0.05）,抗凋亡因子Bcl-2、SIRT1、Nephrin、Podocin蛋白表达均降低（P<0.05）;与模型组比较,各治疗组肾组织中Bax、Bad、FoxO3蛋白表达明显减少（P<0.05）,Bcl-2、SIRT1、Nephrin、Podocin表达明显升高（P<0.05）。结论 降脂通络软胶囊对MN的肾保护作用可能与其调控SIRT1/FoxO3通路,减少足细胞凋亡,维护足细胞结构稳定有关。     

益肾通络方对MN大鼠miR-514a-5p/TNFSF15信号通路的影响及机制

目的:基于miR-514a-5p/肿瘤坏死因子超家族成员15(TNFSF15)信号通路探讨益肾通络方抑制膜性肾病(MN)大鼠肾小球足细胞凋亡的分子机制。方法:80只SD大鼠采用预免疫和尾静脉注射阳离子化牛血清白蛋白(C-BSA)的方法建立MN大鼠模型,并使造模成功的MN大鼠随机分为模型组,益肾通络方高、中、低剂量组(26.44,13.22,6.61 g·kg^-1)和贝那普利组(10 mg·kg^-1),每组各10只,取健康大鼠20只作为正常组,各组分别予对应药物灌胃,每日1次,连续干预4周。给药结束后,实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测大鼠肾组织中miR-514a-5p及TNFSF15 mRNA表达水平;免疫组化(IHC)检测大鼠肾组织中足细胞标志蛋白足细胞裂孔膜蛋白(Nephrin),膜蛋白(Podocin),足萼蛋白(Podocalyxin),突触足蛋白(Synaptopodin),TNFSF15及足细胞凋亡相关蛋白B细胞淋巴瘤-2(Bcl-2)相关X蛋白(Bax),Bcl-2关联死亡启动子重组蛋白(BAD),大分子B细胞淋巴瘤(Bcl-XL)的表达水平;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测大鼠肾组织中TNFSF15,Bax,BAD,Bcl-2,Bcl-XL的表达水平;原位末端标记法(TUNNEL)检测大鼠肾组织细胞凋亡率。结果:与正常组比较,模型组大鼠肾组织中miR-514a-5p水平明显降低(P<0.05),TNFSF15 mRNA水平明显升高(P<0.05);足细胞标志蛋白Nephrin,Podocin,Podocalyxin,Synaptopodin表达明显降低(P<0.05);TNFSF15,Bax,BAD蛋白表达水平明显升高(P<0.05),Bcl-2,Bcl-XL蛋白表达水平明显降低(P<0.05);凋亡细胞明显增多(P<0.05)。与模型组比较,益肾通络方各剂量组和贝那普利大鼠肾组织中miR-514a-5p水平明显升高(P<0.05),TNFSF15 mRNA水平明显降低(P<0.05);足细胞标志蛋白Nephrin,Podocin,Podocalyxin,Synaptopodin表达明显升高(P<0.05);TNFSF15,Bax,BAD蛋白表达水平明显降低(P<0.05),Bcl-2,Bcl-XL蛋白表达水平明显升高(P<0.05);凋亡细胞明显减少(P<0.05)。结论:益肾通络方可能通过miR-514a-5p/TNFSF15信号通路,减轻大鼠肾组织足细胞凋亡,缓解MN大鼠肾损伤。     

微小RNA-193a调控Wilms瘤基因1促进小鼠糖尿病肾病足细胞凋亡

目的 探讨微小RNA（miR）-193a对糖尿病肾病（DN）足细胞凋亡的影响及作用机制。 方法 通过体外高糖培养足细胞和体内小鼠腹腔注射链脲佐菌素(STZ)复制DN模型,将细胞或60只小鼠随机分为空白对照组、模型对照组、miR-193a抑制阴性对照组、miR-193a抑制组、miR-193a过表达阴性对照组和miR-193a过表达组。使用流式细胞术、免疫组织化学、免疫荧光、TUNEL、Real-time PCR和Western blotting检测DN小鼠和小鼠足细胞凋亡情况。 结果 DN小鼠和高糖诱导的小鼠足细胞中Nephrin、Podocin表达减弱,细胞凋亡率显著升高,miR-193a高表达,小鼠肾脏和足细胞中cleaved-Caspase-3和Bax蛋白水平显著升高,Bcl-2蛋白水平显著下降,而miR-193a 抑制剂(inhibitor)可改善这一过程。DN小鼠和高糖培养的小鼠足细胞中Wilms瘤基因1（WT1） mRNA和蛋白表达水平显著降低,miR-193a inhibitor干预后WT1蛋白表达显著升高。上调WT1可降低miR-193a对高糖诱导的小鼠足细胞凋亡的影响。双荧光素酶报告实验证实了miR-193a和WT1之间的靶向关系。 结论 MiR-193a下调WT1的表达,促进DN足细胞凋亡。     

丹参多酚酸盐通过AMPK/Sirt1/PGC-1α信号通路诱导膜性肾病大鼠足细胞自噬的机制

目的：通过观察丹参多酚酸盐对膜性肾病(MN)大鼠肾组织中腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)、沉默信息调节因子(Sirt1)、过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子-1α(PGC-1α)蛋白的表达及细胞自噬和凋亡的情况,探讨其治疗MN的可能的分子机制。方法：80只雄性SD大鼠随机分为正常组,模型组,盐酸贝那普利组(10 mg·kg^-1),丹参多酚酸盐低、中、高剂量组(16.7、33.3、66.7 mg·kg^-1),通过尾静脉注射阳离子化牛血清白蛋白(C-BSA)的方法造模。造模成功后,各组按照相应比例剂量连续给药4周后留取24 h尿、血清和肾组织,尿液用于检测24 h尿蛋白定量(24 h UTP)、血清用于检测血尿素氮(BUN)、血肌酐(SCr)、白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、C反应蛋白(CRP)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)的含量。采用光镜、电镜、免疫荧光法观察肾脏病理学变化,蛋白免疫印迹法(Western blot)检测大鼠肾组织磷酸化(p)-AMPK、AMPK、p...     

益肾通络方抑制EGFR及下游信号途径对膜性肾病大鼠肾脏保护作用的研究

目的探究益肾通络方对膜性肾病大鼠肾组织表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)及足细胞和肾小管上皮细胞凋亡的影响。方法 SD大鼠尾ⅳ阳离子牛血清白蛋白(cationic bovine serum albumin,C-BSA)建立膜性肾病大鼠模型,给予益肾通络方和盐酸贝那普利进行干预,检测各组大鼠24 h尿蛋白(urinetotal protein,UTP)、血清中白蛋白(albumin,ALB)和总胆固醇(total cholesterol,TC)水平;观察各组大鼠肾组织病理变化;采用TUNEL法检测各组大鼠肾组织足细胞和肾小管上皮细胞凋亡情况;采用免疫组化法检测各组大鼠肾组织磷酸化EGFR (p-EGFR)和剪切型半胱氨酸蛋白酶-3 (cleaved Caspase-3)的表达情况;采用Western blotting法检测各组大鼠肾组织p-EGFR、Ras相关的C3 肉毒素底物 1 (Ras-related C3 botulinum toxin substrate l,Racl)、c-jun、c-fos、FasL 和 cleaved Caspase-3 蛋白表达情况。结果与对照组比较,模型组大鼠24 h UTP以及血清中TC水平明显升高(P0.01),ALB水平显著降低(P0.01);肾小球基底膜、足细胞结构发生改变;肾组织足细胞和肾小管上皮细胞凋亡明显增多(P0.01);肾组织p-EGFR、Racl、c-jun、c-fos、FasL和cleaved Caspase-3蛋白表达水平显著升高(P0.01)。与模型组比较,益肾通络方中、高剂量组大鼠24 h UTP以及血清中TC水平明显降低(P0.01),ALB水平明显升高(P0.01);肾组织病理损伤得到改善;肾组织足细胞和肾小管上皮细胞凋亡明显减少(P0.05、0.01),肾组织p-EGFR、Racl、c-jun、c-fos、FasL和cleaved Caspase-3蛋白表达水平明显降低(P0.05、0.01)。结论益肾通络方可以减轻膜性肾病大鼠肾脏病理损伤,抑制肾组织足细胞和肾小管上皮细胞凋亡,其机制可能与抑制EGFR及下游Racl/c-jun、c-fos/FasL信号途径有关。     

大黄泄浊方调控ROS/TXNIP/NLRP3通路对5/6肾切除大鼠肾间质纤维化的影响

目的 通过观察大黄泄浊方对5/6肾切除大鼠肾脏病理变化，肾组织活性氧（ROS）/硫氧还蛋白互作蛋白（TXNIP）/NOD样受体蛋白3（NLRP3）通路表达的变化，研究其保护肾功能，延缓肾间质纤维化的作用机制及可能性。方法 90只健康SD雄性大鼠随机分为假手术组、模型组、大黄泄浊方低、中、高剂量（6.825、13.65、27.30 g·kg^-1）组和尿毒清颗粒（2.60 g·kg^-1）组。除假手术组外其余5组均采用5/6肾切除术复制CRF大鼠模型。造模成功后，各给药组分别给予相应剂量的药物混悬液灌胃，每日1次，连续8周。给药结束后，检测大鼠血清中肌酐（SCr）、尿素氮（BUN）水平和24 h尿蛋白定量（UTP）水平；蛋白免疫印迹法（Western blot）检测硫氧还蛋白（TRX）、TXNIP和NLRP3蛋白的表达情况；免疫组化法检测NLRP3、TRX、TXNIP、接头蛋白凋亡相关斑点样蛋白（ASC）、转化生长因子-β（TGF-β）、Ⅳ型胶原蛋白（Collagen Ⅳ）、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）和调纤连蛋白（FN）的表达。结果 与假手术组比较，模型组大鼠血SCr、BUN、24 h UTP水平明显增高（P<0.05），TRX、TXNIP、NLRP3、ASC、TGF-β、Collagen Ⅳ、α-SMA和FN蛋白显著增高（P<0.01），肾间质发生显著纤维化；与模型组比较，大黄泄浊方各剂量组和尿毒清颗粒组血SCr、BUN、24 h UTP水平均有不同程度降低（P<0.05），TRX、TXNIP、NLRP3、ASC、TGF-β、Collagen Ⅳ、α-SMA和FN蛋白显著降低（P<0.01），肾间质纤维化不同程度改善。结论 大黄泄浊方可保护慢性肾衰竭大鼠肾功能、延缓肾间质纤维化。     

加味升降散通过介导RIP1/RIP3/MLKL通路抑制坏死性凋亡减轻糖尿病肾病大鼠肾脏纤维化

目的 探讨加味升降散基于刺激受体相互作用蛋白（RIP）1/RIP3/混合谱系激酶结构域样假激酶（MLKL）通路对糖尿病肾病大鼠坏死性凋亡及肾纤维化的干预机制。方法 75只SD大鼠分为正常组、模型组、加味升降散低、中、高剂量组（4.365、8.73、17.46 g·kg^-1）和厄贝沙坦组（0.013 5 g·kg^-1），灌胃给药干预4周后，检测各组大鼠24 h尿蛋白定量（UTP），血清中肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1β（IL-1β）水平，肾脏病理变化程度；实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-time PCR）法和免疫组化分别检测大鼠肾组织中IL-1β、TNF-α、单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）、转化生长因子-β₁（TGF-β₁）、核转录因子-κB（NF-κB）mRNA和蛋白表达水平；蛋白免疫印迹法（Western blot）检测RIP1/RIP3/MLKL信号通路关键蛋白的表达水平。结果 与正常组比较，模型组大鼠肾脏间质纤维化明显，24 h UTP、IL-1β、TNF-α水平明显升高（P<0.05），肾组织中IL-1β、TNF-α、MCP-1、TGF-β₁、NF-κB mRNA和蛋白表达水平明显升高（P<0.05），RIP1、RIP3、磷酸化（p）-MLKL、MLKL蛋白表达量明显增多（P<0.05）；与模型组比较，加味升降散各剂量组及厄贝沙坦组大鼠肾脏间质纤维化水平均有不同程度改善，24 h UTP水平均有不同程度降低（P<0.05），血清中IL-1β、TNF-α含量明显降低（P<0.05），肾组织中IL-1β，TNF-α，MCP-1，TGF-β₁，NF-κB mRNA和蛋白表达水平明显下调（P<0.05），RIP1、RIP3、p-MLKL、MLKL蛋白表达量明显下调（P<0.05）。结论 加味升降散可以改善糖尿病肾病大鼠肾损伤，其机制可能与下调RIP1/RIP3/MLKL信号通路，阻止肾组织坏死性凋亡，抑制肾纤维化有关。     

大黄泄浊方对慢性肾衰竭大鼠炎症及SOCS3/TLR4通路的影响

目的：观察大黄泄浊方对慢性肾衰竭(CRF)大鼠信号传导抑制因子3(SOCS3)/Toll样受体4(TLR4)通路的干预作用,探讨其减轻肾组织炎症反应的分子机制。方法：取雄性SD大鼠90只,随机留取15只为假手术组,剩余75只为造模组,行5/6肾切除术复制CRF大鼠模型,模型复制成功后,随机分为模型组,大黄泄浊方低、中、高剂量(6.825、13.65、27.3 g·kg^-1)组、尿毒清颗粒组(2.6 g·kg^-1),分别予相应剂量的药物灌胃,连续灌胃8周。给药结束后,苏木素-伊红(HE)染色及马松(Masson)染色观察大鼠肾脏组织病理形态改变;检测大鼠血肌酐(SCr)、血尿素氮(BUN)、血尿酸(UA)水平;酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测大鼠血清中白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、C反应蛋白(CRP)含量;实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测肾组织中SOCS3和TLR4 m RNA的表达;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测信号传导抑制因子3(SOCS3)、TLR4、核转录因子...