真核表达载体pVAX1-mSLC的构建及在COS-7细胞中的表达

目的：构建小鼠次级淋巴组织趋化因子（mSLC）高效真核细胞表达载体pVAX1-mSLC。方法：用BamHⅠ和XbaⅠ双酶切重组克隆pMD-mSLC,胶回收约410bp的SLC基因片段,以亚克隆法构建于真核表达载体pVAX1的相应酶切位点。转化后进行菌落PCR分析和HinDⅢ酶切鉴定。阳性克隆提取质粒,体外电穿孔法转染COS-7细胞,用Western blot检测转染细胞中mSLC的瞬时表达。结果：菌落PCR和HindⅢ酶切鉴定证实,mSLC基因片段正确插入到真核表达载体pVAX1中。Western blot检测表明,以重组质粒pVAX1-mSLC转染的COS-7细胞能表达mSLC,表达产物的相对分子量同预期的结果相一致。结论：成功地构建小鼠SLC基因的真核表达质粒pVAX1-mSLC,用它转染COS-7细胞后,能瞬时表达mSLC,为下一步mSLC的肿瘤基因治疗研究奠定了基础。     

E型沙眼衣原体MOMP基因重组质粒的构建与表达

目的：构建E型沙眼衣原体（Ct）主要外膜蛋白（MOMP）基因重组真核表达质粒pVAX1-MOMP,为探索安全的E型CtDNA疫苗奠定基础。方法：根据Genebank中E型Ct MOMP基因序列设计引物,用高保真PCR方法从E型Ct基因组DNA中扩增得到约1.1kb的MOMP片段,克隆至pcDNAⅡ载体,测序后亚克隆至表达载体pVAX1,构建卡那霉素抗性真核重组表达质粒pVAX1-MOMP,并以重组质粒转染COS-1细胞进行表达,用Western blotting方法鉴定表达产物。结果：从E型Ct基因组DNA中扩增出特异的MOMP基因片段,酶切鉴定及DNA序列测定证实pVAX1-MOMP重组质粒构建正确,能在COS-1细胞内表达,表达产物能与抗MOMP单克隆抗体特异性结合。结论：成功构建E型沙眼衣原体MOMP真核表达质粒pVAX1-MOMP,并在真核细胞内获得表达。     

重组人白细胞介素21真核表达载体的构建及体外药效学研究

目的构建人的真核表达载体pVAX/IL-21,并进行体外细胞转染实验的鉴定研究。方法采用PCR扩增技术扩增含有白细胞介素21（interleukin21,IL-21）的基因,亚克隆于真核表达载体pVAX1,并进行酶切和测序分析;将所构建的质粒转染COS-7细胞检测其表达情况。结果酶谱和测序分析表明,构建的质粒pVAX/IL-21（pIL-21）基因片段的方向、序列完全正确;ELISA法定量检测双质粒转染COS-7细胞后24h、48h、72h、96h均检测到目的基因的蛋白表达,其中转染48h的表达水平较高,达到45ng/ml。结论成功构建了人IL-21的整合表达质粒pIL-21,并具有较强的体外细胞转染活性,为进一步研究IL-21的生物学功能如抗肿瘤活性等提供了实验基础。     

甲型流感病毒DNA疫苗双表达载体的构建及表达

目的： 构建含有甲型流感病毒M2基因与GM-CSF基因的DNA疫苗双表达载体,为研究甲型通用流感疫苗奠定基础。方法： 将甲型流感病毒（H1N1）接种鸡胚后收获尿囊液,提取流感病毒总RNA,RT-PCR法扩增M2基因;将微小病毒内部核糖体进入位点（IRES）基因插入到质粒pVAXⅠ多克隆位点,再将M2基因和GM-CSF基因依次克隆到IRES的上、下游多克隆位点,构建出甲型流感病毒双表达载体pMIG,酶切鉴定后测序;脂质体法转染COS7细胞并检测目的蛋白的表达。结果： 成功扩增出M2基因（约300 bp）、IRES基因(约580 bp)和GM-CSF基因(约400 bp),酶切鉴定结果表明构建出甲型流感病毒双表达载体pMIG,Western blotting检测证明流感病毒M2蛋白的表达。结论：成功构建出流感病毒DNA疫苗双表达载体pMIG。     

人白细胞介素-18真核表达载体的构建及测序分析

目的：构建含有人白细胞介素—18(IL-18)基因的真核表达载体，并对其进行测序分析。方法：通过分子克隆技术，将IL-18基因插入真核表达载体pVAX1中，构建真核表达载体pVAXl—IL—18，并经BamHI／EcoRI双酶切及测序鉴定。利用Blast程序，搜索NCBI GenBank中与重组质粒(pVAX1—IL—18)中编码IL-18基因同源的序列。结果：人IL—18基因成功地克隆至真核表达载体pVAX1中，pVAX1—IL—18中编码IL—18的序列与GenBank中所报道的IL-18编码序列完全—致。结论：成功地构建人IL—18基因真核表达载体，为其作为核酸疫苗的细胞因子佐剂奠定了基础。     

rhTL1A基因原核表达载体的构建、表达与纯化

目的：构建人肿瘤坏死因子样分子1A（TL1A）原核表达质粒并诱导其表达,纯化及鉴定目的蛋白。方法：人HUVECs总RNA经逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增TL1A基因,克隆到pTA2载体,酶切和测序鉴定正确后构建重组原核表达质粒pQE-TL1A,并转化大肠杆菌M15［pREP4］。IPTG诱导目的蛋白表达并进行Western blotting鉴定;镍离子亲和层析柱(Ni²⁺-NTA)纯化靶蛋白。结果：目的基因经酶切其结果与预期相符,测序结果显示目的基因与GenBank登录的序列(登录号AF520785)完全一致;工程化大肠杆菌M15［pREP4］经IPTG诱导表达相对分子质量约22 000的目的蛋白;Western blotting鉴定结果显示,重组蛋白能够与抗His单克隆抗体特异性结合。结论：成功地构建了重组原核表达质粒pQE-Tl1A,并纯化获得高纯度重组TL1A蛋白。     

pCMV-Myc-PIASxβ重组质粒的构建与蛋白表达

目的:通过基因重组方法构建pCMV-Myc-PIASxβ质粒,在真核细胞中高效表达重组蛋白并进行检测。方法:用SalⅠ和NotⅠ将PIASxβ片段从pGADT7载体中酶切后,利用DNA重组技术将其定向插入pCMV-Myc载体中。获得正确重组质粒后,瞬转CHO细胞系,用Western blotting检测Myc-PIASxβ重组融合蛋白表达。结果:经过酶切,片段回收,连接转化,获得重组质粒。重组pCMV-Myc-PIASxβ克隆通过酶切和测序鉴定其正确性。EcoRⅠ酶切鉴定,pCMV-Myc-PIASxβ为一条大小5 641 bp的条带;XbaⅠ酶切鉴定,pCMV-Myc-PIASXβ为2条大小分别为3 291和2 349 bp 的条带,符合预计大小。Western blotting检测证实,在相对分子质量68 000处（PIASxβ融合蛋白）有特异的蛋白表达条带,与重组质粒相符。结论：成功构建了pCMV-Myc-PIASxβ重组质粒,为深入研究PIAS家族的功能奠定良好的基础。     

BMP2-EGFP融合蛋白的构建及其生物活性

目的：构建BMP2/pLEGFP重组逆转录病毒表达载体,并检测其表达的融合蛋白的生物活性。方法：用基因重组技术构建BMP2/pLEGFP重组逆转录病毒表达载体,并通过酶切和PCR鉴定。脂质体法转染COS-7细胞,用荧光显微镜检测和Western blotting分析其在COS-7细胞表达,细胞活性实验和动物体内异位成骨实验进一步检测融合蛋白的生物活性。结果：经酶切和PCR鉴定重组质粒BMP2/pLEGFP构建成功。转染COS-7细胞后,荧光显微镜和Western blotting检测均显示融合蛋白在细胞中表达;分泌的产物经细胞活性实验和动物体内异位成骨实验证实具有BMP2和EGFP的双重蛋白活性。结论：基因重组技术成功构建BMP2/pLEGFP重组体,重组体表达的融合蛋白具有GFP和BMP2的双重活性。     

pIRES2-EGFP-BMP-2真核表达质粒的构建及其活性测定

目的:构建pIRES2-绿色荧光蛋白(EGFP)-骨形成蛋白2(bone morphogenetic protein 2,BMP-2)真核表达质粒,并检测其表达活性。方法:采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术从人骨肉瘤组织中扩增出人骨形态发生蛋白2(hBMP-2)的基因片段,构建成pIRES2-EGFP-BMP-2重组质粒,经酶切、测序检测其构建的正确性,通过转染3T3细胞后分别采用RT-PCR、免疫组化及Western免疫印迹(Western blotting,WB)法检测其转录、表达活性。结果:构建的pIRES2-EGFP-BMP-2质粒经酶切、测序、RT-PCR、免疫组化、EGFP表达鉴定、WB等检验表明质粒构建成功并具有转录活性。结论:本实验成功构建了具有表达活性的hBMP-2真核表达质粒,为进一步研究用BMP-2基因转染的方法来促进实验动物骨折的愈合奠定了基础。     

小鼠真核表达质粒pcDNA3.1(+)-FGFR1的构建及表达

目的:通过基因重组技术构建真核表达质粒pcDNA3.1(+)-FGFR1,并检测其在CHO细胞中的表达。方法:通过PCR扩增FGFR1的全段基因cDNA,应用基因工程技术将扩增的基因片段插入pcDNA3.1(+)真核表达质粒,经限制内切酶酶切分析及测序鉴定正确后,用脂质体包裹转染CHO细胞,Western blot检测FGFR1目的蛋白的表达。结果:经酶切和测序鉴定证实本实验构建的重组表达质粒正确,该质粒在体外转染CHO细胞后可表达FGFR1目的蛋白。结论:成功构建的pcDNA3.1(+)-FGFR1重组质粒能在体外表达FGFR1目的蛋白。     

新型基因佐剂SPreS2真核表达载体的构建及其瞬时表达

目的 构建重组真核表达载体pVAX1-SPreS2作为基因佐剂,用以增强或调节弓形虫DNA疫苗的体液及细胞免疫效果。方法 采用重叠延伸PCR技术,扩增乙肝病毒表面抗原S和PreS2基因,引入编码GSGSGS柔性多肽序列作为接头拼接S和PreS2基因,构建重组克隆载体pMD18T-SPreS2和重组真核表达载体pVAX1-SPreS2,分别进行PCR、酶切和测序鉴定;脂质体法将重组载体pVAX1 SPreS2转染人成纤维细胞,建立体外真核细胞瞬时表达系统,SDS-PAGE和Western blot检测重组载体转染HFF细胞瞬时表达状况及其表达产物的免疫活性。结果 PCR、酶切、测序结果表明,重组克隆载体pMD18T SPreS2和重组真核表达载体pVAX1 SPreS2正确构建,融合基因SPreS2在真核细胞中可以瞬时表达,其表达产物具有一定的免疫活性。结论 成功构建重组真核表达载体pVAX1-SPreS2,为增强或调节弓形虫DNA疫苗免疫效果提供一种新型基因佐剂。     

结核分支杆菌抗原85B真核表达质粒的构建

目的:构建结核分支杆菌分泌性抗原85B的真核重组表达质粒。方法:设计85B的特异引物,采用多聚酶链反应(PCR)技术从含85B基因质粒DNA中扩增85B基因片段,克隆至pMD18-T载体,经测序分析后,亚克隆至真核表达载体pVAX1,PCR和双酶切鉴定阳性菌株。结果:PCR扩增获得85B的基因片段,测序获得的正确片段被亚克隆至真核表达质粒pVAX1构建真核重组表达质粒pVAX1-85B。结论:成功构建了85B的真核重组表达质粒pVAX1-85B。     

真核表达质粒pVAX1-Der p 1的构建及在真核细胞中的表达

目的:构建真核表达质粒pVAX1-Der p 1，检测质粒编码的重组蛋白在真核细胞293T中的表达，为进一步的动物实验打下基础。方法:分离屋尘螨总RNA，根据GenBank已公布的Der p 1核酸序列设计引物，PCR扩增Der p 1编码基因，以其全长为目的基因，定向克隆至真核表达载体pVAX1，将其转化大肠杆菌DH...     

重组乙肝表面抗原真核表达质粒的构建及表达

采用限制性内切酶从重组的真核表达质粒pcDNA-S2S中分离出经过测序鉴定的乙肝表面抗原中蛋白（preS2 S)基因片段,将其亚克隆于pVAX1真核表达载体,构建编码乙肝表面抗原中蛋白的卡那霉素抗性真核表达质粒pVAX-S2S,酶切鉴定后将重组质粒体外转染COS7细胞,ELISA法检测上清液中的HBsAg呈阳性,说明重组质粒pVAX-S2S在体外能够有效表达HBsAg,为进一步的体内免疫反应打下基础。     

人碱性成纤维细胞生长因子真核表达载体的构建及表达

目的: 构建研究人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)真核表达载体,并在体外进行表达和检测.方法: 从骨髓基质干细胞中分离总RNA,进行RT-PCR 获得人bFGF cDNA.测序证实其结果正确后,构建真核表达载体.并经BamHⅠ/EcoRⅠ双酶切、PCR及测序鉴定.利用Blast程序,搜索NCBI GenBank中与重组质粒(pVAX1-bFGF)中编码bFGF基因同源的序列.通过脂质体将重组质粒转染入骨髓基质干细胞,使用间接免疫荧光法进行表达产物检测.结果: 经EcoRⅠ/Pst BamHⅠ/EcoRⅠ双酶切、PCR及测序鉴定证实,人bFGF基因成功地克隆到真核表达载体pVAX1中;pVAX1- bFGF中编码bFGF的序列与GenBank中所报道的bFGF编码序列完全一致;间接免疫荧光结果显示转染重组质粒的细胞表面有绿色荧光.结论: 成功地构建了人bFGF真核表达载体,其可以在体外进行表达.     

重组人HIF-1α真核表达质粒的构建和鉴定

目的： 构建重组人HIF-lα 真核表达质粒,为进行人HIF-lα基因的克隆与表达做准备。 方法： 从人外周血细胞中提取总RNA,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法反转录合成cDNA。分别以含有绿色荧光蛋白(EGFP)片段的质粒PIREGFP质粒和反转录合成的cDNA 为模板,加入所设计的3对引物［EGFP-linker、HIF-1α)上游(up)和下游(down)引物］所扩增目的基因片段分别与T载体连接后转化大肠杆菌DH5α,LB/Amp平板培养基筛选菌落,提取质粒。测序正确后经酶切先后克隆进入pVAX1载体。 结果：通过聚合酶链反应(PCR)分别获得约870、1 199和672 bp的特异性DNA片段,分别与T载体连接后测序,测序结果与GenBank所提供的基因序列相同。将以上3个片段依次连入pVAX1载体后,所得质粒经酶切鉴定后获得约1 800 bp　片段,与预想结果一致。结论：成功构建了重组人HIF-1α真核表达质粒pVAX1-EGFP-linker-HIF-1α。     

新城疫病毒HN基因真核表达质粒的构建及其抗肿瘤作用的初步研究

构建新城疫病毒血凝素神经氨酸酶基因真核表达质粒,并初步探索其在抗肿瘤治疗中的机制及应用价值。方法：用ＲＴ－ＰＣＲ从ＮＤＶ中克隆ＨＮ ｃＤＮＡ,并构建ＨＮ的真核表达载体,转染ＣＯＳ－７细胞表达,注射至小鼠Ｂ１６黑素瘤模型,检测其抗肿瘤作用。结果成功地克隆了ＮＤＶ ＨＮ ｃＤＮＡ,所构建的ｐｃＤＮＡ３－ＨＮ有良好的表达,动物实验显示,ｐｃＤＮＡ３－ＨＮ有增强荷瘤小鼠ＣＴＬ,ＮＫ杀伤活性的作用。结论ＮＤ     

弓形虫GRA7真核表达质粒的构建

目的:构建弓形虫致密颗粒抗原GRA7的真核重组表达质粒。方法:设计GRA7的特异引物,采用多聚酶链反应(PCR)技术从弓形虫RH株基因组DNA中扩增编码GRA7的基因片段,经克隆至pMD18-T载体后,亚克隆至真核表达载体pVAX1而构建真核重组表达质粒pVAX1-GRA7。结果:PCR扩增出GRA7基因的特异片段,所获克隆的序列正确,并被亚克隆到真核表达载体pVAX1,构建了真核重组表达质粒pVAX1-GRA8。结论:成功构建了GRA7的真核重组表达质粒pVAX1-GRA7。     

人NKG2D真核表达载体的构建及其在COS-7细胞中的瞬时表达

目的 :构建人NKG2D重组真核表达载体 ,并研究其在COS 7细胞中的表达。方法 :应用RT PCR ,自健康人外周血单个核细胞 (PBMC)中获取NKG2DcDNA ,应用基因重组技术构建含目的基因的T载体克隆后 ,构建含目的基因的真核细胞表达质粒 ,并经酶切和测序证实。然后应用脂质体介导将重组真核表达质粒转染COS 7细胞 ,用RT PCR和流式细胞术 (FCM)检测转染细胞NKG2D表达。结果 :重组真核表达载体中插入片段序列与GeneBank登录的cDNA序列一致。NKG2D在COS 7细胞中获得表达。结论 :成功地构建了重组表达载体pcD NA3.1 NKG2D ,并实现了在COS 7细胞中的瞬时表达 ,为研究NKG2D的生物学活性奠定了基础。