小鼠GM—CSF cDNA重组逆转录病毒的构建及在成纤维细胞中的表达

为探索粒－巨噬细胞集落刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）基因治疗的可能性，将小鼠ＧＭ－ＣＳＦｃＤＮＡ重组于缺陷型逆转录病毒载体ｐＬＸＳＮ中，重组质粒转染病毒包装细胞ＰＡ３１７，经Ｇ４１８筛选，用其抗性克隆培养上清液感染小鼠成纤维细胞ＮＩＨ３Ｔ３筛选出抗Ｇ４１８的转化细胞克隆，用ＰＣＲ和Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ证明转化细胞的基因中整合有ＮｅｏＲ基因和ＧＭ－ＣＳＦ基因，原位杂交显示转化细胞有较强的ＧＭ－ＣＳＦｍ     

小鼠GM─CSFcDNA重组逆转录病毒的构建及在成纤维细胞中的表达

为探索粒－巨噬细胞集落刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）基因治疗的可能性，将小鼠ＧＭ－ＣＳＦｃＤＮＡ重组于缺陷型逆转录病毒载体ｐＬＸＳＮ中，重组质粒转染病毒包装细胞ＰＡ３１７，经Ｇ４１８筛选，用其抗性克隆培养上清液感染小鼠成纤维细胞ＮＩＨ３Ｔ３，筛选出抗Ｇ４１８的转化细胞克隆，用ＰＣＲ和Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ证明转化细胞的基因组中整合有ＮｅｏＲ基因和ＧＭ－ＣＳＦ基因，原位杂交显示转化细胞有较强的ＧＭ－ＣＳＦｍＲＮＡ表达，用骨髓细胞增殖法和ＣＦＵ－ＧＭ检测也表明转化细胞分泌有较多的ＧＭ－ＣＳＦ，该研究为下一步在动物体内进行ＧＭ－ＣＳＦ基因治疗的研究奠定基础     

癌胚抗原cDNA真核表达重组质粒的构建

目的：将人特异表达的癌胚抗原（ＣＥＡ）－ｃＤＮＡ克隆到逆转录病毒质粒载体ｐＬＸＳＮ中,构建成真核表达重组质粒ｐＬＸＳＮ－ＣＥＡ,为进一步表达表达人ＣＥＡ的动物肿瘤细胞模型作准备。方法：用内切酶ＥｃｏＲＩ酶切质粒ｐＬＸＳＮ及ｐ９１０２３Ｂ－ＣＥＡ－１７,得到线状载体ｐＬＸＳＮ及外源基因ＣＥＡ－ｃＤＮＡ,然后通过连接酶的连接反应将ＣＥＡ－ｃＤＮＡ插入到ｐＬＸＳＮ的ＥｃｏＲＩ位点,用ＥｃｏＲＩ和ＢａｍＨＩ鉴定。结果：成功地将ＣＥＡ－ｃＤＮＡ克隆到ｐＬＸＳＮ中,通过鉴定筛选获得有意义的正向重组质粒ｐＬＸＳＮ－ＣＥＡ。结论：利用基因克隆技术能将人ＣＥＡ－ｃＤＮＡ定向插入逆转录病毒质粒载体中,构建成真核表达重组质粒ｐＬＸＳＮ－ＣＥＡ,为进一步建立ＣＥＡ阳性动物肿瘤细胞模型及研究ＣＥＡ阳性肿瘤的免疫防治奠定了基础。     

逆转录病毒介导的TNFa基因在胶质瘤细胞系（C6）中的表达及对肿瘤细胞恶性生长的影响

利用逆转录病毒载体ＬＸＳＮ构建了含有完整编码ＴＮＦｃＤＮＡ的重组逆转录病毒质粒ｐＬＸＳＮ－ｔｎｆ，用Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ将重组质粒导入病毒包装细胞ｐＡ３１７，经Ｇ４１８筛选培养获得抗性克隆，用ＮＩＨ３Ｔ３细胞测定病毒滴度，获得滴度为５×１０５ＣＦＵ／ｍｌ的细胞克隆。利用病毒上清液感染大鼠胶质瘤细胞系Ｃ６，得到Ｇ４１８抗性克隆细胞Ｃ６ｐＬＸＳＮ－ｔｎｆ，经ＰＣＲ检测，ＴＮＦｃＤＮＡ完整地整合在细胞基因组中。测定Ｃ６ｐＬＸＳＮ－ｔｎｆ细胞上清中ＴＮＦ的生物活性，结果显示ＴＮＦ有相对稳定的表达（４８～１８０Ｕ／ｍｌ１０６ｃｅｌｌｓ／２４ｈ）。实验还显示经ＴＮＦ基因转导的Ｃ６ｐＬＸＳＮ－ｔｎｆ细胞生长速度较之亲本肿瘤细胞Ｃ６明显下降，基因修饰后的肿瘤细胞在Ｗｉｓｔａｒ大鼠体内形成肿瘤的能力明显受到抑制。进一步用超离心法浓缩病毒对胶质瘤移植模型进行了体内治疗研究。     

人类bcl—2蛋白在CHOdhfr^—细胞中的表达

目的：建立表达人类ｂｃｌ－２蛋白的哺乳类细胞模型，为探讨ｂｃｌ－２的作用机制及其与其它基因间的关系奠定基础。方法：通过将９１０ｂｐ的含有完整开放阅读框的人类ｂｃｌ－２ ｃＤＮＡ以正向克隆逆转录病毒载体ｐＬＸＳＮ的ＥｃｏＲＩ位点而构建重组真核表达载体ｐＬＸＳＮ／ｓ－ｂｃｌ－２。利用电穿孔技术将ｐＬＸＳＮ／ｓ－ｂｃｌ２转染于ＣＨＯｄｈｆｒ＾－细胞，筛选＋出Ｇ４１８抗性克隆，经免疫印迹检测人类ｂｃｌ－２     

核酶对膀胱癌细胞系多药耐药性的逆转研究

目的：探讨核酶对膀胱癌多药耐生的逆转效应。方法：设计针对ｍｄｒ１ｍＲＮＡ１９５９位ＧＵＣ的“锤头状”（Ｈａｍｍｅｒｈｅａｄ）核酶（Ｒｉｂｏｚｙｍｅｌ,ＲＺ１）基因,定点克隆于逆转录病毒载体ｐＬＸＳＮ的ＢａｍＨＩ和ＥｃｏＲＩ位点上,重组出带有核酶基因的逆转录病毒质粒ｐＬＸＳＮ－ＲＺ１。应用脂质体ＤｏＴａｐ将ｐＬＸＳＮ－ＲＺ１导入到耐药的人膀胱癌细胞少。结论：本研究中设计的核酶能明显逆转膀胱癌细胞系多     

逆转录病毒介导的vIL—10表达对小鼠MLC和心脏移植存活？…

目的：探讨逆转录病毒介导的病毒白介素１０（ｖＩＬ－１０）基因表达对小鼠混合淋巴细胞培养（ＭＬＣ）反应和心脏移植存活期的影响。方法：将ｖＩＬ－１０ ｃＤＮＡ克隆到逆转录病毒载体ｐＬＸＳＮ，取ｖＩＬ－１０重组逆转录病毒上清加入ＢＡＢＬ／ｃ和ＣＢＡ／Ｊ混合淋巴细胞中培养，液闪测量。在新生ＣＢＡ／Ｊ小鼠心脏移植时，将ｖＩＬ－１０上清１０μＬ（１０００ｐｆｕ）注入移植心脏内，观察其对心脏移植存活期的影响。结     

人白细胞介素—15cDNA真核表达载体的构建及其在肺癌细胞？…

目的 观察人ＩＬ－１５ｃＤＮＡ在腺癌细胞内的表达,方法将人ＩＬ－１５ｃＤＮＡ于ＥｃｏＲⅠ、ＢａｍＨＩ位点正向克隆到逆转录病毒载体ｐＬＸＳＮ构建ＰＬ－ＩＬ－１５－ＳＭ的重组质粒。以Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ介导将该重组质粒转染到人肺鳞癌细胞（ＰＧ细胞系）和小鼠肺腺癌细胞（ＬＡ７９５细胞系）。经Ｇ４１８条件培养筛选,获得阳性细胞克隆。再经ＣＴＬＬ－２细胞增殖法阳性细胞ＩＬ－１５的表达活性。结果 获得３个ＰＧ     

人硫氧还蛋白及其变异体对TF—1和NFS60细胞的凋亡抑制和？…

目的：比较ｒｈＴＲＸ与ｒｈＴＲＸδ３对细胞因子依赖株ＴＦ－１细胞、ＮＦＳ６０细胞撤除细胞因子所诱导调亡的抑制及促细胞增殖作用。方法：在大肠杆菌中克隆并表达重组ｈＴＲＸ和ｈＴＲＸδ３，纯化ｒｈＴＲＸ和ｒｈＴＲＸδ３蛋白，ＦＡＣＳ检测凋亡细胞，ＭＴＴ法检测细胞增殖。结果：在依赖ＩＬ－３、ＧＭ－ＣＳＦ生长的ＴＦ－１细胞（人红白血病细胞）和依赖Ｇ－ＣＳＦ生长的ＮＦＳ６０细胞（小鼠白血病细胞）撤除细胞因子后     

人白细胞介素-15cDNA真核表达载体的构建及其在肺癌细胞中的表达

目的观察人ＩＬ－１５ｃＤＮＡ在腺癌细胞内的表达。方法将人ＩＬ－１５ｃＤＮＡ于ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ位点正向克隆到逆转录病毒载体ｐＬＸＳＮ,构建ｐＬ－ＩＬ－１５－ＳＮ的重组质粒。以Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ介导将该重组质粒转染到人肺鳞癌细胞（ＰＧ细胞系）和小鼠肺腺癌细胞（ＬＡ７９５细胞系）。经Ｇ４１８条件培养筛选,获得阳性细胞克隆。再经ＣＴＬＬ－２细胞增殖法测阳性细胞ＩＬ－１５的表达活性。结果获得３个ＰＧ细胞和４个ＬＡ７９５细胞阳性克隆,ＩＬ－１５活性测定显示其表达水平在２４ｈ内分别在１４２～２０１或１３８～１７８Ｕ／（ｍｌ·１０６细胞）。结论ＩＬ－１５ｃＤＮＡ转导的人和小鼠肺癌细胞可表达有生物学活性的ＩＬ－１５。     

VCAM-1修饰人脐血基质细胞扩增移植重建造血微环境功能的研究

本课题利用人脐带血丰富的细胞资源从一全新的角度探讨重建造血微环境功能的措施和机理 ,为造血损伤的救治寻求更有效的辅助治疗途径。实验采用吸附单克隆抗体 磁珠分离系统 (ＭＡＣＳ)分离人脐血ＣＤ34+ 细胞行基质细胞体外液体培养扩增 ,构建ＶＣＡＭ 1ｃＤＮＡ重组逆转录病毒载体ｐＬＸＳＮ并成功转染扩增后的脐血基质细胞 ,在检测转染后ＶＡＣＭ 1基因表达水平达到要求后移植 1× 10 7个给我们事先建立的放、化疗诱导的骨髓造血微环境损伤的动物模型 (ＢＡＬＢ/ｃ -ｎｕ/ｎｕ裸鼠 ) ,观察其重建造血微环境促进造血功能重建的效应和机理…     

转hGM－CSF基因人膀胱癌细胞株的建立及其生物学特性

采用逆转录病毒载体将ｈＧＭ－ＣＳＦ基因导入人膀胱癌细胞株ＢＩＵ－８７细胞中，建立转基因细胞株ＢＩＵ／ＧＭ。经ＰＣＲ－ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｌｏｔ杂交证实ＧＭ－ＣＳＦ基因已整合到ＢＩＵ／ＧＭ细胞基因组中。经流式细胞仪细胞ＤＮＡ周期分析表明，转基因前后ＢＩＵ－８７细胞增殖状态无变化。免疫荧光检测发现ＧＭ－ＣＳＦ基因导入及表达不能促进ＢＩＵ－８７细胞表面ＨＬＡ－ＡＢＣ、ＤＲ、ＤＱ抗原的表达。转基因细胞经６０Ｇｙ／ｓＸ线灭活后，丧失增殖能力，但能维持一定水平的ＧＭ－ＣＳＦ分泌活性达２周。本文为进行转基因瘤苗的深入研究奠定了初步基础。     

贮脂细胞TGF-1反义基因转移及对细胞外基质合成的抑制作用

目的探讨ＴＧＦβ１在肝纤维化贮脂细胞激活和细胞外基质产生中的作用。以及对细胞外基质基因的表达和自身ｍＲＮＡ表达的作用。方法将ＴＧＦβ１的基因序列反向插入逆转录病毒载体ｐＬＸＳＮ,构建反义ＴＧＦβ１的逆转录病毒载体ｐＬＡＴＳＮ,用ＰＡ３１７包装细胞包装,获得高滴度的逆转录病毒。将携有反义ＴＧＦβ１ｃＤＮＡ的逆转录病毒载体ｐＬＡＴＳＮ导入人的贮脂细胞株ＬＩ９０内,选择稳定转染的贮脂细胞株培养,应用ＰＣＲ、ＲＴＰＣＲ检测反义基因的表达,用ＥＬＩＳＡ、免疫组织化学和原位杂交等方法检测ＴＧＦβ１和细胞外基质的产生。结果贮脂细胞株ＬＩ９０内有反义ＴＧＦβ１的表达,且其合成分泌ＴＧＦβ１和细胞外基质如ＦＮ、ＣｏｌＡ１降低。结论反义ＴＧＦβ１ＲＮＡ可以抑制贮脂细胞的激活和内源性ＴＧＦβ１和细胞外基质的产生,为抗纤维化基因治疗提供理论基础     

逆转录病毒介导癌基因疗法体外安全实验

从逆转录病毒ｐＬＸＳＮ与人ＩＬ－２ｃＤＮＡ基因进行重组，包括ＰＡ３１７细胞，建立逆转录病毒包装体系细胞ＰＡ３１７／ｐＬＩＬ－２ＳＮ。用病毒上清液转导人淋巴细胞（ＴＩＬ，ＰＢＬ）和３株人腺癌细胞株（ＳＰＣ－Ａ１，ＭＫＮ－ＨｅｐＧ２）对转ＩＬ－２基因的淋巴细胞（ＴＩＬ／ＩＬ－２，ＰＢＬ／ＩＬ－２）和转ＩＬ－２基因的人癌细胞（ＳＰＣ－Ａ２／ＩＬ－２，ＭＫＮ－４５／ＩＬ－２，ＨｅｐＧ２／ＩＬ２）进行体外安     

肿瘤坏死因子α基因转染人脑胶质瘤浸润淋巴细胞的实验研究

采用脂质体转染技术将能表达肿瘤坏死因子α（ＴＮＦ－α）基因的重组逆转录病毒质粒ｐＬ（ＴＮＦ－α）ＳＮ导入病毒包装细胞ＰＡ３１７，在细胞培养上清液中得到重组病毒，滴度为１．４×１０９ＣＦＵ／Ｌ。将此病毒上清液感染人脑胶质瘤浸润淋巴细胞（ＴＩＬ），用Ｇ４１８筛选出能表达标记基因ＮｅｏＲ的阳性克隆，ＥＬＩＳＡ法测得ＮｅｏＲ阳性ＴＩＬ培养上清液中存在ＴＮＦ－α，可达５３０ｎｇ／Ｌ，Ｌ９２９依赖细胞法并测出上清液中有ＴＮＦ－α生物学活性。结果表明，我们构建的重组逆转录病毒可介导ＴＮＦ－α基因在人脑胶质瘤ＴＩＬ中的表达     

小鼠骨髓基质细胞系QXMSC1促进骨髓移植后的造血重建

目的：观察骨髓基质细胞系ＱＸＭＳＣ１在骨髓移植后早期能否加速造血重建。方法：用脾克隆形成单位测定ＱＸＭＳＣ１对造血干细胞的影响。计数每根股骨有核细胞数，用半固体琼脂克隆形成法测定粒单系祖细胞（ＣＦＵ－ＧＭ），微量甲基纤维素法测定红系祖细胞（ＣＦＵ－Ｅ及ＢＦＵ－Ｅ）。结果：ＱＸＭＳＣ１细胞可明显增加ＣＦＵ－Ｓ克隆数。在骨髓移植后第１０天，ＱＸＭＳＣ１可增加骨髓有核细胞数，增加ＣＦＵ－ＧＭ、ＣＦＵ－Ｅ     

人肝癌细胞肿瘤抑制基因转染对阿霉素敏感性的影响

目的为了解肿瘤抑制基因ｐ５３和Ｒｂ基因与肝癌对药物敏感性之间的关系，本实验用逆转录病毒介导将野生型ｐ５３或Ｒｂ基因导入人肝癌细胞株ＳＭＭＣ７７２１并观察其药物敏感性的改变。方法将野生型ｐ５３ｃＤＮＡ或ＲｂｃＤＮＡ克隆在逆转录病毒载体ｐＬＸＳＮ，转染人肝癌细胞株ＳＭＭＣ７７２１，筛选阳性克隆，同时以空载体ｐＬＸＳＮ和反义ｐ５３基因作为对照，免疫组化检测ｐ５３或Ｒｂ基因的表达。加入化疗药物４８ｈ后掺入３Ｈ－ＴｄＲ，１８ｈ后检测ＣＰＭ值。结果成功地构建了分别含野生型ｐ５３、Ｒｂ或反义ｐ５３的逆转录病毒载体，转染ＳＭＭＣ７７２１细胞系后获得了ｐ５３或Ｒｂ的表达；与亲代７７２１细胞相比，ｐ５３或Ｒｂ的表达阳性的７７２１细胞的生长速度均明显减慢，ｐ５３表达阳性的７７２１细胞对阿霉素的敏感性明显增强，同样条件下，Ｒｂ在７７２１细胞系内的表达则对阿霉素敏感性无影响。结论野生型ｐ５３基因转染能提高人肝癌７７２１细胞对阿霉素的敏感性     

Egr—1启动子库列调控造血生长因子表达的实验研究

目的 探索辐射诱导基因调控元件启动的造血生长因子表达及其对造血恢复的作用。方法 该实验将携带Ｅｇｒ－１调控序列启动的ＦＬＴ３配基（ＦＬ）和ＧＭ－ＣＳＦ双顺反子载体（Ｅｇｒ－ＦＧ）导入骨髓基质细胞系ＨＦＣＬ（称为ＨＦＧＬ／ＥＦＧ）。采用ＲＴ－ＰＣ、ＥＬＩＳＡ及细胞半殖法观察ＦＬ和ＧＭ－ＣＳＦ ｃＤＮＡ在转染细胞中的表达及保护造血作用。结果 构建了Ｅｇｒ－１调控序列启动的双顺子反子基因表达载体（Ｅｇｒ     

人神经生长因子基因真核细胞表达载体的构建与鉴定

目的：构建携带人神经生长因子（ｈ Ｎ Ｇ Ｆ） 基因的真核细胞表达载体,为应用 Ｎ Ｇ Ｆ 进行老年性痴呆（ Ａ Ｄ） 等疾病基因治疗打基础。方法：应用基因重组技术将ｈ Ｎ Ｇ Ｆｃ Ｄ Ｎ Ａ 克隆到逆转录病毒载体ｐ Ｌ Ｘ Ｓ Ｎ 中,用限制性内切酶酶切分析重组质粒ｐ Ｌ Ｎ Ｇ Ｆ Ｓ Ｎ 中ｈ Ｎ Ｇ Ｆ基因的插入方向,用 Ｐ Ｃ Ｒ、斑点杂交和 Ｓｏｕｔｈｅｒｎ 杂交对重组质粒ｐ Ｌ Ｎ Ｇ Ｆ Ｓ Ｎ 作进一步鉴定。结果：ｈ Ｎ Ｇ Ｆｃ Ｄ Ｎ Ａ已正确地克隆到逆转录病毒载体ｐ Ｌ Ｘ Ｓ Ｎ 中,而构建成重组逆转录病毒载体ｐ Ｌ Ｎ Ｇ Ｆ Ｓ Ｎ。结论：真核细胞表达载体ｐ Ｌ Ｎ Ｇ Ｆ Ｓ Ｎ 的成功构建,为进一步开展 Ｎ Ｇ Ｆ基因治疗 Ａ Ｄ 等中枢神经系统疾病奠定了基础。     

IFN—α及其联合GM—CSF对CML患者骨髓细胞凋亡相关基因？…

目的：探讨ＩＦＮ－α及ＩＦＮ－α联合ＧＭ－ＣＳＦ调节慢性期慢性粒细胞白血病（ＣＭＬ－ＣＰ）患者骨髓单个核细胞（ＭＮＣｓ）ｂｃｒ－ａｂｌ,ｂｃｌ－２和ｃ－ｍｙｃ基因表达的影响。方法：淋巴细胞分离液离心富集１４例ＣＭＬ－ＣＰ患者骨髓ＭＮＣｓ,经干扰素－α（ＩＦＮ－α）及ＩＦＮ－α联合粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）培养２４ｈ后,采用相对定量逆转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）及扩增片段光密