shRNA沉默ADAM17基因对人乳腺癌细胞MCF-7增殖的影响

目的 利用shRNA干扰沉默人乳腺癌细胞MCF-7的解聚素-金属蛋白酶17(adisintegrin and metalloproteinases 17,ADAM17)基因,观察其对细胞增殖的影响.方法 针对ADAM17基因设计合成具有特异性的ADAM17-shRNA,经脂质体LipofectamineTM 2000转染MCF-7细胞.实验设对照组(空白PBS)、干扰组(转染干扰无义序列ADAM17-shNC)、实验组(转染ADAM17-shRNA),采用Reahime PCR检测各组细胞AD-AM17 mRNA的表达水平,四甲基偶氮唑盐比色法(MTT)检测细胞的增殖活性,流式细胞仪检测细胞周期变化.结果 实验组ADAM17 mRNA的相对表达量显著低于对照组和干扰组,差异有统计学意义(P＜0.05);实验组的MCF-7细胞增殖活性较其他两组明显降低,差异有统计学意义(P＜0.05);实验组的MCF-7细胞进入S期(23.60±1.09)％和G2/M期(6.30±0.82)％的比例降低,绝大多数细胞停留在G0/G1期(65.17±1.35)％,细胞周期延缓,与对照组、干扰组相比较差异具有显著性意义(P＜0.05).结论 ADAM17-shRNA对人乳腺癌细胞MCF-7的ADAM17基因具有沉默作用,从而抑制MCF-7细胞的增殖活性,延缓细胞周期进展.     

应用RNAi敲减MARCH6基因对乳腺癌MCF-7细胞增殖及#br# 周期的影响

目的：应用慢病毒介导的RNAi技术,在乳腺癌MCF-7细胞中敲减MARCH6基因的表达,研究其对MCF-7细胞增殖及细胞周期的影响。方法：靶向MARCH6基因的shRNA慢病毒转染293T细胞后,在荧光显微镜下观察转染效率;收集慢病毒液感染MCF-7细胞后,应用实时荧光PCR和Western印迹验证RNAi敲减MARCH6基因后,MARCH6基因mRNA和蛋白的表达影响;应用MTT,BrdU细胞增殖实验检测细胞增殖能力的变化;采用增殖指数染色流式细胞术检测细胞周期和增殖的改变。结果：通过在荧光显微镜下观察,MARCH6 shRNA慢病毒质粒成功转染293T细胞,与同明视野对比,可见80%左右的细胞带绿色荧光;感染MCF-7细胞,90%的细胞均带绿色荧光; 实时荧光PCR和Western印迹验证了MARCH6 shRNA慢病毒感染MCF-7细胞后,MARCH6在转录水平和蛋白水平表达均显著下降;MTT实验、BrdU法结果显示MARCH6基因敲减组的MCF-7细胞增殖显著下降(P<0.01),流式细胞术分析显示MARCH6敲减后MCF-7细胞出现细胞周期抑制,细胞分裂处于G1期细胞数明显增多,增殖指数显著降低。结论：敲减乳腺癌MCF-7细胞的MARCH6基因表达后,抑制了MCF-7细胞的增殖,并引起细胞周期G1期阻滞。提示MARCH6通过影响细胞周期的进展,促进乳腺癌细胞的增殖。     

RNA干扰hTERT基因对人乳腺癌细胞株MCF-7周期及凋亡影响的研究

目的观察载体介导的RNA干扰技术能否有效抑制人乳腺癌细胞株MCF-7的hTERT的表达及其对细胞周期及凋亡的影响。方法构建2个针对hTERT基因表达短发夹状siRNA的真核表达载体(pshRNA-hTERT)并转染人乳腺癌细胞株MCF-7,通过RT-PCR检测该基因mRNA,Western blot蛋白质检测,端粒酶活性检测,流式细胞仪检测细胞周期及凋亡等方法检测RNAi效果,从中筛选出基因沉默效果好的靶位点。结果转染乳腺癌细胞后,pshRNA-hTERT1,2质粒均能抑制hTERT基因表达,mRNA表达分别下调了54.6%,55.2%;蛋白表达分别下调46.6%,47.8%。端粒酶活性均明显下降。对乳腺癌细胞周期中S期细胞明显减少,G1/G0期细胞显著增加。结论 RNAi在体外明显抑制乳腺癌细胞中hTERT基因的表达和瘤细胞增殖。     

CHK1 shRNA对HeLa细胞凋亡和细胞周期的影响

目的 采用RNA干扰(RNA interference, RNAi)技术沉默CHK1基因的表达,观察其对高表达CHK1的宫颈癌细胞系HeLa细胞增殖、凋亡的影响.方法 构建针对CHK1的短发夹状RNA(short hairpin RNA, shRNA)真核表达质粒,将该质粒通过脂质体转染法导入HeLa细胞,以RT-PCR和Western blot法分别检测其CHK1基因和蛋白的表达,流式细胞仪检测细胞凋亡和细胞周期的变化,MTT法检测细胞的增殖.结果 shRNA能明显降低HeLa细胞表面CHK1的表达,与对照组和空载体转染组相比, shRNA转染组HeLa细胞CHK1 mRNA水平下降了66%,蛋白水平下降了60%(P<0.05).此外,shRNA转染组的HeLa细胞凋亡率明显增加,增殖活性明显降低, 而且G2/M期细胞百分率显著下降.对照组、空载体转染组和shRNA转染组的G2/M期细胞百分率分别为(53.96±1.35)%、(54.08±1.39)%和(15.10±0.87)%(P<0.05).结论 CHK1shRNA能明显增加HeLa细胞的凋亡,抑制该细胞的增殖,削弱其G2/M期阻滞,为进一步研究CHK1在肿瘤治疗中的作用机制提供实验基础.     

UbcH10基因沉默对肺癌NCI-H226细胞增殖及细胞周期的影响

目的：通过脂质体转染siRNA方法沉默人肺鳞癌细胞NCI-H226中UbcH10基因,观察基因沉默后细胞增殖活性的变化及其对细胞周期的影响。方法：设计3条针对UbcH10基因CDS区不同位点的siRNA序列并构建shRNA表达载体,脂质体法转染重组质粒至NCI-H226细胞。转染后48小时,RT-PCR,Western-blot检测细胞内UbcH10 mRNA及蛋白含量。使用有效siRNA序列（pshRNA2）转染细胞,转染后24、48小时CCK-8检测细胞活性。使用有效siRNA序列转染细胞,转染后48小时收集细胞,流式法检测细胞周期。结果：成功构建shRNA重组质粒并转染NCI-H226细胞。转染siRNA 48小时后,3组NCI-H226细胞中UbcH10基因的mRNA及蛋白含量均明显下降;其中2号siRNA序列的沉默效果最好,UbcH10基因剩余表达量为对照组的14%。使用有效序列转染NCI-H226细胞24、48小时,细胞增殖活性明显降低,与基因未干预组比较,差异显著（P＜0.05）。使用有效序列转染NCI-H226细胞48小时,细胞明显阻滞于G2期,与基因未干预组比较有显著差异（P＜0.05）。结论：UbcH10基因沉默,可显著抑制NCI-H226细胞增殖活性,并使肺癌细胞阻滞于细胞G2期。     

IGF1R-shRNA重组慢病毒的构建及对肺癌A549细胞增殖的影响

目的 构建IGF1R基因的shRNA慢病毒载体,转染A549细胞鉴定沉默效率,观察其对A549细胞增殖能力的影响.方法 设计IGF1R干扰序列,与pGC-LV慢病毒载体重组形成shRNA表达载体,包装shRNA慢病毒颗粒,感染A549细胞,应用RT-PCR和Western blot检测IGF1R干扰效果;细胞生长抑制实验、克隆形成实验及细胞周期检测评价其对A549细胞增殖的影响. 结果 成功构建了IGF1R-shRNA重组慢病毒并高效感染A549细胞,IGF1R mRNA及蛋白表达量分别下降74.51％,70.53％;细胞群体倍增时间显著延长,克隆形成能力显著降低,细胞周期阻滞于G0/G1期. 结论 本研究构建的重组慢病毒能显著抑制IGF1R表达,抑制A549细胞增殖.     

趋化因子受体CXCR7对人乳腺癌细胞生长、凋亡及细胞周期的影响

目的 通过构建CXCR7短发夹状RNA(short hairpin RNA,shRNA)序列的真核表达载体,探讨趋化因子受体CXCR7对人乳腺癌细胞MDA-MB-435s增殖、凋亡、周期的影响.方法 针对CXCR7构建编码shRNA序列的重组表达载体;分别用RT-PCR和Western blot检测CXCR7 mRNA及蛋白表达水平;MTT法检测细胞增殖;TUNEL法检测细胞凋亡;流式细胞术检测细胞周期.结果 构建针对CXCR7短发夹状RNA序列的表达载体,经酶切及测序证实与设计完全一致;将2个CXCR7shRNA载体(CXCR7-shRNA1;CXCR7-shRNA2)转染MDA-MB-435s细胞后,CXCR7 mRNA及蛋白平均降低;抑制CXCR7的表达后,CXCR7-shRNA组细胞增殖率明显下降(P＜0.05),细胞凋亡增多(P＜0.05),细胞周期无明显改变.结论 重组表达载体CXCR7-shRNA1、CXCR7-shRNA2能有效抑制靶基因CXCR7的表达,进而可抑制人乳腺癌MDA-MB-435s细胞的增殖,促进细胞凋亡,而对细胞周期无明显影响.     

短发卡样RNA抑制c-myc癌基因在乳腺癌细胞中的过度表达

目的构建人cmyc癌基因特异性短发卡样RNA(shRNA)真核表达载体,抑制靶基因cmyc在乳腺癌细胞中的过度表达。方法设计有小发夹结构的三条寡核苷酸序列,克隆至空载体pEGFPC1/U6中构建重组体并体外转染乳腺癌细胞株MCF7,48h后分别用RTPCR和Westernblot方法检测胞内cmyc癌基因mRNA水平和蛋白水平。结果①成功构建shRNA真核表达载体;②shRNA表达载体转染MCF7细胞48h后,pEGFPC1/U62能明显下调胞内cmycmRNA水平和蛋白水平(P<0.01)。结论构建的shRNA真核表达载体能显著抑制cmyc癌基因在MCF7细胞中的过表达。     

RNA干扰YAP基因对人乳腺癌MDA-MB-231细胞生物学行为的影响

目的 探讨RNA干扰YAP基因对人乳腺癌MDA-MB-231细胞生物学行为的影响。方法 使用阳离子脂质体转染试剂LipofectamineTM2000将靶向沉默YAP基因的siRNA序列转染至乳腺癌MDA-MB-231细胞中,采用qRT-PCR和Western印迹法分别检测转染后MDA-MB-231细胞中YAP基因及蛋白的表达水平,噻唑蓝(MTT)实验和细胞平板克隆实验检测转染前后细胞增殖的变化,Transwell小室和划痕实验观察转染对细胞侵袭及迁移的影响,流式细胞术评价转染后细胞周期及凋亡的变化情况。结果 转染siRNA后,YAP RNA和蛋白的表达量相对于空白对照及阴性对照组均明显下降(P<0.01)。MTT实验及细胞平板克隆实验显示,siRNA干扰YAP表达可以显著抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞的增殖活性;Transwell小室及划痕试验显示,siRNA干扰YAP的表达可以明显抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞的侵袭及迁移能力;细胞周期实验显示,沉默YAP后,细胞周期出现G₀/G₁期阻滞,细胞凋亡检测证实沉默YAP后细胞凋亡率并未出现明显上升。结论 抑制YAP在乳腺癌细胞的表达可有效降低细胞的增殖、迁移和侵袭能力,改变细胞周期分布,但对细胞凋亡无明显影响。     

转染针对黑色素瘤抗原编码基因的短发夹RNA真核表达载体对SGC7901细胞增殖及凋亡的影响

目的:观察转染针对黑色素瘤抗原编码基因(NRAGE)的短发夹RNA(shRNA)真核表达载体对SGC7901细胞增殖及凋亡的影响.方法:用特异性shRNA 真核表达载体pSuper-EGFP-NRG转染SGC7901胃癌细胞,经G418筛选, 应用RT-PCR方法检测转染细胞NRAGE mRNA的表达,应用流式细胞术检测转染细胞增殖与凋亡.结果:体外培养的pSuper-EGFP-NRG转染的SGC7901胃癌细胞中NRAGE基因被沉默,G0～G1期、G2期细胞百分率降低,S期细胞百分率增多(P<0.05).结论:NRAGE基因参与了SGC 7901细胞周期和细胞凋亡的调控.     

miR-210对乳腺癌细胞生物学行为的影响

目的 探讨microRNA-210(miR-210)对乳腺癌细胞增殖、侵袭和凋亡的影响.方法 采用RNA干扰技术,构建针对miR-210的shRNA真核表达载体,转染MCF-7细胞,采用实时荧光定量PCR技术检测转染后miR-210的表达情况,观察转染后MCF-7细胞的增殖、侵袭和凋亡情况.结果转染后MCF-7细胞中miR-210表达明显下降,同时细胞增殖和侵袭能力减弱、凋亡率上升.结论 miR-210能够影响乳腺癌的生物学行为.     

RunX2的真核表达载体的构建及其对乳腺癌细胞增殖和迁移的影响

目的：构建人 RunX2真核表达载体,观察 RunX2对乳腺癌细胞增殖和迁移的影响。方法运用逆转录 PCR （RT-PCR）扩增、酶切、连接等基因重组技术将人 RunX2基因插入 pcDNA3．1真核表达载体中;并经酶切、PCR、测序鉴定;将构建的 RunX2真核表达载体瞬时转染 MCF-7细胞,利用 Western blot 法检测 RunX2蛋白表达,用 MTT 实验和细胞划痕实验检测其对乳腺癌细胞的生物学影响。结果构建的 RunX2真核表达载体在 MCF-7细胞中高表达 RunX2蛋白;发现高表达 RunX2的 MCF-7细胞活力增加,移动能力增强。结论构建的 RunX2真核表达载体能促进乳腺癌细胞的增殖和迁移。     

GP73通过p53信号通路调节乳腺癌细胞MCF-7的增殖和凋亡

目的 探讨高尔基蛋白73(GP73)对乳腺癌细胞MCF-7的增殖、凋亡的影响及相关机制.方法 利用干扰及过表达GP73质粒转染乳腺癌细胞MCF-7,并利用CCK-8检测处理后细胞的增殖能力,利用流式细胞术方法检测处理组细胞的凋亡水平,利用qRT-PCR和Western印迹法测定GP73和p53 mRNA和蛋白的表达.采用qRT-PCR测定20例临床乳腺癌和癌旁组织中GP73和p53的mRNA水平,并分析乳腺癌组织中GP73和p53的mRNA水平的相关性.结果 过表达GP73后MCF-7较对照组增殖能力上升(P＜0.05),凋亡水平下降(P＜0.05);干扰GP73后MCF-7增殖能力下降(P＜0.05),凋亡率升高.同时过表达GP73和p53的乳腺癌细胞较单独过表达GP73的MCF-7细胞的增殖能力下降,凋亡水平上升.乳腺癌组织中GP73和p53 mRNA表达也呈负相关(r=-0.528,P＜0.01).结论 GP73可能通过p53信号通路调节乳腺癌细胞MCF-7的增殖和凋亡.     

靶向干扰CDK2AP1对乳腺癌MCF-7细胞体外迁移和侵袭的影响

目的：探讨靶向干扰细胞周期调节蛋白依赖性激酶2-关联蛋白-1（CDK2AP1）对乳腺癌MCF-7细胞体外迁移和侵袭的影响。方法构建重组慢病毒 pGCLV- CDK2AP1- shRNA及重组空病毒pGCLV- GFP,分别稳定转染乳腺癌细胞系MCF-7,获得乳腺癌细胞株 MCF-7/RNAi- NC 和 MCF-7/RNAi- CDK2AP1。采用定量 PCR 法检测两组 MCF-7细胞株的CDK2AP1mRNA表达,xCELLigence/RT- CIM实时细胞电子分析系统检测细胞迁移能力,Transwel 实验检测细胞的侵袭能力。结果成功构建乳腺癌细胞株MCF-7/RNAi- NC和MCF-7/RNAi- CDK2AP1,相比MCF-7/RNAi- NC细胞组,MCF-7/RNAi- CDK2AP1细胞组的CDK2AP1mRNA表达受到明显抑制,其细胞迁移和侵袭能力均显著下降（P＜0.05）。结论乳腺癌细胞MCF-7中CDK2AP1低表达能有效抑制细胞的体外迁移和侵袭能力。     

抑制TRIM24基因表达对乳腺癌MCF-7细胞增殖、凋亡、侵袭和迁移的抑制作用

目的：探讨抑制TRIM24基因表达对乳腺癌MCF-7细胞增殖、凋亡、侵袭和迁移的影响,阐明TRIM24基因在乳腺癌发生发展中的作用。方法：以脂质体法转染TRIM24 siRNA和阴性对照NC-siRNA至MCF-7细胞作为si-TRIM24组和NC-siRNA组,以未转染的MCF-7细胞作为对照组。qRT-PCR和Western blotting法检测转染48 h后各组MCF-7细胞中TRIM24 mRNA和蛋白表达水平,MTT法检测各组MCF-7细胞增殖能力,流式细胞术检测各组MCF-7细胞凋亡率,Transwell实验检测各组MCF-7细胞侵袭和迁移数。结果：与对照组和NC-siRNA组比较,si-TRIM24组MCF-7细胞中TRIM24 mRNA和蛋白表达水平明显降低（P<0.05）,MCF-7细胞增殖能力降低（P<0.05）,MCF-7细胞凋亡率明显升高（P<0.05）,MCF-7细胞侵袭和迁移数明显减少（P<0.05）。结论：抑制TRIM24基因表达能够明显抑制乳腺癌MCF-7细胞的增殖、侵袭和迁移,且能够诱导细胞凋亡。     

人波形蛋白重组质粒表达降低乳腺癌的增殖和侵袭

目的癌细胞表达波形蛋白与患者预后差密切相关，为此编码人波形蛋白基因的真核表达质粒载体并评估重组蛋白对肝癌细胞增殖和侵袭潜能的影响。方法将完整的波形蛋白基因开放性阅读框（ORF，1401bp）序列正向克隆到质粒载体pcDNA3．1（＋），重组质粒和对照质粒稳定转染MCF-7乳腺癌细胞株，波形蛋白的表达通过RT-PCR、流式细胞术测定。分剐用MTS细胞增殖试验和标准的序列分析和限制性核酸内切酶消化观察肿瘤细胞体外增殖和侵袭。结果重组波形蛋白的稳定细胞株高表达了Vimentin水平，重组波形蛋白抑制了肿瘤细胞增殖和侵袭能力。结论在体外强制肿瘤细胞表达波形蛋白可以部分逆转其恶性表型。     

RNA干扰下调midkine基因表达对人乳腺癌细胞粘附和侵袭力的影响

目的探讨中期因子（midkine,MK）基因siRNA对乳腺癌细胞生物学行为的影响。方法培养人乳腺癌Bcap-37、LCC1、MCF-7、MDA—MB-231、MDA—MB-435、MDA—MB-468及ZR75—1细胞株,以荧光实时定量PCR方法检测MK基因mRNA表达;筛选出MK表达最高者。采用MK siRNA转染乳腺癌细胞株,分别以荧光实时定量RT—PCR和免疫荧光方法观察MK基因mRNA和蛋白水平,然后以四唑蓝（MTT）比色法检测细胞粘附性,以Boyden小室方法检测癌细胞侵袭能力。结果7株乳腺癌细胞中,MK均有不同程度的表达,以MCF-7细胞最高;以MKsiRNA转染乳腺癌MCF-7细胞后,癌细胞MK基因mRNA和蛋白水平明显下降,且呈浓度依赖性;siRNA转染组细胞粘附数量明显下降,细胞侵袭力明显下降,均呈浓度依赖性（P〈0．01;P〈0．01）。结论MK基因在乳腺癌细胞粘附和侵袭中发挥着重要作用;以siRNA转染乳腺癌细胞,可抑制乳腺癌细胞粘附和侵袭能力。     

短发夹RNA沉默S100A4对乳腺癌MCF-7细胞增殖的影响

目的观察靶向S100A4的shRNA对乳腺癌MCF-7细胞增殖的影响。方法构建S100A4基因特异性shRNA表达载体,检测转染后MCF-7细胞中S100A4的表达水平以及增殖水平和凋亡率的变化。经过脂质体介导将S100A4shRNA表达载体转染人MCF-7细胞,G418筛选及克隆化培养,裸鼠体内成瘤试验检测各组细胞增殖情况。结果经测序鉴定证实成功构建S100A4-shRNA表达载体。所构建的S100A4-shRNA表达载体能够有效抑制MCF-7细胞中S100A4的表达,并且可以显著降低MCF-7细胞增殖水平以及诱导细胞进入晚期凋亡;稳定转染S100A4-shRNA表达载体的MCF-7细胞形态无显著变化,而实验组裸鼠肿瘤体积和重量明显小于空白对照组和阴性对照组。结论S100A4-shRNA表达载体能有效地抑制乳腺癌MCF-7细胞中S100A4的表达,从而降低细胞增殖水平。