ATP-TCA在大肠癌化疗药物敏感性检测中的应用

目的:评估ATP-TCA肿瘤药敏检测法指导制定大肠癌化疗方案的可行性。方法:应用ATP-TCA肿瘤药敏检测法,检测28例大肠癌手术标本和19例大肠癌外周血标本对8种常用抗肿瘤药物的敏感性。结果:大肠癌对抗癌药物的敏感程度存在着异质性,联合用药的敏感率高于单药。外周血标本和手术标本检测结果具有一致性,检测结果与临床疗效基本相符。结论:ATP-TCA肿瘤药敏检测法可用于临床制定大肠癌个体化的化疗方案。     

慢病毒载体介导RNA干扰抑制大肠癌细胞HT29的酪氨酸激酶受体RON基因的表达

目的研究慢病毒介导的RNA干扰(RNAi)对大肠癌细胞RON基因的干扰效率,构建RON基因稳定沉默的大肠癌细胞株。方法应用实时聚合酶链反应(PCR)检测大肠癌细胞DLD-1、HCT116、LOVO、RKO、SW480、HT29的RONmRNA表达情况,筛选出表达丰度能满足RNAi的大肠癌靶细胞HT29。根据人RON基因序列,构建4种慢病毒载体质粒pGCSIL/RON-短发夹RNA(shRNA),转染包装细胞293T,获得4种重组慢病毒pGCSIL/RON-shRNA,分别感染HT29细胞。应用实时PCR检测各组HT29细胞RONmRNA表达情况,筛选出RON干扰效率最高的一种shRNA慢病毒载体质粒,构建RON基因稳定沉默的大肠癌细胞株HT29/RON-shRNA。结果 DLD-1、HCT116、RKO、SW480、HT29细胞RON表达丰度能满足RNAi的需要,选择HT29细胞作为RNAi的靶细胞。阴性对照病毒感染的细胞样品相对正常未感染病毒的细胞目的基因的相对表达水平为(94±5)%,RONshRNA-1靶点病毒感染的细胞为(86±5)%,RONshRNA-2靶点病毒感染的细胞为(67±6)%,RONshRNA-3靶点病毒感染的细胞为(63±6)%,RONshRNA-4靶点病毒感染的细胞为(30±8)%,RONshRNA-4靶点病毒感染的细胞的表达水平显著低于其他细胞(P值均<0.01),其对目的基因的沉默效果达到(70±8)%。结论慢病毒介导RNAi能显著抑制大肠癌细胞HT29的RON基因的表达,慢病毒载体介导的RNAi是一种高效的"基因沉默"的手段。     

RNAi沉默RON基因对人结肠癌HT-29细胞侵袭和耐药性的抑制作用

目的:探讨RNAi沉默酪氨酸激酶受体RON(recepteur d'origine nantais)基因对人结肠癌HT-29细胞侵袭和对抗肿瘤药物敏感性的影响.方法:构建RON基因的RNAi慢病毒载体Lv-RON-siRNA.Real-time PCR和Western blotting检测RON基因的沉默效率及RON蛋白表达水平;Transwell侵袭实验和ATP-TCA(ATP-tumor chemosensitivity assay)检测RON基因对HT-29细胞侵袭和对药物敏感性的影响.结果:慢病毒载体Lv-RON-siRNA感染HT-29细胞对RON基因的沉默效果达到70％.Lv-RON-siRNA感染后,HT-29细胞侵袭力较对照组明显降低(0.97±0.072 vs 1.29±0.076,P＜0.05).Lv-RON-siRNA感染后,HT-29细胞对5-氟尿嘧啶(5-fluorouraci,5-FU)的IC90值和IC50值分别为(14.28 ±1.34)、(8.93±1.20) μg/ml,顺铂(cisplatin,DDP)的IC90值和IC50值分别为(1.91±0.22)、(0.64±0.07) μg/ml,均明显低于对照组(P＜0.01).结论:沉默RON基因表达能抑制HT-29细胞的侵袭力,提高细胞对5-FU和DDP的敏感性.     

肺炎克雷伯菌耐药性分析及质粒介导的 AmpC酶基因型检测

目的了解肺炎克雷伯菌的耐药性和质粒介导的AmpC酶基因型。方法采用K-B法进行抗菌药物敏感试验,用酶提取物三维试验检测AmpC酶,用聚合酶链反应(PCR)产物测序确定AmpC酶基因型。结果产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)阳性率41.90%、AmpC酶阳性率0.95%、ESBLs AmpC酶阳性率2.86%;药敏试验结果显示,对青霉素类、头孢菌素类、酶抑制剂复合剂、氨曲南、氟喹诺酮类均有较高耐药,亚胺培南敏感率100.00%;AmpC酶阳性菌株为质粒介导DHA型AmpC酶。结论可见临床分离的肺炎克雷伯菌中已经出现产质粒介导AmpC酶菌株,其耐药基因可在同种或不同种传播。     

鲍曼不动杆菌产β-内酰胺酶检测及耐药性分析

目的 分析鲍曼不动杆菌对抗菌药物的耐药性及产β-内酰胺酶情况.方法 应用VITEK-32全自动细菌鉴定仪对临床标本进行细菌鉴定和药物敏感试验,用改良三维试验检测产β-内酰胺酶情况.结果 分离到69株鲍曼不动杆菌菌株,对抗菌药物的敏感性以头孢哌酮/舒巴坦最高(46.38%),对亚胺培南和美洛培南敏感率43.48%,头孢他啶30.43%、头孢吡肟33.33%、哌拉西林/他唑巴坦34.78%.三维试验结果54株(78.3%)产β-内酰胺酶,其中9株单产AmpC酶(头孢菌素酶),8株单产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs),17株同时产AmpC酶和ESBLs,20株不能被氯唑西林和克拉维酸联合抑制.结论 鲍曼不动杆菌的耐药率高,特别是出现了泛耐药的菌株(同时产AmpC酶和ESBLs).应加强鲍曼不动杆菌的β-内酰胺酶检测.     

慢性HBV感染患者核苷类药物治疗后相应突变位点检测分析

目的:通过基因测序检测分析拉米夫定(LAM)、阿德福韦(ADV)、恩替卡韦(ETV)、替比夫定(LdT)四种核苷类似物耐药者HBV多聚酶区基因主要耐药突变的分布情况。方法:采用实时荧光定量PCR方法对253例LAM,78例ADV和9例ETV以及6例LdT耐药患者血清HBV多聚酶区进行扩增,对PCR产物进行直接测序。结果:253例LAM耐药患者中有16种突变类型,其中以rtM204I突变最多见,为101例(39.92%)。78例ADV耐药患者中有7种突变类型,其中以rtA181V/T/S突变最多见,为47例(60.25%)。9例ETV耐药患者中有3种突变类型,其中以rtT184A/G/I/S突变最多见,为6例(66.66%)。6例LdT耐药患者中有2种突变类型。结论:四种核苷类似物耐药株的氨基酸突变复杂多样,建议抗病毒治疗失败后参考基因型耐药检测结果更换药物。     

非活动性HBsAg携带者110例肝组织的病理学特征

目的了解非活动性HBsAg携带者的肝组织病理学改变。方法回顾性分析2011年1月至2015年9月110例接受肝脏穿刺活检术的非活动性HBsAg携带者的临床资料及其肝组织炎症活动度（A）与纤维化程度（F）。患者年龄21～66岁,其中男性76例、女性34例;〈A2者73例,≥A2者37例;〈F2者63例,≥F2者47例;血清ALT水平〈WHO正常上限（ULN）标准者59例（WHO标准组,男性30U／L、女性19U／L）,〈我国ULN标准者110例（中国标准组,男性50U／L、女性40U／L）。结果110例中,≥A1者100例（90．9％）、≥A2者37例（33．6％）;≥F1者84例（76．3％）、≥砣者47例（42．7％）。男性A和F的严重程度均高于女性,以F的改变显著（U=2．162,P=0．032;X^2=5．315,P=0．021）。中国标准组与WHO标准组间A和F严重程度的差异均无统计学意义（U=0．951,P：0．341;U=0．435,P=0．663）。随着年龄的增加,A和F的严重程度增加（F=3．705,P=0．014;F=5．915,P=0．001）;≥A2和≥F2的平均年龄分别为（41．7±9．6）岁和（38．7±8．1）岁。影响A和F严重程度的独立危险因素分别是年龄、性别（男性）和年龄。结论大部分非活动性HBsAg携带者存在一定程度的肝脏病理性损伤,对I〉40岁者应进行肝脏炎症和纤维化进展的筛查,尤其是男性。     

自杀基因ePNP的克隆及在人肝癌细胞HepG_2的表达

目的构建含大肠杆菌的嘌呤核苷酸磷酸化酶（ePNP）DNA的重组逆转录病毒载体,观察ePNP基因在人肝癌细胞株HepG2的表达。方法用PCR法获得ePNP亚克隆,构建重组逆转录病毒载体pDsRed-ePNP,鉴定测序。脂质体法将逆转录病毒载体pDsRed-ePNP转染AmphoPackTM-293包装细胞,获得高滴度病毒并感染HepG2细胞。流式细胞术和荧光显微镜检测红色荧光蛋白（RFP）的表达。RT-PCR法检测ePNPmRNA的表达。ATP-生物荧光体外检测实验（ATP-TCA法）检测不同浓度Fludarabine对HepG2、HepG2/pDsRed和HepG2/ePNP细胞的杀伤作用。结果克隆的ePNP基因与文献报道一致,成功构建重组逆转录病毒载体pDsRed-ePNP。病毒包装后滴度为5E＋4TU/mL。表达RFP的HepG2/ePNP阳性细胞率为97.1%。HepG2/ePNP细胞稳定表达ePNP。低浓度Fludarabine对HepG2/ePNP细胞毒效应明显。结论成功构建重组逆转录病毒载体pDsRed-ePNP,并且获得稳定表达ePNP基因的HepG2/ePNP人肝癌细胞株。     

靶向干扰CDK2AP1对乳腺癌MCF-7细胞体外迁移和侵袭的影响

目的：探讨靶向干扰细胞周期调节蛋白依赖性激酶2-关联蛋白-1（CDK2AP1）对乳腺癌MCF-7细胞体外迁移和侵袭的影响。方法构建重组慢病毒 pGCLV- CDK2AP1- shRNA及重组空病毒pGCLV- GFP,分别稳定转染乳腺癌细胞系MCF-7,获得乳腺癌细胞株 MCF-7/RNAi- NC 和 MCF-7/RNAi- CDK2AP1。采用定量 PCR 法检测两组 MCF-7细胞株的CDK2AP1mRNA表达,xCELLigence/RT- CIM实时细胞电子分析系统检测细胞迁移能力,Transwel 实验检测细胞的侵袭能力。结果成功构建乳腺癌细胞株MCF-7/RNAi- NC和MCF-7/RNAi- CDK2AP1,相比MCF-7/RNAi- NC细胞组,MCF-7/RNAi- CDK2AP1细胞组的CDK2AP1mRNA表达受到明显抑制,其细胞迁移和侵袭能力均显著下降（P＜0.05）。结论乳腺癌细胞MCF-7中CDK2AP1低表达能有效抑制细胞的体外迁移和侵袭能力。     

脉冲场凝胶电泳与多基因聚类分析在铜绿假单胞菌株亲缘性研究中的应用

目的:了解分离自临床铜绿假单胞菌分子流行病学特性及菌株亲缘性。方法:对分离自临床的32株铜绿假单胞菌采用Kirby-Bauer法测定抗菌药物的敏感性;利用脉冲场电泳和多耐药基因聚类分析菌株的亲缘性。结果:32株铜绿假单胞菌中有17株对8种以上抗生素耐药,占53.1%,8株(25%)铜绿假单胞菌对检测抗生素全部耐药,为同一耐药表型。脉冲场电泳聚类分析显示,铜绿假单胞菌主要为3个克隆株;而多耐药基因聚类分析显示,铜绿假单胞菌主要为2个簇群,二个簇群内已发生衍化,存在3个克隆传播。结论:分离自临床的铜绿假单胞菌耐药严重,亲缘性分析中多基因聚类分析法分辨率高于脉冲场电泳。