亚致死量放疗对Duchenne型肌营养不良鼠骨髓干细胞移植的影响

[目的]研究7 Gy γ射线放疗对Duchenne型肌营养不良鼠(mdx鼠)骨髓干细胞移植的效果。[方法]获取4~5周昆明鼠的骨髓干细胞,体外培养3 d,移植给7 Gy剂量放疗的7~8周的mdx鼠。22只7 Gy剂量放疗的肌营养不良鼠鼠,随机分为A、B、C、D 4组;A、B、C每组6只,静脉移植骨髓干细胞数为A组:1.2×106/只、B组4.8×106/只、C组1.2×107/只。D组4只作空白移植对照。观察受体鼠存活率,临床监测移植物抗宿主病(GVHD)情况;移植12周后,检测受体鼠肌组织抗肌萎缩蛋白表达情况。[结果]移植3个月后,22只实验鼠全部存活,18只移植鼠有近9％肌纤维表达dystrophin蛋白。[结论]移植前给予7 Gy γ射线放疗照射mdx鼠,部分破坏受体骨髓造血系统后,静脉注射移植同种、非同系鼠的骨髓干细胞,3个月之后,受照射鼠实现了100％存活;且移植鼠均有抗肌萎缩蛋白表达。     

维生素C抗辐射损伤作用研究

目的　通过照前给予VitC ,观察其对60 Coγ射线全身照射小鼠的保护作用。方法　将小鼠随机分为正常对照组、照射对照组、VitC实验组 1,2 ,3(照前连续 10d灌胃VitC 15、30、45mg/kg体重 ) ,检测各组小鼠骨髓嗜多染红细胞微核率 ,并作 30d存活率实验。结果　VitC可显著降低 2 .0Gyγ射线诱发小鼠骨髓细胞微核 ,可提高受照小鼠30d存活率 ,延长平均存活时间 ,保护指数达 2 .0 9。结论　VitC对中、高剂量γ射线的损伤具有一定的防护作用。     

骨髓干细胞移植后mdx鼠腓肠肌病理及Dystrophin的表达变化

【目的】研究骨髓干细胞移植后mdx鼠腓肠肌组织病理变化及dystrophin的动态表达变化。【方法】7～9周mdx鼠20只平均分为4组,放疗后移植1.2×107个/只同种异基因全骨髓干细胞,于移植后4周、8周、12周及16周应用HE染色观察细胞形态及核中心移位(CNF),免疫组化及Westernblot方法检测dystrophin表达变化,C57鼠和未治疗mdx鼠各5只作阳性和阴性对照。【结果】C57鼠腓肠肌横切面可见肌细胞大小形态基本一致,无核中移现象。各细胞移植治疗组和对照组mdx鼠均有大量的炎细胞浸润,核中心移位明显。未治疗mdx鼠CNF最高,可达70%左右,移植后4周、12周和16周,CNF比例分别为55%、50%和44%。免疫荧光结果C57鼠肌膜呈完整的网状绿色荧光,mdx鼠肌膜基本未见绿色荧光;移植后4周肌膜dystrophin阳性纤维数大约占细胞总数的1%,随时间延长表达渐渐增多,8周、12周和16周时阳性细胞数分别占细胞总数的5%、10%和15%。Westernblot结果mdx鼠无dystrophin的表达,野生型C57鼠表达量最多,移植后4周mdx鼠仅见微弱表达,随时间延长表达量渐增,移植后16周表达量较移植8周明显增加。【结论】骨髓干细胞移植后mdx鼠腓肠肌CNF随移植时间延长逐渐减少,dystrophin的表达随时间延长增多,提示骨髓干细胞移植后长久持续参与受损骨骼肌的修复与再生。     

骨髓干细胞移植后mdx鼠抗肌萎缩蛋白的表达

目的研究骨髓干细胞移植治疗Duchenne型肌营养不良鼠(mdx鼠)后抗肌萎缩蛋白表达的动态变化。方法取6~8周龄C57BL/6鼠骨髓干细胞,以2×107个/只干细胞尾静脉移植到经7Gyγ射线预处理后的7~9周龄mdx鼠体内,分别于移植后5、8、12、16周应用免疫荧光、逆转录-聚合酶链反应、Western blot检测腓肠肌抗肌萎缩蛋白的表达情况。结果经γ射线放疗预处理的mdx鼠,在尾静脉移植骨髓干细胞5周后可见抗肌萎缩蛋白少量表达,随移植时间延长表达逐渐增多,16周时肌纤维抗肌萎缩蛋白的表达为12%,并可见肌细胞核中移现象较同龄mdx鼠对照组减少,边居增多。结论同种异体骨髓干细胞移植治疗mdx鼠后,骨髓干细胞通过血液循环趋向病变肌组织,并分化为肌细胞表达抗肌萎缩蛋白。随移植时间延长表达增多,提示骨髓干细胞移植可长久持续参与受损骨骼肌的修复与再生。     

大剂量放疗联合造血干细胞移植动物模型的建立

目的 :建立大剂量放疗联合造血干细胞移植的动物模型。方法 :用60 Coγ射线照射 BALB/ C小鼠 ,模拟大剂量放 /化疗的骨髓衰竭作用 ,摸索60 Coγ射线照射的绝对致死剂量 ,观察造血干细胞移植后存活率及外周血白细胞数目恢复情况。结果 :60 Coγ射线照射的绝对致死剂量最小为 8Gy,造血干细胞移植后小鼠存活率为 80 % ,外周血血象恢复良好。结论 :该动物模型的成功建立为造血干细胞移植的进一步研究提供了新的途径     

环磷酰胺预处理脐血移植小鼠模型的建立及其对骨髓龛位的影响

【目的】建立环磷酰胺 (CTX)预处理脐血移植 (UCBT)小鼠模型 ,并探讨预处理后骨髓龛位腾出的特点和机制。【方法】分别以 10 0 ,2 0 0 ,380mg/kg 3种剂量CTX腹腔注射BALB/c小鼠 ,检测注射后 1周内外周血象、骨髓及外周血CD34 细胞含量、骨髓细胞凋亡及病理学改变。用C5 7BL/ 6鼠脐血 (FNPB)作供体移植经“致死量”CTX预处理的BALB/c鼠 ,动态观察移植后受鼠存活状况、植入水平、造血与免疫功能恢复及移植物抗宿主病 (GVHD)情况。【结果】在CTX处理后 3～ 4d内 ,骨髓造血细胞损伤渐加重 ,血窦结构紊乱 ,细胞碎屑弥漫分布 ,外周血与骨髓CD34 细胞水平进行性降低至最低值 ,下降的速度和程度与CTX剂量呈正比。骨髓细胞凋亡发生率的峰值出现在第 1天 ,第 3天恢复正常。FNPB移植能明显提高受鼠存活率 ,重建部分造血与免疫功能 ,未见明显GVHD表现 ,并在受体内检出供体细胞的植入。【结论】成功建立CTX化疗预处理小鼠脐血移植模型。干细胞占据的龛位是在化疗预处理后 4d逐渐完成腾空 ,凋亡是参与此过程的机制之一。     

IRM-2近交系小鼠对电离辐射抗性的研究

目的观察IRM-2小鼠对电离辐射的耐受性.方法分析测定了IRM-2小鼠对137Csγ射线的LD50及经4.0Gy137Csγ射线照射后不同时间外周血白细胞、骨髓有核细胞总数、骨髓细胞DNA含量和脾结节的变化,并与亲代小鼠ICR和615进行了比较.结果用不同剂量的137Csγ射线照射后,IRM-2小鼠对γ射线的LD50比ICR和615小鼠分别高1.73～1.57Gy和1.44Gy;外周血白细胞数和骨髓有核细胞总数、骨髓细胞DNA含量下降的幅度小且恢复得快;CFU-S的增加也较ICR和615小鼠明显.结论IRM-2小鼠比一般的纯系和杂交品系小鼠具有更强的辐射抗性.     

电离辐射对胎鼠皮肤间充质干细胞支持骨髓粒系造血作用的影响

目的：观察不同剂量的X射线照射对体外培养的胎鼠皮肤间充质干细胞(MSCs)支持造血细胞增殖作用的影响,为提高造血干细胞体外扩增效率提供一种更为有效的方法,进而为造血干细胞移植提供一个新的途径。 方法：分别用不同剂量的X射线照射培养的胎鼠皮肤MSCs层,然后将骨髓细胞种植于该细胞层上,扩增后不同时间(0~12 d)进行骨髓CFU-GM集落培养,同时取经X射线照射的皮肤MSCs的上清液进行骨髓CFU-GM、CFU-E及BFU-E培养,观察射线对胎鼠皮肤MSCs造血支持作用的影响。 结果：6、8和10 Gy剂量X射线照射胎鼠皮肤MSCs与骨髓细胞共同作用7 d时,骨髓祖细胞集落显著增加,其中6 Gy组增加最为明显,CFU-GM是0 Gy组的2.17倍。6、8和10 Gy剂量X射线照射培养皮肤的上清液体外亦可刺激骨髓CFU-GM、CFU-E、BFU-E的生长,与0 Gy组比较差异均有显著性(P<0.05)。其中6 Gy组增加最为明显,分别达0 Gy组的1.81倍、3.94倍和3.51倍,集落亦明显加大。 结论：一定剂量X射线照射胎鼠皮肤MSCs,其体外支持造血的作用增强,无论照射后的单纯MSCs细胞层还是上清液都可使骨髓细胞集落数增多。     

大剂量重组人粒细胞集落刺激因子对8.0 Gy 60Co γ射线照射小鼠长期存活率及远后效应的影响

目的 探索重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)对8.0 Gy 60Coγ射线照射小鼠长期存活率及远后效应的影响.方法 70只雄性C57BL/6小鼠,随机分为正常对照、照射对照及rhG-CSF大、中、小剂量治疗共5组,除正常对照组外,其他4组均接受8.0 Gy 60Co γ射线照射.治疗组小鼠于照射后0.5和24 h两次分别皮下注射rhG-CSF1000、500和250 μg/kg,随时记录各组动物存活率,照射后70、160和300 d进行外周血细胞计数分析,300 d时检测各组存活小鼠造血和免疫相关指标.结果 照射对照组动物照后19 d内全部死亡,平均存活时间(12.1±3.0)d;rhG-CSF 1000μg/kg治疗组照射后30、100和300 d存活率分别为86.7%、86.7%和80.0%,死亡小鼠平均存活时间较照射对照组明显延长(P＜0.01).照后300 d时,rhG-CSF 1000μg/kg治疗组的外周血红细胞和血小板计数均与正常对照组没有统计学差异,骨髓混合细胞集落形成单位数量显著低于正常对照组(P＜0.01);rhG-CSF治疗组的CD4+/CD8+比值倒置且250μg/kg剂量组明显低于正常对照组(P＜0.05);rhG-CSF治疗组造血和免疫器官的组织病理切片结果显示仍然存在不同程度的病变.结论 rhG-CSF 1000μg/kg治疗可以显著提高8.0 Gy 60Co γ射线照射小鼠存活率,但照射后300 d造血和免疫系统相关指标尚未完全恢复正常.     

大小鼠之间造血干细胞嵌合体抗异种移植物抗宿主病

目的探讨克服异种骨髓移植间强烈的移植物抗宿主病(GVHD)的措施。方法(1)将12只SD大鼠经5.0 Gy亚致死剂量全身照射后,4 h内每只经尾静脉输入28只正常BALB/c小鼠骨髓细胞8×107个。2 d后从腹腔注射环磷酰胺(Cy)100 mg/kg·b.w.,诱导形成对BALB/c小鼠产生特异性免疫耐受的嵌合体大鼠10只。(2)24只BALB/c小鼠接受9.0 Gy致死剂量全身照射后随机均分为3组,照射后4 h内经尾静脉注射骨髓细胞进行移植。A组输注正常SD大鼠的骨髓细胞4×107个;B组输注正常SD大鼠的骨髓细胞4×107个和脾细胞2×107个;C组输注嵌合体SD大鼠的骨髓细胞4×107个和脾细胞2×107个;观察GVHD的发生情况。结果A组有2只小鼠死于感染和放射损伤,所有对象均未观察到明显GVHD表现。B组平均累积存活时间为10 d[95%可信区间为(8,12)],死前均出现不同程度的典型GVHD表现。而C组除2只小鼠分别于移植后18、31 d死亡外,其余的均存活超过150 d。三组间比较有统计差异(P<0.002)。结论对有受者嵌合体的供者进行异种骨髓移植,有助于克服异种移植物抗宿主病。     

间充质干细胞在致敏受者造血干细胞移植中的作用

【目的】 本实验拟研究骨髓间充质干细胞(MSC)在致敏受者造血干细胞移植中的作用?【方法】 体外分离BALB/c小鼠骨髓细胞,通过贴壁培养方法获得MSC,应用流式细胞仪检测细胞表面分子标记?通过异基因脾细胞输注方法建立致敏动物模型;绿色荧光染料标记骨髓MSC,分别移植到非致敏及致敏受者体内,并于移植后不同时间点检测MSC的归巢情况?致敏BALB/c小鼠经照射预处理,联合应用同基因MSC与异基因骨髓细胞移植,每日观察小鼠的生存情况?【结果】 体外培养第4代MSC表现为长梭形,阴性表达造血细胞表面分子而阳性表达粘附分子?动物体内实验发现移植后第48小时,MSC在非致敏受者体内主要归巢于骨髓,而在致敏受者体内主要归巢于脾脏?造血干细胞移植实验中,致敏小鼠接受同基因骨髓MSC与异基因骨髓细胞移植,结果发现致敏小鼠在移植后第12 ~ 16天全部死亡,生存中位数时间是14 d?【结论】 成功培养小鼠骨髓MSC;移植后MSC在致敏受者体内主要归巢于脾脏组织;联合应用MSC移植并不能有效促进异基因造血干/祖细胞在致敏受者体内植入?     

全不相合与全相合骨髓细胞在致敏模型的归巢与植入

【目的】 探讨全不相合与全相合供者骨髓细胞在致敏模型的归巢与植入情况。【方法】 以异基因脾细胞输注致敏的BALB/c小鼠作为移植受者,致敏模型经8 Gy 60Co照射后分别经尾静脉移植1 × 107 C57BL/6或BALB/c供者的骨髓细胞。予CFSE标记供者骨髓细胞,并分别在移植后不同时间点(2、12及48 h),通过病理切片及组织细胞悬液动态示踪供者细胞在致敏受者各组织的分布。移植后记录各组的生存情况,每周监测造血重建与骨髓恢复情况。【结果】 归巢实验表明C57BL/6骨髓细胞在致敏受者股骨的分布随时间推移先增加而后减少,在脾脏的分布随时间推移呈进行性减少。BALB/c骨髓细胞在致敏模型股骨及脾脏的分布均随时间推移而增加。接受C57BL/6骨髓细胞的致敏模型于移植第12 ~ 15天内全部死亡,血象及骨髓象呈进行性下降;而接受BALB/c骨髓细胞的能长期存活,血象及骨髓象能迅速恢复。【结论】 全不相合的供者骨髓细胞在致敏模型中完全被排斥,而全相合供者的骨髓细胞能在致敏模型中能进行有效的归巢与植入。     

不同条件下体外扩增造血细胞促造血恢复能力的比较

目的 比较研究不同条件下体外扩增的造血细胞回输体内后促进造血功能恢复作用的差异，方法 在小鼠骨髓单个核细胞液体培养体系中，分别加入几种细胞因子组合和／或基质细胞层存在的条件下进行体外扩增，然后将不同条件下扩增的细胞经尾静脉回输至经致死量照射的小鼠体内，动态观察小鼠的外周血象变化及其一般状况和生存率。结果 ①单纯细胞因子介导BMMNC体外扩增后并不能增进这些细胞促造血恢复的能力；②含有骨髓基质细胞底层的体外扩增，无论是否加入细胞因子，均有明显的促进移植受体造血功能迅速恢复的作用。结论 骨髓基质细胞支持下的造血细胞体外扩增可能有助于维持扩增后造血干／祖细胞造血重建的功能，值得深入研究和应用。     

骨髓移植治疗DMD模型鼠后骨髓重建和目的蛋白的表达

目的：观察在骨髓移植(bone marrow transplantation，BMT)治疗Duchenne型肌营养不良症(DMD)模型鼠mdx鼠后．骨髓重建过程及目的蛋白的表达情况方法：对致死剂量放疗的20只mdx鼠进行BMT，于放疗后2、4、7、14、21、30d断尾取血，观察血液性状，用红细胞计数板计数红、白细胞数量，瑞-姬染色观察血涂片中血细胞变化情况，于移植后2个月用荧光免疫组化染色观察受体骨骼肌dystrophin的表达情况。结果：白细胞对放疗的反应最敏感、下降最快，红、白细胞在放疗1周内下降到最低点、血容量减少1周后白细胞和血容量逐渐增多，1个月左右恢复正常在移植后2个月部分mdx鼠肌膜上有dystrophin的表达结论：对外周血象的观察，可间接、敏感地反映放疗效果及骨髓造血情况，从而推断BMT成功与否BMT可使骨髓重建后病损骨骼肌上表达目的蛋白，利于骨骼肌修复。     

异基因骨髓移植后小鼠虹膜睫状体内抗原递呈细胞的分布

目的:观察异基因骨髓移植后小鼠虹膜睫状体内抗原递呈细胞(APC)的分布情况。方法:绿色荧光蛋白(GFP)转基因C57BL/6J(H-2b)小鼠作为供体,经5.5Gy×2剂量照射24h的BALB/c(H-2d)小鼠作为宿主,于骨髓移植后21d和35d取出宿主小鼠眼球,分离得到虹膜睫状体,荧光显微镜下观察供体骨髓来源的细胞分布。同时采用免疫组织化学染色方法观察普通和移植后小鼠F4/80阳性细胞在虹膜中的分布规律。结果:异基因骨髓移植后21d和35d,宿主虹膜睫状体内可观察到大量呈树突状形态的绿色荧光细胞,呈“满天星”样散在分布于小鼠虹膜睫状体中,这些细胞F4/80抗体免疫组织化学荧光染色多为阳性。结论:虹膜睫状体中的APC细胞来源于骨髓,且大部分为F4/80阳性细胞;异基因骨髓移植后宿主虹膜睫状体中的APC细胞全部被供体来源的APC细胞取代。     

人骨髓间充质干细胞在mdx鼠体内的动态分布

目的探讨人骨髓间充质干细胞(hBM-MSCs)在mdx鼠体内的动态分布特点。方法用5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)标记hBM-MSCs,将1×107个干细胞(0·3ml)经尾静脉注入免疫抑制的mdx鼠(8~10周龄)体内。于移植后48h、2、4、8、12、16、20、24周处死鼠,用免疫荧光法检测各组织器官的BrdU阳性细胞核数、骨骼肌人细胞核(Hu)及人抗肌萎缩蛋白(Dys)的表达,RT-PCR检测人Dys mRNA的表达。结果移植后4周内,BrdU阳性细胞核可见于多数组织、器官,其中以骨髓、肝、肺较多;肝、肺BrdU阳性细胞核数4周后逐渐下降;移植后48h骨髓BrdU阳性细胞核数较多,2周最多,16周后仍维持较高水平;4周后骨骼肌的BrdU阳性细胞核数逐渐增加。移植后2周骨骼肌检测到少量人特异性抗核抗体(anti-Hu)阳性细胞核,4周后在骨骼肌肌膜可见少量人特异性Dys阳性细胞,8周后有Dys mRNA的表达;随着移植时间的延长,anti-Hu抗体阳性细胞核数和Dys阳性细胞比例逐渐增高,DysmR-NA的表达逐渐增强。结论hBM-MSCs移植mdx鼠后早期(2~4周)主要分布在骨髓、肝、肺,后期(4周后)主要分布在骨髓、骨骼肌。     

具骨髓间充质干细胞表型的成体干细胞移植造血

目的为了探索骨髓成体干细胞是否能重建超致死剂量射线照射后小鼠的造血功能.方法采用液体培养分离,培养,扩增雄性小鼠骨髓成体干细胞,作为供体细胞,将受体雌性小鼠预先经Cs137全身照射850rad后在4 h内从尾静脉输入细胞.受体小鼠分为5组,每组10只a正常小鼠不经任何处理;b输入6×106cell/只(0.3ml)新鲜全骨髓;c输入6×106 cell/只(0.3 m1)去基质细胞的造血细胞;d输入6×106cell/只(0 3 m1)经培养后的成体干细胞,输注细胞后第1天上、下午肌肉注射各一次Granulocyte colony stimulating factor(G-CSF)等细胞因子;e注射D-Hanks液0.3ml/只.观察各组小鼠的存活情况,小鼠在输注前查尾静脉血,计细胞总数、涂片、分类,输细胞后每周各组分别取小鼠肝、脾、股骨,固定作病理切片,另外一侧股骨冲出骨髓,计数一条股骨有核细胞数、涂片、测定colonyforming unit-granulocyte/macrophage(GM-CFU)值.结果输全骨髓组外周血有核细胞和骨髓有核细胞数及GM-CFU值在输注后的第1,2周都高于单输成体干细胞组,但单输基质细胞组有核细胞逐渐恢复,小鼠存活好,至输注后第3周,无论外周血或骨髓中的有核细胞都较第2周明显恢复,GM-CFU也明显升高,而单输造血细胞和D-hnks液组小鼠存活7～8 d死亡.结论小鼠超致死剂量照射后,输入经培养后的同种小鼠骨髓成体干细胞配合G-CSF等细胞因子注射可重建小鼠造血功能.     

5．0 Gy放射损伤对小鼠早期骨髓造血基质细胞周期及其DNA含量的影响

取５．０Ｇｙγ射线照射后３ｄ和７ｄ的小鼠骨髓体外液体培养１４ｄ和２１ｄ，显示骨髓基质细胞仍能贴壁生长，但骨髓基质细胞集落（ＣＦＵ－Ｆ）数量显著低于正常，照后７ｄ的ＣＦＵ－Ｆ数量虽比照后３ｄ的ＣＦＵ－Ｆ数量有所增加，但恢复缓慢；延长培养时间，显示照射鼠的骨髓基质细胞增殖受抑。流式细胞仪检测结果表明Ｇ２＋Ｍ期细胞和ＤＮＡ含量显著低于正常对照组；随着照后时间的延长，Ｓ、Ｇ２＋Ｍ期含量有所恢复，但仍显著低于正常对照组。说明骨髓造血基质细胞具有较高的辐射敏感性且对辐射损伤持续较久。     

大小鼠之间造血干细胞嵌合体抗异种移植物抗宿主病

OBJECTIVE: To find a method for preventing graft-versus-host disease (GVHD) in BALB/c mice receiving rat bone marrow transplantation. METHODS: Firstly 12 SD rats were conditioned with 5.0 Gy sublethal total body irradiation(TBI), followed by infusion of 8 x 10(7) bone marrow cells from 28 BALB/c mice within 4 h and intraperitoneal administration of 100 mg/kg cyclophosphamide (Cy) 2 d later, for the purpose of inducing chimeric SD rats with specific immunological tolerance. Secondly, 24 BALB/c mice were exposed to 9.0 Gy lethal TBI and divided randomly into 3 equal groups designated respectively as groups A, B and C. Mice in group A were injected with 4 x 10(7) bone marrow cells from 4 normal rats, and mice in group B were injected with 4 x 10(7) bone marrow cells and 2 x 10(7) spleen cells from 4 normal rats, while those in group C were given 4 x 10(7) bone marrow cells and 2 x 10(7) spleen cells from 6 chimeric rats. The mice were then observed for 150 d for GVHD. RESULTS: In the second procedure, 2 mice in group A failed to survive due to infection and radiation injury respectively, and none of the rest mice presented signs of GVHD. The mice in group B all developed GVHD of varied degrees with symptoms as wasting, diarrhea, fur loss, arched body posture, and even bloody stool, and all died within 5 to 15 d with an average survival of 10.0 d (95% confidence interval 8,12). Pathological examination of the liver and intestinal tissues revealed inflammatory lymphocyte infiltration and necrosis. The majority of the mice in group C, in contrast, survived for more than 150 d with only two died on the postoperative days 18 and 31 respectively. The survival time of group B was significantly shorter than that of the other two groups. CONCLUSION: Donor/recipient chimerism may help prevent GVHD in xenogeneic bone marrow transplantation.