CAR菌TaqMan MGB探针法实时荧光定量PCR快速检测方法的建立与应用研究

目的 建立特异、敏感、快速检测CAR菌的TaqMan MGB探针荧光定量PCR方法。方法 针对CAR菌16S rRNA基因序列设计特异性引物和探针,建立MGB探针荧光定量PCR方法,验证方法的特异性、敏感性和稳定性。对2008~2012年期间采集的1344份临床标本中的CAR菌进行检测,同时进行普通PCR检测作为对照。结果 CAR菌TaqMan MGB探针荧光定量PCR方法具有高度特异性,与肺炎支原体、侵肺巴斯德菌、支气管鲍特杆菌、肺炎克雷伯杆菌、大肠埃希氏菌、肺炎链球菌间无交叉反应,检测灵敏度达2.7拷贝。标准曲线显示各浓度范围内具有良好线性关系,相关系数为0.999,斜率为-3.22,TaqMan MGB探针荧光定量PCR效率为104.432%。对1344份标本进行检测,结果TaqMan MGB探针荧光定量PCR检出510份CAR菌阳性样本。TaqMan MGB探针荧光定量PCR能够直接从标本中检出CAR菌DNA,检测时间仅为40分钟。结论 TaqMan MGB探针荧光定量PCR方法具有可靠、特异、敏感的特点,适用于CAR菌的快速检测。     

CAR菌TaqMan MGB探针法实时荧光定量PCR快速检测方法的建立与应用

目的建立特异、敏感、快速检测CAR菌的TaqMan MGB探针荧光定量PCR方法。方法针对CAR菌16S rRNA基因序列设计特异性引物和探针,建立MGB探针荧光定量PCR方法,验证方法的特异性、敏感性和稳定性。对2008～2012年期间采集的1 344份临床标本中的CAR菌进行检测,同时进行普通PCR检测作为对照。结果 CAR菌TaqMan MGB探针荧光定量PCR方法具有高度特异性,与肺炎支原体、侵肺巴斯德菌、支气管鲍特杆菌、肺炎克雷伯杆菌、大肠埃希菌、肺炎链球菌间无交叉反应,检测灵敏度达2.7拷贝。标准曲线显示各浓度范围内具有良好线性关系,相关系数为0.999,斜率为-3.22,TaqMan MGB探针荧光定量PCR效率为104.432%。对1 344份标本进行检测,结果 TaqMan MGB探针荧光定量PCR检出510份CAR菌阳性样本。TaqMan MGB探针荧光定量PCR能够直接从标本中检出CAR菌DNA,检测时间仅为40 min。结论 TaqMan MGB探针荧光定量PCR方法具有可靠、特异、敏感的特点,适用于CAR菌的快速检测。     

实时荧光定量PCR检测沙眼衣原体的研究

目的 采用TaqMan探针建立检测沙眼衣原体的实时荧光定量PCR(real-time PCR)方法.方法 根据沙眼衣原体外膜蛋白A的基因(ompA)序列设计引物和探针,以克隆的ompA部分基因片段作DNA模板,建立实时荧光定量检测方法.结果 建立的荧光定量PCR检测方法的最低检出限为5 copies/反应,检测线性范围100107线性关系良好(r2=0.997),比巢式PCR敏感100倍;且与鹦鹉热衣原体、淋球菌、解脲脲原体、大肠杆菌等病原菌DNA以及人基因组DNA均无交叉反应,表明该方法具有良好的特异性.以巢式PCR作参比,建立的荧光定量PCR法检测沙眼衣原体的阳性符合率为100.00％,阴性符合率为95.09％,总符合率为96.81％.结论 建立的检测沙眼衣原体实时荧光定量PCR具有特异性强和敏感性高的特点,可快速检测样本中微量沙眼衣原体DNA,适用于对沙眼衣原体进行大规模筛选.     

多探针荧光定量PCR法用于慢性前列腺炎病原菌学诊断的建立

目的建立一种新的改良的TaqMan荧光定量PCR方法，能高度敏感地同时检测并鉴定多种细菌．该方法有一套独特的多探针设计：一对由16SrDNA基因编码的高度保守序列作为引物；引物之间的一个高度保守区域被用来设计通用探针，一个高度可变区域被用来设计特异性探针．方法通过对10种慢性前列腺炎病人细菌培养常见的病原菌的DNA提取物进行FQ-FCR（荧光定量PCR）检测，用通用探针检测这10种细菌的DNA含量，在此同时用金黄色葡萄球菌特异性探针（SA probe）和大肠杆菌特异性探针（EC probe）分别特异性检测金黄色葡萄球菌（S．aureus）和大肠杆菌（E．coil）的DNA含量．[第一段]     

应用MGB探针检测人丙型肝炎病毒的基因型

目的检测血浆或血清样本中人丙型肝炎病毒（HCV）的基因型,建立了基于MGB探针的实时荧光定量PCR检测体系。方法在HCV基因组型特异性碱基的聚集区域设计荧光定量PCR引物及探针,为保证特征特异性及高分辨率,选择设计MGB探针,然后将PCR扩增的产物先进行基因克隆,而后制备病毒样颗粒做为阳性质控品,从而建立完整的MGB探针法的荧光定量PCR检测体系,最后对该检测体系进行方法学评价。结果成功建立了基于MGB探针的HCV荧光定量PCR的基因分型检测体系。方法学评价显示,该检测体系的灵敏度达100IU/mL;重复性好;特异性良好,以多种血浆病毒的核酸样品为模板进行检测时结果全为阴性。结论本研究建立基于MGB探针的HCV荧光定量PCR的基因分型检测方法,可定性检测血浆或血清样本及血液制品中的人丙型肝炎病毒HCV的基因型及含量,对于该疾病的研究及临床治疗都具有重要的意义。     

实时定量PCR检测白色念珠菌方法学的建立

目的 采用Taq Man MGB探针技术, 建立白色念珠菌实时荧光定量PCR (RQ-PCR) 检测方法, 为临床白色念珠菌的检测提供快捷的方法.方法 以真菌D1/D2区基因的一段高度保守序列为扩增靶序列, 合成白色念珠菌特异性引物和探针, 提取白色念珠菌标准菌株的DNA, 构建含有靶基因片段的重建质粒, 扩增后DNA作为标准品, 建立白色念珠菌RQ-PCR的标准曲线, 并对其重复性、敏感性及特异性等方面进行方法学评价.结果 对构建好的克隆质粒测序, 插入片段与预期片段序列一致, 相似性达100%.白色念珠菌标准曲线为Y=-3.824x+41.36, R2=0.990, 该扩增曲线形态良好.结论 成功建立了实时荧光定量PCR检测白色念珠菌的方法, 其敏感性和特异性较好.     

α变形菌纲磁螺菌属TaqMan探针实时荧光定量PCR快速检测方法的建立

目的建立一种快速有效检测环境中α变形菌纲磁螺菌属细菌的方法。方法本研究以α变形菌纲磁螺菌属保守且特异的16SrRNA片段为靶序列,化学合成基因序列,制备重组质粒作为磁螺菌属检测的标准品;用实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)技术,针对目的片段基因设计特异性引物和TaqMan荧光探针,进行实时荧光定量PCR检测,运用统计学方法评价该方法的特异性、敏感性及重复性。结果本实验成功构建了质粒PUC19-QC,引物、探针特异性良好,标准曲线在5.10×101~5.10×107拷贝数之间具有较好的线性关系,相关系数R2=0.999。该法最低可检测到5.10×10个DNA拷贝数,灵敏度明显高于普通PCR;重复性试验表明,荧光定量PCR检测结果 Ct值波动范围较小,Ct值的标准差均小于0.23,表明该法重复性好,可靠性高。析因方差分析表明不同稀释度之间的Ct值差异有统计学意义(F=3 125.305,P0.001),三个批次的再现性良好,差异无统计学意义(F=0.057,P=0.945),而浓度分组与时间之间也无交叉效应(F=0.533,P=0.873)。结论本实验所建立的TaqMan探针实时荧光定量PCR检测技术,能够快速有效地检测α变形菌纲磁螺菌属细菌,且检测结果稳定,受外界条件如时间、气温等影响小。     

隐孢子虫PCR检测体系的建立及其应用

目的建立快速检测隐孢子虫卵囊的PCR检测体系,以期在人群和食品及其饮用水腹泻原虫监测中推广应用。方法以隐孢子虫小亚基SSU r RNA和卵囊壁蛋白(COWP)为靶基因,设计巢式PCR和荧光PCR的引物和探针;以分离纯化后的微小隐孢子虫卵囊基因组DNA为模板进行扩增,分别进行两种检测方法的敏感性和特异性试验;再用某水牛养殖场采集的58份牛粪样考核检测体系的应用价值。结果设计的巢式PCR引物和荧光PCR引物探针特异性都很高,巢式PCR对隐孢子虫DNA的检测最低OD阈值为2 pg隐孢子虫DNA;实时荧光PCR显示最低检测阈值为200 fg隐孢子虫DNA,灵敏性都比较高,实时荧光PCR的灵敏性比巢式PCR高1个数量级(10倍);58份检测样本中,有一份为阳性样本,PCR产物经序列分析显示为微小隐孢子虫。结论巢式PCR和实时荧光PCR检测隐孢子虫的特异性和灵敏性均高,操作简便,能为隐孢子虫感染的诊治和预防提供有效的技术手段和方法依据。奶牛感染人兽共患微小隐孢子虫基因亚型,具有人兽共患传播的可能性。     

自建两轮PCR法对低载量HBV DNA S区基因的扩增及实验条件优化

目的 探究低载量HBV DNA S区基因扩增的可行性并对实验条件进行优化,为隐匿性HBV感染(OBI)患者HBV DNA S区基因突变检测提供依据.方法 采用传统巢式PCR和自建两轮PCR方法扩增6例低HBV DNA载量(100～200 IU/mL)和22例更低HBV DNA载量(20～99 IU/mL)的血清样本中HBV DNA S区基因,并对引物序列、引物量、PCR产物模板稀释倍数、退火温度、PCR反应循环数、PCR总反应体系等条件进行优化.PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后,切割目的条带凝胶进行克隆测序,然后对克隆测序结果进行核酸序列BLAST比对确认.结果 设计3对巢式PCR引物(P1～P3),扩增产物理论上包含整个HBV DNA S区基因.经过PCR扩增条件优化后,6例低HBV DNA载量的血清样本中仅2例经巢式PCR扩增出HBV DNA S区基因特异性靶序列,22例更低HBV DNA载量样本无一例扩增成功.自建两轮PCR法设计了P4～P15共12对引物,扩增产物理论上包含整个HBV DNA S区基因.经过PCR扩增条件优化并筛选出P13为最佳引物后,6例低HBV DNA载量的血清样本全部扩增出HBV DNA S区基因特异性靶序列;15例(15/22,68.18％)更低HBV DNA载量的样本扩增出HBV DNA S区基因特异性靶序列,经PCR产物克隆测序均证实为HBV DNA S区基因,该15例样本中HBV DNA载量最低为20.1 IU/mL.结论 基于引物P13自建的两轮PCR法更适用于低载量HBV DNA S区基因的扩增,扩增效率和特异性均优于传统巢式PCR;扩增产物可进一步应用于OBI者HBV DNA S区基因序列突变分析.     

香港海鸥形菌TaqMan-MGB探针实时荧光PCR的建立与应用

目的建立快速、灵敏、特异的香港海鸥形菌TaqMan-MGB探针实时荧光PCR体系,用于食源性致病菌监测和淡水鱼产品贸易往来的快速检测。方法根据GenBank公布的香港海鸥形菌16SrRNA基因高保守序列,设计特异引物对和TaqMan-MGB探针,建立和优化快速检测体系,评价反应体系的特异性、灵敏度、重复性,并在淡水鱼类、急性胃肠炎腹泻患者标本中临床应用,结合细菌分离方法和序列测定分析进行验证。结果建立的香港海鸥形菌TaqMan-MGB探针实时荧光PCR反应体系检测时限短,仅40min就可出结果,特异性好,与沙门氏菌、志贺氏菌、副溶血弧菌等非目标菌无交叉反应,灵敏度高,检测下限达10拷贝／反应,稳定性好,同一浓度阳性质粒进行16次重复检测的Ct值变异系数0．183％。92份淡水鱼及211份医院急性胃肠炎腹泻标本实时荧光PCR与常规细菌分离结果完全一致,均检出了12株香港海鸥形菌。16SrRNA测序结果显示与HKU1株同源性在99．5％以上,进一步验证了实时荧光PCR的特异性。结论本研究建立的香港海鸥形菌TaqMan—MGB探针实时荧光PCR反应体系快速、特异、灵敏,在防止食源性疾病的传播和加快贸易通关速度方面,具有较强的的应用价值。     

鸭疱疹病毒1型实时荧光定量PCR方法的建立

目的建立检测鸭疱疹病毒1型(鸭瘟病毒)的实时荧光定量PCR方法,为快速诊断、致病机理研究及抗病毒药物筛选等奠定基础。方法根据病毒DNA聚合酶基因的序列,设计引物和探针,采用TaqMan探针技术进行实时荧光定量PCR,用含有125bp扩增产物的pMD18-T载体质粒为阳性对照,构建标准曲线,对该方法的特异性、可重复性、敏感性进行评价,同时与传统PCR方法进行比较研究。结果标准曲线表明在2.3×105~2.3×10拷贝数之间有很好的线性关系(r=0.999);实时荧光定量PCR最少可检测到23个阳性质粒,说明有很好的敏感性;试验内及试验间变异系数分别为1.22~6.69以及2.09~8.84,说明有较好的重复性;对非鸭瘟病毒DNA无扩增,说明有很好的特异性;在对病毒DNA的检测方面,比传统PCR的敏感性高出104倍。结论成功建立了针对鸭瘟病毒的特异、敏感、重复性强且可准确定量的实时荧光定量PCR方法。     

DNA芯片快速检测淋球菌16SrRNA基因突变

目的探讨新研制的DNA芯片应用于快速检测淋球菌16S rRNA基因突变的临床应用价值。方法根据淋球菌16SrRNA基因的序列信息设计探针并制作DNA芯片,PCR扩增并荧光标记包含16S rRNA基因突变的目的 DNA片段,与芯片杂交,同时以测序法为对照。结果 87份泌尿生殖道拭子均可被DNA芯片检测,同时检测发现有1株淋球菌16S rRNA基因突变(2709 C→T),与测序结果一致。结论DNA芯片检测淋球菌16SrRNA基因突变具有快速、高特异性和高灵敏度,可以应用于对大观霉素的耐药性临床检测。     

细菌16S rRNA基因芯片的构建及其在细菌鉴定中的应用

目的:构建细菌16S rRNA基因芯片,并将其应用于细菌检测.方法:根据细菌16S rRNA基因保守区设计合成针对革兰阳性细菌、革兰阴性细菌的通用探针,以及针对肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌的特异性探针,并构建基因芯片.利用所构建的芯片检测相应细菌,并观察其特异性及敏感性.结果:成功构建了相应的基因芯片;所构建的基因芯片能准确检出相应细菌,无交叉阳性现象,检测时间约需6 h;所构建的基因芯片能检测出DNA含量为15 fg的大肠埃希菌基因组DNA.结论:细菌16S rRNA基因芯片可用于细菌的检测,具有良好的特异性及敏感性,且耗时少.     

实时荧光定量聚合酶链反应在检测大肠埃希菌引起血流感染中的应用

目的 探讨实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)在检测大肠埃希菌引起血流感染中的应用.方法 从血培养阳性瓶中提取细菌基因组DNA,以大肠埃希菌特异性引物应用实时荧光定量,扩增16S rRNA靶片段,同期进行细菌培养鉴定,对比实验结果.结果 通过对实时FQ-PCR体系特异性、敏感度、稳定性验证,结果表明具有较好的特异性...     

半套式PCR和DNA探针技术检测Q热立克次体

目的 建立半套式PCR和DNA探针技术由于检测Q热立克次体。方法 依据已知的Q热立克次体的16S和23S rRNA基因及其间区的序列。设计3条引物,建立了扩增16S－23S mRNA基因间区的半套式PCR方法,并将扩增片段制成探针,建立了斑点杂交技术。结果 10株Q热立克次体分离株均可扩增出572bp的PCR条带,而对照菌都为阴性,此半套式PCR方法的灵敏度高达1pg;用九里株扩增片段标记后制成的探针,与10个Q热立克次体分离株的全DNA呈阳性杂交,对照菌为阴性,此杂交方法的灵敏度为0．5ng。结论 基于Q热立克次体16S－23S rRNA基因间区的半套式PCR和DNA探针技术具有较好的特异性和灵敏度,可联合应用于Q热的病原学诊断。     

新型Taq Man-MGB探针实时荧光定量PCR检测人类mdr1基因

目的建立一种比现有方法敏感、准确性高、重复性好的人类mdr1基因的新型实时荧光定量PCR检测新方法。方法用Primer Express 2．0引物设计软件设计引物和MGB探针,以Taq Man-MGB探针技术为基础,运用Taq Man-MGB探针,以含有目的基因mdr1cDNA的质粒pHaMDR1／A为阳性模板,建立实时荧光定量PCR检测方法。结果所建立方法的最低检测限度为15个基因拷贝／反应,在待扩增DNA浓度为3．061×103 cps／ml-3．061×109cps／ml范围时,模板浓度与循环阈值(Ct)之间的相关性良好,决定系数r2为0．988243。结论应用Taq Man-MGB探针的实时荧光定量PCR方法检测人类mdr1基因,具有灵敏度高、特异性高和精确性高等优点。     

流感嗜血杆菌16S rRNA和p6基因PCR检测结果比较

目的 比较流感嗜血杆菌(Hi) 16S rRNA和p6基因的PCR检测结果的差异.方法 以Hi的16S rRNA基因及外膜蛋白p6基因作为靶基因,设计特异性引物分别对临床标本分离的43株Hi进行PCR快速检测. 结果 34株16S rRNA基因扩增出538bp大小DNA片段,检出率为79%;43株p6基因均扩增出296bp大小DNA片段,检出率为100%.同时,其他细菌对照株16S rRNA和p6基因扩增均未出现假阳性结果.结论 相比于16S rRNA基因,p6基因对Hi检测和鉴定更具特异性,可用于临床对Hi感染疾病的快速诊断和流行病学研究.     

猴免疫缺陷病毒(SIV)实时荧光定量PCR检测方法的建立

目的建立快速、敏感、特异的猴免疫缺陷病毒(SIV)TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法,对SIV病毒核酸进行定量检测。方法 RT-PCR扩增SIVmac251保守gag基因序列796 bp片段,进行TA克隆,构建标准品质粒pMD-SIVgag。通过对SIV定量外标准品的定量分析,优化反应体系,检测TaqMan探针实时荧光定量PCR方法的灵敏度、特异性和重复性。结果所建立的SIV QPCR检测方法,质粒DNA模板在107～102拷贝之间表现较好线性和相关性,标准曲线所得斜率为-3.26,相关系数为0.999。检测灵敏度达到200拷贝,方法重复性测试,检测25份临床样品CV%均小于1%。结论建立的SIV QPCR检测方法特异性、敏感性高,稳定性好,可用于定量测定猴免疫缺陷病毒(SIV)核酸拷贝量。     

副溶血性弧菌致病性标志基因tdh的实时荧光定量聚合酶链式反应的建立

目的:建立一个用于副溶血性弧菌致病性定量测定的检测体系.方法:以多组tdh基因的保守序列为基础,设计实时荧光定量PCR扩增适用的引物和TaqMan探针.以定量方式提取副溶血性弧菌基因组DNA,以tdh+菌株为阳性对照,建立实时荧光定量PCR方法.以tdh荧光定量结果与绝对菌数浓度作参比,以确定tdh基因在菌群中的拷贝水平.结果:使用正向序列5-GGAAG ATGTT TATGG TCAAT C-3(位置在467～487 bp处),反向序列5-ACCGC TGCCA TTG-TA TAGTC T-3(位置在571～551 bp处),TaqMan探针5-FAM-TGACA TCCTA CATGA CTGTG AAC-ECLIPSE-3(位置在517～539 bp处)建立一个实时荧光定馈PCR反应,目的片段长度105 bp.建立反应的DNA拷贝数对数值与Ct值线性关系为γ=-3.144 logx+43.229(r=0.997,P<0.001).建立了菌液A值与显微镜下绝对菌数浓度的相关关系为γ=2.0452x+6.2845(r=0.7828,P<0.01).根据tdh基因拷贝数与绝对菌数相比可计算tdh基因的单菌体拷贝量.结论:建立了一个定量副溶血性弧菌tdh基因拷贝水平的实时荧光定量PCR检测方法,可应用于副溶血性弧菌致病性的标准化定量测定体系.     

树鼩腺病毒TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

目的通过建立树鼩腺病毒(tree shrew adenovirus,TAV)TaqMan实时荧光定量PCR检测方法,快速准确地检测树鼩腺病毒。方法根据TAV全基因组3’端保守序列设计合成特异性引物;用含目的基因片段的重组质粒作为标准品进行标准曲线绘制,建立TAV TaqMan实时荧光定量PCR检测方法。结果建立的TAV实时荧光定量PCR检测方法特异性好,与树鼩源及其他物种常见病毒无交叉反应;方法的最低检测限度为每微升3.7拷贝,灵敏性强;相关检测系数R2为0.998,扩增效率为95.7%;扩增结果具有良好的线性关系,且重复性检测效果好。结论成功建立了TAV TaqMan实时荧光定量PCR检测方法,灵敏度高,重复性好,可用于TAV感染的早期快速检测。