丙型肝炎病毒NS5A基因真核表达载体的构建及其在HL-7702细胞中的高效表达

目的：构建丙型肝炎病毒(HCV)NS5A基因的真核表达载体，并在正常人肝细胞株(HL-7702细胞)中进行表达，为今后研究HCV NS5A蛋白功能奠定基础。方法：从含HCV NS345序列的重组质粒pCDNA3.1（+）/ NS345中扩增出HCV NS5A基因片段，构建pCI-neo/ NS5A重组表达质粒。用脂质体将其转染HL-7702细胞，通过Western blotting印迹法鉴定NS5A蛋白。结果：用PCR方法扩增的HCV NS5A基因全长1 344 bp,与PGEM-T重组，测序证实所克隆的NS5A基因片段大小正确；成功地构建pCI-neo/ NS5A重组表达质粒，瞬时转染HL-7702细胞表达NS5A蛋白，Western blotting印迹法显示其相对分子质量约为56 000。结论：HCV NS5A的真核表达载体pCI-neo/ NS5A在HL-7702细胞中能有效表达NS5A蛋白，NS5A蛋白可导致病毒复制、肝细胞癌发生，且NS5A区为IFN敏感性决定区。     

丙型肝炎病毒整个开放阅读框序列的克隆及各组分蛋白的表达

目的 在痘苗系统中表达丙型肝炎病毒(HCV)各组分蛋白。方法 将编码HCV大前体蛋白的开放阅读框(ORF)序列克隆至痘苗启动子后，构建重组质粒pVHCV。重组质粒转染BHK21细胞后，再用痘苗病毒vTF7-3株感染，培养48h后收集细胞。Western blotting和免疫荧光技术鉴定HCV非结构蛋白NS3和NS5a的表达情况。结果 Western blotting结果表明，在细胞中检测到相对分子质量为70000(NS3)和58000(NS5a)的两条带；免疫荧光试验结果表明，无论采用抗NS3单抗还是抗NS5a单抗，大部分转染质粒细胞的细胞质中都具有较强的荧光反应。结论 HCV非结构蛋白NS3和NS5a在BHK21细胞中得到表达。     

丙型肝炎病毒整个开放阅读框序列的克隆及各组分蛋白的表达

目的在痘苗系统中表达丙型肝炎病毒(HCV)各组分蛋白。方法将编码HCV大前体蛋白的开放阅读框(ORF)序列克隆至痘苗启动子后,构建重组质粒pVHCV。重组质粒转染BHK21细胞后,再用痘苗病毒vTF7-3株感染,培养48 h后收集细胞。Western blotting和免疫荧光技术鉴定HCV非结构蛋白NS3和NS5a的表达情况。结果Western blotting结果表明,在细胞中检测到相对分子质量为70 000 (NS3)和58 000 (Ns5a)的两条带;免疫荧光试验结果表明,无论采用抗NS3 单抗还是抗NS5a 单抗,大部分转染质粒细胞的细胞质中都具有较强的荧光反应。结论HCV非结构蛋白NS3和NS5a在BHK21细胞中得到表达。     

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS4B基因酵母表达载体的构建及表达

目的：构建丙型肝炎病毒（HCV）非结构蛋白NS4B基因的酵母细胞表达载体，为探索HCVNS4B在细胞内的相互作用蛋白奠定基础。方法：用多聚酶链反应（PCR）的方法在HCV全长质粒pBRTM／HCV-1为模板扩增HCVNS4B基因，克隆到pGEM-T载体中，双酶切后回收连接到酵母表达质粒pGBKT7中表达。提取酵母蛋白质，进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和Western免疫印迹分析。结果：成功构建HCVNS4B基因酵母表达载体，Western免疫印迹分析显示了HCVNS4B在酵母细胞中融合表达。表达产物在胞内存在，融合蛋白的相对分子量约为48ku左右。结论：HCVNS4B蛋白在酵母中表达成功。     

脂多糖诱导巨噬细胞自噬相关LC3B-GFP荧光聚集体的形成

目的构建pEGFP-C1/LC3B重组质粒并转染小鼠巨噬细胞RAW264.7,观察脂多糖(LPS)诱导其自噬相关LC3B-GFP荧光聚集体形成的过程。方法根据编码小鼠微管相关蛋白1轻链3β(LC3B)的开放读码框(ORF)设计引物,RT-PCR扩增小鼠LC3B的ORF,构建pEGFP-C1/LC3B重组质粒;脂质体法转染并筛选稳定表达RAW264.7细胞株,荧光显微镜观察及Western blot鉴定LC3B-GFP融合蛋白表达;LPS刺激稳定转染的RAW264.7细胞株,激光共聚焦显微镜检测不同时间绿色荧光聚集体的分布。结果成功构建真核表达质粒pEGFP-C1/LC3B,并获得稳定表达LC3B-GFP融合蛋白的RAW264.7细胞株,荧光显微镜下可见细胞内有绿色荧光蛋白分布,Western blot鉴定表达LC3B-GFP融合蛋白,激光共聚焦结果显示LPS刺激前融合蛋白呈弥散性分布在胞浆中,而LPS刺激后细胞内有明显绿色荧光聚集体形成并呈时间依赖性逐渐增加。结论成功构建pEGFP-C1/LC3B,转染RAW264.7细胞可正确表达LC3B-GFP融合蛋白,LPS刺激后显示绿色荧光聚集体形成。     

Lipopolysaccharide induces RAW264.7 macrophageautophagy-related LC3B-GFP fluorescent aggregates formed

目的 构建pEGFP-C1/LC3B重组质粒并转染小鼠巨噬细胞RAW264.7,观察脂多糖(LPS)诱导其自噬相关LC3B-GFP荧光聚集体形成的过程.方法 根据编码小鼠微管相关蛋白1轻链3β(LC3B)的开放读码框(ORF)设计引物,RT-PCR扩增小鼠LC3B的ORF,构建pEGFP-C1 /LC3B重组质粒;脂质体法转染并筛选稳定表达RAW264.7细胞株,荧光显微镜观察及Western blot鉴定LC3B-GFP融合蛋白表达;LPS刺激稳定转染的RAW264.7细胞株,激光共聚焦显微镜检测不同时间绿色荧光聚集体的分布.结果 成功构建真核表达质粒pEGFP-C1 /LC3B,并获得稳定表达LC3B-GFP融合蛋白的RAW264.7细胞株,荧光显微镜下可见细胞内有绿色荧光蛋白分布,Western blot鉴定表达LC3B-GFP融合蛋白,激光共聚焦结果 显示LPS刺激前融合蛋白呈弥散性分布在胞浆中,而LPS刺激后细胞内有明显绿色荧光聚集体形成并呈时间依赖性逐渐增加.结论 成功构建pEGFP-C1/LC3B,转染RAW264.7细胞可正确表达LC3B-GFP融合蛋白,LPS刺激后显示绿色荧光聚集体形成.     

丙型肝炎病毒ns5b基因的克隆、表达及鉴定

目的：构建HCV ns5b基因的重组原核表达质粒，并获得NS5B蛋白的高效表达，为制备抗NS5B抗体及以其为靶位的抗HCV感染研究创造条件。方法：利用PCR技术扩增HCV ns5b基因，Xho I和Kpn I双酶切后连接到经同样酶切的原核表达载体pRSETA上，转化大肠杆菌JM109菌株，获得阳性重组质粒pRSETA-ns5b，阳性质粒转化BL21(DE3)，IPTG诱导表达，表达产物经SDS-PAGE和Western Blot电泳进行鉴定，并以薄层扫描分析对其定量。结果：成功构建了HCV NS5B蛋白表达载体pRSETA-ns5b，经诱导明显表达出6His-NS5B融合蛋白，表达产物主要以包涵体形式存在，表达量占菌体蛋白25％，Western—Blot结果显示表达蛋白保持活性。结论：HCV NS5B蛋白在体外得到了有效表达。     

Smad2/3/4真核表达质粒的构建及重组蛋白表达

目的:构建pcDNA3.1myc-HisA-Smad2/3/4真核表达质粒,证实融合蛋白在细胞内表达。方法:以pcDNA3.1-Smad2/3和pGEX2T-Smad4质粒为模板,设计特异性引物,PCR扩增Smad2/3/4全长编码基因,亚克隆至含有pcDNA3.1myc-HisA 标签的真核表达载体中。将构建的重组质粒测序并转染到人胚胎肾细胞HEK293 中,提取细胞蛋白进行 Western blotting 检测。结果：Smad2/3/4 全长基因序列克隆到真核表达载体pcDNA3.1myc-HisA中,酶切鉴定片段为1 401、1 275和1 656 bp。Western blotting检测到融合蛋白pcDNA3.1myc-HisA- Smad2/3/4的表达。结论:成功构建pcDNA3.1myc-HisA-Smad2/3/4真核表达质粒,同时鉴定其融合蛋白的表达。     

表达HCV NS3蛋白肝细胞中ERK与NF-κB信号转导通路间的cross-talk研究

目的:研究表达丙型肝炎病毒非结构蛋白3(hepatitis C virus non-structural protein 3, HCV NS3)的肝细胞中细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase, ERK)与核因子κB(nuclear factor κB,NF-κB)信号转导通路间的cross-talk.方法:真核表达质粒pcDNA3.1-NS3转染人源永生化肝细胞系QSG7701,建立稳定表达HCV NS3蛋白的细胞株QSG7701/NS3.在丝裂原活化蛋白激酶的激酶(MAP kinase kinase, MEK)抑制剂PD98059(0,30,50,100μmol/L)处理细胞QSG7701/NS3前后,利用Western免疫印迹检测ERK的磷酸化水平及细胞周期素D1(cyclin D1)蛋白的表达;凝胶电泳阻滞迁移试验检测转录激活因子1(activator protrin 1, AP-1)、NF-κB等转录因子活性的改变;流式细胞术检测细胞周期各期百分数的改变;MTT比色法观察其对细胞增殖的影响.结果:HCV NS3蛋白能上调QSG7701细胞的ERK磷酸化水平及cyclin D1的表达水平;PD98059抑制HCV NS3蛋白介导的细胞增殖,下调AP-1和NF-κB的活性及cyclin D1的表达.结论:在表达HCV NS3蛋白的肝细胞中,ERK抑制剂能抑制肝细胞增殖,并呈明显的剂量依赖关系.ERK与NF-κB信号转导通路间可能存在cross-talk,并在肝细胞的增殖和恶性转化中发挥协同作用.     

持续表达的丙型肝炎病毒NS4B激活HepG2细胞内质网应激反应的研究

目的研究持续表达的丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白4B(NS4B)对HepG2细胞内质网应激反应的影响。方法 NS4B重组真核表达质粒pcDNA3.1(-)NS4B通过脂质体转染HepG2细胞,G418筛选、基因组PCR和Western blot鉴定稳定转染细胞;RT-PCR检测稳定转染细胞内人X盒结合蛋白1(XBP1)mRNA剪接,荧光素酶试验检测稳定转染细胞内GRP78启动子、XBP1启动子和核因子κB(NF-κB)活性。结果基因组PCR和Western blot鉴定证实NS4B基因整合到转染HepG2细胞的染色体上,并有效表达;在NS4B稳定转染的HepG2细胞中,检测到XBP1mRNA剪接、XBP1和Grp78启动子激活、Ca2+稳态变化及NF-κB激活。结论 NS4B在HepG2的稳定表达诱导了内质网应激反应,揭示NS4B可能通过诱导肝细胞内质网应激反应在HCV感染及其致病性中发挥作用。     

实时荧光PCR技术在丙型肝炎病毒基因型检测中的应用

目的 探讨实时荧光PCR技术在丙型肝炎病毒(HCV)基因型检测中的应用价值.方法 采用一步法逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)结合TaqMan技术,对HCV基因型进行实时荧光PCR检测;巢式RT-PCR扩增HCV的NS5B基因区域,测序后进行HCV基因亚型分析并与实时荧光PCR分型结果进行比较.结果 实时荧光PCR共分型119例,1型71例(59.7%),非1型48例(40.3%)其中110例成功进行测序分型;测序分型的110例中,1型73例(均为1b型),占66.4%,非1型37例(其中2a型7例、3a型6例、3b型3例、4a型1例、4k型1例、5a型1例、6a型17例、6n型1例),占33.6%.与110例测序分型的结果比较,实时荧光PCR分型总的符合率为71.8%(79/110),其中1型的符合率为80.9%(55/68),非1型的符合率为57.1%(24/42).结论 实时荧光PCR进行HCV基因型检测操作简便、快速,但分型结果特异性不高.     

HCV发夹状siRNA表达质粒的构建及作用研究

目的建立HCV感染动物模型,并对HCV进行RNA干涉。方法制备HCV感染的HepG2细胞,RT-PCR法鉴定后腋下注射裸鼠,免疫组化法检测瘤组织内HCV NS3表达情况。制备带绿色荧光蛋白（GFP）的HCVsiRNA表达质粒,转染HepG2细胞,观察GFP表达情况。将此质粒注射模型小鼠,取瘤组织,RT-PCR及免疫组化法对其进行检测。结果在HCV感染的裸鼠实体瘤中检测到HCV NS3蛋白的稳定表达。成功构建了HCV发夹siRNA表达质粒,该质粒转染细胞后能够在其内正确表达。将该质粒尾静脉注射HCV感染的模型小鼠,注射4d后瘤组织内HCV NS3抗原阳性细胞阴转。结论成功建立了HCV感染的裸鼠模型,构建了HCV发夹siRNA表达质粒,该质粒能成功地干涉模型小鼠中的HCV。     

HCV NS4B表达载体的构建及其对细胞凋亡的影响

目的构建丙型肝炎病毒（HCV）2a 型非结构蛋白4B（NS4B）的真核表达载体，并观察其对骨肉瘤细胞U2OS凋亡的影响。方法以质粒PJFH1为模板，通过PCR反应扩增4 目的基因片段，采用同源重组法与PCMV-tag2b 载体相连，转化大肠杆菌感受态DH5α，筛选正确的克隆。以脂质体为介导转染U2OS 细胞，通过Western blot 检测NS4B蛋白的表达，免疫荧光检测细胞的凋亡。结果构建pCMV-tag2b-NS4B 重组质粒，经测序其与NCBI 公布的序列完全一致，并可在U2OS 细胞中表达，DAPI 检测显示细胞凋亡率为（17.25±2.5）%，对照组凋亡率为（6.53±2.36）%。结论成功构建NS4B 的真核表达载体，并可在U2OS 细胞中表达，诱导细胞凋亡。     

丙型肝炎病毒NS5B区基因的扩增、克隆及序列分析

目的 对丙型肝炎病毒(HCV)NSSB区基因克隆并测序，研究其变异状况。方法 从HCV RNA阳性血清中抽提病毒RNA，利用巢式RT-PCR对NS5B区基因进行扩增，将扩增获得的靶cDNA克隆至P^KPL-3a质粒载体中，并以内引物为测序引物进行序列测定分析。结果 构建了已克隆HCVNS5B区基因的重组质粒KHC5—1；序列分析表明，与HCV-BDS株同源性最高，属于主要流行于我国的HCV 1b基因亚型。结论 证实了在NS5B区，与RNA依赖的RNA聚合酶(RDRP)活性密切相关的基元结构Gly-Asp-Asp及其相邻序列的同源性非常高。     

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5A反式激活SV40病毒早期启动子的研究

目的：探讨丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白NS5A的反式激活作用。方法：扩增HCV NS5A基因，构建HCV NS5A基因真核表达载体pcDNA3．1(-)—NS5A；并转染肝母细胞瘤细胞系HepG2细胞，免疫印迹方法检测转染细胞中HCV NS5A蛋白的瞬时表达；与报告质粒pCAT3--promoter共转染HepG2细胞，用酶联免疫吸附方法检测细胞中氯霉素乙酰转移酶(CAT)的表达活性。结果：质粒pcDNA3．1(-)—NS5A在HepG2细胞瞬时表达HCV NS5A蛋白，共转染实验中pcDNA3．1(-)—NS5A组的CAT表达活性是空质粒对照组的3．8倍。结论：构建的表达载体能在哺乳动物细胞中表达出相应蛋白，并能够反式激活SV40病毒早期启动子。本研究为进一步克隆HCV NS5A蛋白反式激活的靶基因，深入阐明HCV NS5A蛋白致肝细胞癌发生的分子生物学机制提供依据。     

丙型肝炎病毒NS3基因真核表达载体的构建及表达

目的:构建丙型肝炎病毒(HCV)非结构基因NS3的真核表达载体,并分析其在HeLa细胞中的表达。方法:以HCV全长cDNA质粒为模板进行PCR扩增,获得全长NS3基因,将其插入克隆载体pMD18-T中,鉴定后与真核表达载体pcDNA3.1(+)重组,用脂质体介导法转染HeLa细胞,间接免疫荧光法及Western blot鉴定转染后HCVNS3蛋白的表达。结果:PCR扩增的NS3序列正确,构建的真核表达载体成功转染HeLa细胞,表达的NS3蛋白相对分子量为70kD。结论:成功构建了真核表达载体pcDNA3.1(+)/NS3,并在HeLa细胞中获得表达。     

丙型肝炎病毒NS5A基因真核表达载体的构建

目的：构建HCV NS5A/pCI-neo真核表达载体,转染Huh-7细胞系,为体外高效表达NS5A蛋白奠定基础。方法：用PCR方法从带有丙型肝炎病毒NS5A基因的pC DNA 3.1（+）/HCV NS345质粒中扩增出HCV NS5A基因,然后TA克隆于pGEM-T载体中,转化大肠杆菌JM109。阳性克隆经测序鉴定,再经双酶切消化后插入真核表达载体pCI-neo上,经酶切鉴定与测序证实。结果：用PCR方法扩增出HCV NS5A基因全序列,因其 cDNA的G+C含量高直接测序未成功,后经TA克隆,筛选得到的阳性克隆经测序鉴定,与设计的HCV NS5A基因序列完全一致。经酶切连接并成功插入pCI-neo上。结论：成功构建了高效表达丙型肝炎病毒NS5A基因的pCI-neo真核表达载体。     

丙型肝炎病毒F蛋白对p21基因的调节作用

目的研究丙型肝炎病毒(HCV)F蛋白对细胞p21基因转录、表达的影响。方法PCR扩增HCV 1b来源的F基因,克隆至pcDNA3.1真核表达载体。F基因质粒转染HepG2细胞,48h后抽提细胞总RNA和总蛋白,实时定量PCR及Western blot检测p21基因表达变化。结果HCV F蛋白在HepG2细胞内瞬时表达,相对于空载体对照(目标基因表达量为1),HCV F基因质粒转染细胞的p21转录水平为3.2,蛋白表达水平为1.4。结论HCVF蛋白增加p21转录和表达,其生物学效应值得进一步研究。