补肾活血方对激素性股骨头坏死大鼠BMSCs分化影响的研究

目的 探讨补肾活血方含药血清对激素性股骨头坏死大鼠股骨近端骨髓间充质细胞体外分化的影响.方法 建立激素性股骨头坏死大鼠模型后,提取股骨近端骨髓单个核细胞,随机分为4组培养,空白血清对照组(A组)、补肾活血方含药血清低(B组)、中(C组)、高(D组)浓度组,分别加入重组人骨形态发生蛋白-2(rhBMP-2)诱导下的骨髓间充质细胞的培养体系,观察各组的细胞形态学、细胞内ALP含量及TGF-β基因表达.结果 补肾活血方含药血清能增强rhBMP-2的活性,促进股骨近端骨髓体外成骨细胞的分化增殖(P＜0.01),促进分化中的骨髓间充质细胞表达TGF-β1 mRNA(P＜0.01).结论 补肾活血方通过增强rhBMP-2活性及TGF-β1 mRNA的表达在骨坏死的修复中起关键作用.     

TGF-β2和geneX对BrdU标记骨髓间充质干细胞增殖与成骨分化的作用

［摘要］ 目的　研究TGF-β2和geneX对BrdU标记的骨髓间充质干细胞增殖与成骨分化作用的影响．方法　采用全骨髓贴壁培养法分离骨髓间充质干细胞,传代并鉴定,设实验组和空白对照组,实验组分4组:A组:BrdU标记后的BMSCs组;B组:BrdU标记后的BMSCs+TGF-β2组;C组:BrdU标记后的BMSCs+geneX组;D组:BrdU标记后的BMSCs+geneX+TGF-β2组．空白对照组为BrdU标记后的单纯BMSCs加入基础培养基避光培养．诱导培养后观察骨髓间充质干细胞生长形态、检测生长动力学（methyl thiazolyl tetrazolium,MTT）、碱性磷酸酶（ALP）和钙定量、进行细胞Von-Kossa法染色,观察成骨分化作用．结果　（1）4组BMSCs吸光度值（OD）分析比较显示:细胞组间差异有统计学意义（P＜0.05）;（2）各组BMSCs成骨诱导后碱性磷酸酶（ALP）和钙定量检测结果显示:细胞组间差异有统计学意义（P＜0.05）;（3）进行细胞Von-Kossa法染色,D组可见大量钙结节;C组可见较多钙结节;B组可见部分钙结节;A组可见少量钙结节;空白对照组未见钙结节．结论　（1）TGF-β2可促进骨髓间充质干细胞的增殖和诱导其向成骨细胞分化;（2）geneX可促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化,且在细胞因子TGF-β2联合作用下成骨分化作用更明显．     

阿仑膦酸钠对骨髓间充质干细胞骨向诱导的实验研究

目的探讨阿仑膦酸钠(ALN)对骨髓间充质干细胞(BMSCs)增殖和骨向分化能力的影响,观察其促BMSCs骨向分化过程中对转化生长因子β1(TGF-β1)及骨形成蛋白-2(BMP-2)表达的影响,分析可能的作用途径。方法以碱性磷酸酶(ALP)等指标确定干预药物不同浓度梯度中最佳促BMSCs骨向分化剂量;分组实验,通过检测诱导分化过程中ALP和钙化结节等指标的表达,观察其对BMSCs骨向分化能力的影响;ELISA法检测骨向分化过程中TGF-β1、BMP-2的表达。结果 ALN最佳促BMSCs增殖和骨向分化浓度为1×10-8mol/L,该浓度ALN能促进成骨指标的表达和TGF-β1和BMP-2分泌增加;具有促BMSCs骨向分化能力的ALN各诱导组均伴随TGF-β1和BMP-2分泌增加。结论 ALN能促进BMSCs增殖和骨向分化;在BMSCs骨向分化过程中,上调TGF-β1、BMP-2的表达量可能是各干预药物促进MSCs骨向分化的作用机制之一。     

不同浓度富血小板血浆对体外培养骨髓间充质干细胞增殖活性的影响

目的:探讨不同浓度的富血小板血浆(PRP)在不同时间段对体外培养骨髓间充质干细胞(MSCs)增殖活性的影响。方法:将体外培养的MSCs分为对照组(单纯血清培养组)和不同浓度的PRP组(0.5%,1.0%,1.5%),用四唑盐比色法(MTT)检测在不同作用时间(24h、48h、72h)对骨髓间充质干细胞增殖活性的影响。免疫组化方法检测细胞CD44、CD29、CD34的变化。结果:PRP中血小板浓度为全血的3.18倍,TGF-β和PDGF的浓度为全血的3.40倍;培养的细胞呈纤维状、克隆样生长;免疫组化表明CD29、CD44呈阳性表达,CD34呈阴性表达;MTT法显示不同浓度的PRP组在24h、48h、72h的平均吸光度(OD)值均高于对照组。结论:不同浓度的PRP在不同时间段可以促进骨髓间充质干细胞的增殖,并且随着浓度的增加PRP促进骨髓间充质干细胞增殖作用也增强。     

Smad3选择性调节TGF-β1促进大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的实验研究

目的探讨转化生长因子β1（TGF-β1）信号转导通路下游信号分子Smad2、Smad3在TGF-β1促进大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）成骨分化中的作用。方法采用RT-PCR、Western blot检测TGF-β1促MSCs成骨分化过程中Smad2、Smad3mRNA和蛋白表达的变化;脂质体介导稳定转染Smad3ΔC,间接免疫荧光试验鉴定;采用RT-PCR检测转染细胞中碱性磷酸酶（ALP）和核心结合因子（cbfa1）mRNA的表达,用对硝基苯磷酸盐（PNP）法检测细胞ALP活性,用茜素红染色法检测细胞矿化能力,观察Smad3ΔC对MSCs成骨分化的影响。结果在TGF-β1刺激后24h,MSCs中Smad3的mRNA和蛋白表达量明显减少（P〈0.01）,而整个刺激过程中,Smad2的mRNA和蛋白表达量无明显变化（P〉0.05）;稳定转染细胞中c-Myc抗原阳性表达;受TGF-β1刺激后,MSCs和V-MSCs（空载体转染组）中ALP、cbfa1mRNA的表达水平、矿化能力明显高于Smad3ΔC-MSCs;随TGF-β1刺激时间延长,Smad3ΔC-MSCs中ALP活性增加缓慢,仅于48h有明显增加（P〈0.05）,但与同时段MSCs和V-MSCs中ALP活性相比,差异有极显著性意义（P〈0.01）。结论TGF-β1促进MSCs成骨分化这一生物学效应的输出受Smad3特异性和选择性的调节。     

骨碎补总黄酮对大鼠骨髓间充质干细胞倍增反应和分化的作用机制实验

背景 骨碎补总黄酮(total?flavonoids?of?rhizome?drynariae,TFRD)是骨碎补的主要活性成分,近年来许多研究表明TFRD可有效提高骨质疏松症患者骨密度,进而促进骨愈合,但目前其作用的具体分子机制尚不完全明确.目的 探讨TFRD对大鼠骨髓间充质干细胞(bone?marrow?mesenchymal?stem?cells,BMSCs)倍增反应和分化作用的分子机制.方法 获取SD大鼠的骨髓间充质干细胞.细胞培养基中加入TFRD,根据TFRD浓度的不同分为低浓度组(TFRD?0.1?mg/L)、中浓度组(TFRD?1.0?mg/L)、高浓度组(TFRD?10.0?mg/L),细胞培养基中未加入TFRD的作为对照组.采用CCK8法检测各组BMSCs细胞增殖情况,茜素红染色法检测各组成骨分化情况,RT-PCR法和Western?blot法检测中浓度组与对照组β-catenin、RunX2、PPARG的mRNA和蛋白表达情况.结果 不同时间点低浓度、中浓度、高浓度TFRD组吸光度值与对照组比较均显著升高(P<0.05);4组矿化结节数统计,中浓度组高于其他三组,差异有统计学意义(P<0.05);中浓度组与对照组比较,β-catenin和RunX2?mRNA表达明显升高,PPARG?mRNA表达明显降低(P<0.05);中浓度组与对照组比较,β-catenin和RunX2蛋白表达明显升高,PPARG蛋白表达明显降低(P<0.05).结论 TFRD可促进BMSCs细胞增殖和成骨分化,其作用机制可能与上调β-catenin、RunX2表达,抑制PPARG表达有关.     

间充质干细胞抑制T淋巴细胞增殖减轻移植后GVHD机制研究

目的体外培养间充质干细胞(MSCs)并研究其抑制T淋巴细胞增殖减轻移植后移植物抗宿主病(GVHD)的机制。方法采用密度梯度离心法体外培养间充质干细胞,通过免疫细胞化学染色观察其是否表达TGF-β1及HGF,并在与异体T淋巴细胞共培养体系中加入抗-TGF-β1、抗HGF,通过MTT法检测T淋巴细胞增殖活性。结果间充质干细胞与淋巴细胞混合培养后淋巴细胞的增殖活性被明显抑制(P<0.001),免疫细胞化学染色发现间充质干细胞高度表达TGF-β1和HGF,在混合培养体系中加入两种细胞因子的抗体可以使T淋巴细胞的增殖活性恢复到未与间充质细胞共培养前的状态(P>0.05)。结论间充质干细胞分泌TGF-β1与HGF两种细胞因子抑制T淋巴细胞增殖减轻移植后GVHD,且二者具有协同作用。     

不同低氧分压对SD大鼠骨髓间充质干细胞增殖分化的影响

目的研究体外不同低氧分压对SD大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)增殖分化的影响。方法将体外培养的MSCs,分组置于常氧(21%)和低氧(2%、4%、6%、8%)培养箱中培养,用MTT法分别于1、3、5、7、9d检测细胞的增殖活性;用酶联免疫检测法分别于1、3、5、7、9d检测细胞碱性磷酸酶(ALP)和Ⅰ型胶原蛋白(COLⅠ)的表达。结果不同低氧分压对MSCs细胞增殖活性有明显促进作用(P<0.05);低氧分压抑制MSCs细胞的ALP和COLⅠ表达(P<0.05)。结论低氧微环境可促进MSCs的增殖活性,但对细胞的成骨向分化起到抑制作用。     

脂质体介导转化生长因子-β1基因修饰骨髓间充质干细胞成软骨分化

目的 脂质体介导TGF-β1目的基因转染骨髓间充质干细胞(MSC)，研究对MSC成软骨分化的特异性细胞外基质的影响。方法 以梯度离心结合换液法获得并纯化骨髓间充质干细胞(MSCs)，采用脂质体介导法将重组真核表达质粒pcDNA3-TGF-β1转染MSCs，Rr-PCR和Western blot鉴定后，对转染后骨髓间充质干细胞的Ⅱ型胶原(ColⅡ)、纤维连接蛋白(FIN)的表达行RT-PCR和Western blot检测。结果 获得纯度较高的成年中国小型猪骨髓间充质干细胞(MSCs)；脂质体为介导将全长人TGF-β1目的基因导入MSC，经RT-PCR和Western blot鉴定转染成功，转染后的MSC较未转染MSC成软骨分化特异性细胞外基质ColⅡ、FNmRNA和蛋白表达明显增强。结论以脂质体介导法可以将TGF-β1目的基因转染骨髓间充质干细胞，转染后成软骨分化的特异性细胞外基质增多。     

生长因子浓度和添加方式对兔间充质干细胞生长的影响

目的探讨不同浓度bFGF和TGF-β1、bFGF不同添加方式对间充质干细胞增殖的影响。方法取兔间充质干细胞(MSCs),梯度离心,分离培养。取第4代细胞,分别添加不同浓度bFGF(0、10、50、80、100ng/ml)及序贯或同时加入TGF-β1、bFGF。观察细胞形态变化,MTT法测定各组细胞吸光值。结果各组细胞形态无显著差异。高浓度bFGF及序贯加入TGF-β1、bFGF,吸光值测定高于其他各组(P<0.05)。结论bFGF浓度增加,促增殖作用加强。序贯添加TGF-β1、bFGF,小剂量可明显促进细胞增殖。     

自噬活性改变对骨髓间充质干细胞成骨分化能力的影响

目的 观察骨髓间充质干细胞(MSCs)自噬活性的改变对其向成骨细胞分化能力的影响,初步探讨自噬在骨髓MSCs成骨分化中的作用.方法 不同浓度的雷帕霉素处理骨髓MSCs 48 h后,向成骨细胞诱导分化2周.免疫荧光激光共聚焦法检测LC3表达;单丹磺酰戊二胺(MDC)荧光染色检测自噬囊泡;Western blot检测LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ的表达;实时定量PCR检测成骨相关基因ALP和Runx2表达;Von Kossa染色检测钙质沉积程度改变.结果 经雷帕霉素处理后,激光共聚焦和Western blot检测均可见骨髓MSCs中LC3的表达明显增加;自噬囊泡数量增加;成骨相关基因ALP和Runx2的mRNA表达量明显减少;Von kossa染色可见MSCs钙质沉积程度减弱.上述改变呈剂量依赖性.结论 骨髓MSCs的基础自噬活性较低,雷帕霉素能够增加骨髓MSCs的自噬活性,但同时减弱其向成骨细胞分化的潜能.自噬可能参与骨髓MSCs向成骨细胞分化的过程.     

细胞间直接接触对骨髓间充质干细胞分化为心肌细胞作用的研究

目的探讨体外心肌细胞(cardiomyocytes,CM)与骨髓间充质干细胞(bone marrow stromal cells,MSCs)共培养时,骨髓间充质干细胞与心肌细胞间直接接触对其分化为心肌细胞的影响.方法 API(4,6-二咪基-2-苯吲哚盐酸)标记后,分别与心肌细胞按接触组和非接触(millicellTM-HA半透膜)组培养,1周后应用免疫荧光检测MSCs肌钙蛋白T(cTnT)的表达,并用RT-PCR方法检测NKx-2.5、GATA-4、TGF-β的表达.结果接触培养组中可见DAPI标记的骨髓间充质干细胞表达cTnT,NKx-2.5、GATA-4、TGF-β有高表达,非接触组的MSCs未见cTnT的表达,相关基因仅有低表达.结论心肌细胞与MSCs的直接接触,是诱导MSCs分化为心肌细胞的重要因素.     

兔自体骨髓间充质干细胞移植修复关节软骨缺损的研究

目的:研究将体外培养的兔骨髓间充质干细胞(MSCs)定向诱导分化为成骨细胞的方法, 探讨其作为组织工程化骨的种子细胞的可行性.方法:采用Percoll分离液,从兔的骨髓组织中分离骨髓间充质干细胞,用低糖型的DMEM( Dulbecco's modified Eagle's medium)培养液中添加成骨诱导剂地塞米松、β-甘油磷酸钠及抗坏血酸进行培养.诱导2周后钙-钴法染色检测碱性磷酸酶(ALP)表达, 诱导4周后VonKos-sa染色检测钙结节形成.结果:第3代兔MSCs呈典型的成骨细胞形态,诱导2周ALP染色阳性率达80%,诱导4周后VonKossa染色可见钙结节形成.结论:经过分离纯化后的兔骨髓基质细胞在体外培养条件下可以分化为成骨细胞.     

盘龙七片通过调节Wnt/β-catenin通路对BMSCs成骨分化的影响

目的 观察盘龙七片对人骨髓间充质干细胞(BMSCs)分化的作用并探讨其机制。方法 BMSCs细胞分为对照组和盘龙七片处理组。MTT检测细胞增殖并确定盘龙七片最佳浓度。RT-PCR和western blot分别检测Runx2、Osterix、COL1A1的mRNA和蛋白表达。检测骨钙素、碱性磷酸酶(ALP)及Wnt/β-catenin通路蛋白的表达水平。结果 盘龙七片促进BMSCs增殖,且随着质量浓度的升高增加更明显(P<0.05)。盘龙七片组细胞中Runx2、Osterix、COL1A1的mRNA和蛋白表达高于对照组(P<0.05),骨钙素水平和ALP活性高于对照组(P<0.05);Wnt3和β-catenin的蛋白表达高于对照组(P<0.05),p-GSK-3β的蛋白表达低于对照组(P<0.05)。结论盘龙七片能够促进BMSCs细胞成骨分化,且其作用可能是通过激活Wnt/β-catenin通路产生的。     

去卵巢骨质疏松大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化能力研究

目的　探讨去卵巢骨质疏松大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)成骨分化的特点。方法　选用3月龄健康SD雌性大鼠行双侧卵巢切除术,建立骨质疏松症的动物模型。实验分为正常大鼠髓间充质干细胞组(MSCs controlgroup )、骨质疏松大鼠骨髓间充质干细胞组(MSCs ovx group)、正常骨髓间充质干细胞成骨诱导组(OSI controlgroup)、骨质疏松骨髓间充质干细胞成骨诱导组(OSI ovx group)。使用密度梯度离心法分别获取正常大鼠和骨质疏松大鼠MSCs,体外培养传至3、4代后,流式细胞技术检测MSCs control group和MSCs ovx group细胞周期及增殖指数(PI) ;加入含有地塞米松(10 - 8m ol/L) ,β-甘油磷酸钠(10 - 2 mol/L) ,抗坏血酸(5 0 μg/m l)的成骨诱导液进行成骨诱导,采用磷酸对硝基苯测定方法检测碱性磷酸酶(AL P)表达量,同位素标记方法检测骨钙素(BGP)分泌量。结果　1PI:MSCs control group高于MSCs ovx group(P<0 .0 5 )。2 AL P的表达量:成骨诱导第7d和14 d时,OSI各组均明显高于相应的MSCs组(P<0 .0 5 ) ;OSI control组明显高于OSI ovx组(P<0 .0 5 )。随着时间延长,OSI各组AL P表达量呈升高趋势。3BGP的分泌量:成骨诱导14 d、2 1d、2 8d时,OSI各组均明显高于相应的MSCs组(P<0 .0 5 ) ;OSI control组明显高于OSI ovx组(P<0     

大鼠骨髓间充质干细胞在淋巴细胞增殖中的免疫调节作用

目的:探讨大鼠骨髓间充质干细胞(BM MSCs)在体外对淋巴细胞增殖的影响及其作用机制。方法:分离和鉴定大鼠MSCs,与淋巴细胞、BRL、刀豆蛋白(ConA)建立共培养体系,混合培养0h、24h和48h后,用ELISA方法检测上清中TNF-α、TGF-β和IL-10的分泌量,MTT方法检测淋巴细胞数目变化,流式细胞仪检测调节T细胞(Treg)的含量变化。结果:加入MSCs后TNF-α分泌量降低,TGF-β和IL-10分泌量升高,OD值明显低于未加MSCs组的对照组(P<0.05),Treg含量升高。结论:骨髓MSCs在单独存在以及与BRL同时存在时均对淋巴细胞的增殖具有抑制作用,并且作用程度随时间变化不明显,其中IL-10、TGF-β以及Treg参与了这种免疫抑制过程。     

人骨髓间充质干细胞向成骨细胞诱导分化条件的优化研究

目的探讨使人骨髓间充质干细胞(MSCs)向成骨细胞诱导分化的高效诱导体系。方法按照不同浓度的地塞米松、β-甘油磷酸钠和维生素C分将实验为4组,并设立空白对照组,诱导人骨髓间充质干细胞向成骨细胞定向分化,应用碱性磷酸酶钙钴法染色检测分化的成骨细胞的成骨特性。结果在地塞米松10-8mol/L、β-甘油磷酸钠10-2mol/L、维生素C 3×10-4mol/L时,积分光密度值最高。结论 MSCs具备较强的增值能力和良好的成骨特性,可为骨缺损修复技术优化提供基础。     

炎性微环境下TGF-β1通过TGF-β1/Smad3 通路促进BMSCs成骨分化

目的 研究炎性微环境下转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)对大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)成骨分化的影响及作用机制。方法 应用肿瘤坏死因子-α (tumor necrosis factor-α,TNF-α)体外模拟炎性微环境,检测不同浓度TGF-β1对BMSC增殖活性的影响。实验分为对照组[BMSC+成骨诱导液(osteogenic medium,OM)]、实验组(BMSC+TGF-β1+OM)和抑制组[BMSC+SB431542 (TGF-β1拮抗剂)+OM]。应用ALP染色、茜素红染色、实时荧光定量聚合酶链反应(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)及Western blot法对BMSCs成骨分化能力和TGF-β信号通路因子Smad2、Smad3进行检测并比较3组间的差异。结果 低浓度TGF-β1作用下BMSCs增殖活性较高,高浓度(50ng/ml)抑制BMSCs增殖活性;成骨诱导7天和10天时,实验组与其他两组比较,ALP染色较深、面积最大;茜素红染色结果显示,实验组体外矿化结节形成均高于其他两组;RT-qPCR检测结果显示,实验组成骨分化基因OPN、RUNX2与ALP表达均增高,TGF-β信号通路中Smad3在实验组表达最高,抑制组表达最低,差异有统计学意义(P<0.01)。Western blot法检测结果显示,实验组内OPN、RUNX2与ALP蛋白表达水平增高,差异有统计学意义(P<0.05);TGF-β信号通路中Smad3蛋白表达在3组中差异不明显,而p-Smad3在实验组中表达明显增高、抑制组中明显降低,差异有统计学意义(P<0.01)。结论 炎性微环境中TGF-β1通过激活TGF-β/Smad3信号通路促进了BMSCs成骨分化。     

蛋白激酶CβⅡ负调控小鼠骨髓间充质干细胞的成骨分化

目的观察蛋白激酶C(PKC)各亚型在小鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)成骨分化中的作用。方法Western blot检测小鼠BMSCs成骨分化中PKC各亚型的活化情况;利用PKC阻断剂GFX分析PKC在BMSCs体外成骨分化中的作用;碱性磷酸酶(ALP)试剂盒检测成骨早期分化指标ALP的活性;茜素红染色检测BMSCs体外矿化能力;实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测成骨分化相关基因Runx2、Ⅰ型骨胶原a1(ColⅠa1)和ALP的表达情况。结果小鼠BMSCs成骨分化过程中,仅检测到PKCβⅡ亚型活化,其他亚型均无明显活化。利用PKC阻断剂GFX抑制PKCβⅡ活化后,茜素红染色结果显示BMSCs的成骨分化过程受到促进;PCR结果显示成骨分化相关基因Runx2、ColⅠa1和ALP的mRNA水平均有不同程度增加;ALP活性检测结果也显示BMSCs的成骨分化过程受到促进。结论PKCβⅡ可负调控小鼠BMSCs的成骨分化。     

大鼠骨髓间充质干细胞的分离纯化与成骨鉴定

[目的] 研究大鼠骨髓间充质干细胞 (MSCs) 的分离纯化和在诱导条件下的成骨能力.[方法] 取SPF级SD大鼠6只,采用全骨髓贴壁培养法分离成年大鼠骨髓间充质干细胞,取传至第3代的MSCs进行细胞形态和免疫组化鉴定;应用含地塞米松、B-甘油磷酸钠和维生素C的诱导分化培养液诱导传代细胞向成骨细胞分化,检测碱性磷酸酶 (ALP) 的活性和细胞矿化作用进行成骨细胞鉴定.[结果] 全骨髓贴壁培养法能有效分离纯化大鼠骨髓MSCs,MSCs 在含体积分数为10%胎牛血清的低糖 DMEM(L-DMEM) 养液中生长性状相对稳定,增殖速度快;诱导条件下,细胞ALP活性明显增高,并出现了矿化结节.[结论] 建立了一种体外分离纯化、培养扩增大鼠骨髓 MSCs 的方法,成骨能力肯定,为中药蛋白质组学研究提供材料基础.