一步法实时荧光定量PCR检测白血病WT1基因mRNA

目的 构建RT-PCR一步法实时荧光定量PCR检测WT1基因mRNA表达的方法,准确定量检测白血病患者微小残留病,指导临床判断预后和早期预测复发.方法 从K562细胞提取的RNA用特异性引物扩增WT1基因,pMD18-T载体克隆法构建荧光定量PCR标准模板,建立RT-PCR一步法实时荧光定量PCR检测wTl基因方法,并对该方法的灵敏度、重复性和稳定性进行检测.结果 构建的RT-PCR一步法实时荧光定量PCR方法的灵敏度达10-4水平:以拷贝数为1.0x106～1.0×102 cps/ml的标准品,分别进行RT-PCR一步法实时荧光定量PCR扩增后,标准品的Ct值与该标准品模板起始浓度的对数存在线性关系,r值达0.998:管间和批间的变异系数均小于8%.结论 所建立RT-PCR一步法实时荧光定量PCR检测WT1基因方法的灵敏度、重复性和特异性好;RT和PCR反应过程一步完成,更简便快捷,减少加样和污染机会,更适合临床检测.     

双链置换探针实时荧光定量PCR结合融解曲线特性分析检测高危型人乳头瘤病毒16、58亚型

目的:建立一种准确、快速、实用的检测人乳头瘤病毒(HPV)16、58亚型的方法。方法:根据HPV16和HPV58亚型的序列特异性各设计一对引物和一对型特异性双链置换探针,采用实时荧光PCR扩增后,通过非高分辨的融解曲线分析在同一荧光通道内有效区分两种HPVDNA基因亚型。结果:1ng/μl、0.1ng/μl和0.01ng/μlHPV16和HPV58模板荧光PCR扩增及融解曲线分析显示,融解曲线分析较定量扩增更灵敏、特异。HPV16和HPV58融解曲线对应的Tm值分别为83.5°C和87°C。结论:所建双链置换探针实时荧光定量PCR结合融解曲线分析检测HPV16、58亚型的方法灵敏、特异,有临床应用价值。     

实时荧光定量PCR法检测人粪便中双歧杆菌方法的建立及评价 

目的：建立利用实时荧光定量PCR法检测人粪便中双歧杆菌浓度的方法,为检测人肠道内菌群浓度提供有效手段。方法：提取60例儿童粪便样本中细菌总DNA。选择细
菌种属的特异性基因16SrRNA作为扩增区,依据双歧杆菌的16SrRNA序列共设计3条引物,以常规PCR扩增出的16SrRNA部分基因片段制作标准品,应用SYBR Green Ⅰ双链嵌合染料,对连续稀释的标准品及待测样本进行分析,建立绝对定量的标准曲线,同时计算出待测样本双歧杆菌浓度;根据可检测到的标准品最低拷贝数计算反应灵敏度;分析PCR产物熔解曲线评价反应特异性;重复检测梯度稀释的标准品,用相同浓度标准品的Ct值变异系数（CV）评价反应稳定性。结果：常规PCR扩增出双歧杆菌16SrRNA部分基因片段长度约为613 bp,测序结果正确,成功构建了双歧杆菌实时荧光定量PCR反应中的标准品;生成的标准曲线R2=0.999,最低检测限度为每个反应1.48×102个拷贝;实时荧光定量PCR产物的熔解曲线为单峰。对待测样本分批进行荧光定量PCR检测,各组间每微升1.48×103~1.48×107个拷贝浓度标准品Ct值的变异系数为2.94%、3.39%、3.54%、3.08%和3.34%。60份儿童粪便样本双歧杆菌浓度对数值为7.77±0.86（拷贝数?g-1湿便）。结论：本研究所建立的实时荧光定量PCR法敏感性高、特异性强,且重复性好,适用于检测人粪便中双歧杆菌的浓度。     

风疹病毒RNA Taq Man实时荧光定量RT-PCR方法及参考标准的建立

目的建立风疹病毒RNA TaqMan实时荧光定量RT-PCR方法,制备风疹病毒RT-PCR扩增子作为该方法的参考标准品。方法设计引物与探针,优化PCR条件,建立风疹病毒RNA实时荧光定量RT-PCR方法,并制备风疹病毒RT-PCR扩增子作为该方法的参考标准品。结果制备的风疹病毒特异性扩增子参考标准品为503 bp的片断,原液浓度为2.75×109copies/μl,纯度为92%;采用该特异性扩增子参考标准品建立的标准曲线相关系数r为-0.9993（r2=0.9986）,P〈0.001。结论本研究建立的风疹病毒特异性扩增子参考标准品稳定性好,纯度高;特异性扩增子参考标准品浓度的对数值与Ct值之间具有良好的线性关系,证实了本研究建立的风疹病毒RNATaqMan实时荧光定量RT-PCR方法定量的准确性。因而,建立的风疹病毒RNA实时荧光定量RT-PCR方法简便快捷、定量准确,可用于临床标本中风疹病毒RNA的定量检测。     

骨髓间充质干细胞Hey1基因表达水平荧光定量RT-PCR方法的建立

目的:建立骨髓间充质干细胞中Notch信号通路靶基因Hey1表达水平的荧光定量RT-PCR方法.方法:培养骨髓间充质干细胞(C2C12),提取总RNA,验证内参基因β-actin和目的基因Hey1的扩增效率,优化PCR条件,分析扩增曲线、融解曲线,凝胶电泳验证定量PCR产物.结果:内参基因β-actin和目的基因Hey1扩增效率一致(扩增曲线斜率差＜0.1),提示可以使用比较Ct法对Hey1进行相对定量分析;扩增曲线、融解曲线及凝胶电泳结果提示PCR产物特异性好.结论:本研究所建立的用于Hey1基因表达分析的定量RT-PCR检测方法,准确可靠,可用于Bmp9和Notch信号通路的研究.     

实时荧光定量PCR方法检测急性髓系白血病FLT3基因mRNA的表达

[摘　要]　目的 构建检测急性髓细胞白血病FLT3基因mRNA表达的标准品重组质粒和荧光定量PCR方法，为进一步研究FLT3基因表达与急性髓细胞白血病的关系奠定基础。方法 利用引物设计软件设计出扩增FLT3基因的引物和特异性荧光探针。提取K562细胞株总RNA，经RT-PCR 扩增，产物纯化后与pUCm-T Vector连接，转化到大肠杆菌DH5α，筛选得到标准品的质粒FLT3P。 建立荧光定量PCR 检测 FLT3基因技术方法，建立标准曲线并检测15例初治AML患者。结果 重组质粒进行荧光定量PCR 扩增出现强烈的荧光值增长，表明FLT3 cDNA已成功克隆。以109～105copies/μl不同稀释水平的标准品进行荧光定量PCR 扩增, 所获得的Ct 值与标准品浓度的对数存在良好线性关系, 标准曲线回归系数为0.9998 。AML病例 FLT3表达水平显著高于正常对照组（p=0.017）， 且不同病例的表达水平存在较大差异。结论 成功构建用于定量检测FLT3 mRNA表达得荧光定量PCR的标准品和技术方法; AML病例 FLT3表达水平显著增高。     

实时荧光RT-PCR定量检测BRMS1基因表达

目的建立一种实时荧光RT-PCR定量检测乳腺组织中BRMS1mRNA表达水平的方法。方法采明逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增目的基因片段,并实时检测产物的荧光强度,根据标准品建立的标准曲线,计算出待测样本中BRMS1mRNA含量,并以BRMS1mRNA与GAPDHmRNA的比值作为BRMS1mRNA的表达水平。结果实时荧光RT-PCR检测BRMS1及GAPDH的线性范围为4×102-4×108拷贝/μl。批内和批间变异系数分别为3.9%-4.6%和4.8%-5.5%。BRMS1mRNA表达范围为0-1.65.结论实时荧光定量检测BRMS1mRNA含量的方法具有较高的灵敏度和较好的重复性。     

NASBA方法制备HIV／SHIV RNA定量测定标准品及其应用

目的 应用NASBA方法制备SIV/SHIV RNA定量测定标准品.方法 应用NASBA方法直接扩增SIVmac251病毒gag基因上1476～1685之间的片段,扩增的RNA产物(RS-NASBA)纯化后10倍系列稀释,测定定量曲线、标准曲线,测定该标准品的稳定性和重复性.结果 应用Qiagen公司QuantiTect SYBR GREEN RT-PCR Kit,该标准品可精确定量到2.033×10 copies/μL.结论 外标准品RS-NASBA纯度高,稳定性好,可用于定量测定SIV/SHIV RNA拷贝数.     

实时定量RT-PCR检测博尔纳病病毒方法的建立

目的 建立检测博尔纳病病毒(BDV)RNA的实时定量RT-PCR(real-time RT-PCR)方法.方法 设计BDV-p40基因特异性引物和探针,优化反应条件;并以已知的BDV-p40基因扩增产物的克隆为标准品,建立标准曲线;然后对已知BDV RNA进行实时定量RT-PCR的特异性和敏感性检测.结果 建立了特异检测BDV RNA的实时定量RT-PCR技术,并且可以检测到感染细胞中1个拷贝以上BDV RNA.结论 本技术可以直接用于BDV感染的检测和定量分析.     

人肠系膜动脉平滑肌sGCα和sGCβ基因表达水平检测方法的建立

目的：建立实时荧光定量PCR检测人肠系膜动脉平滑肌sGCα和sGCβ基因表达水平的检测方法,并构建相应质粒标准品,为进一步研究基因功能奠定基础。方法：提取人肠系膜动脉组织总RNA,采用RT-PCR方法获取sGCα、sGCβ、GAPDH基因片段,与pMD-18T vector连接,并转化到大肠杆菌DH5α细胞,通过PCR和测序鉴定重组质粒。提取含目的基因的质粒作为标准品,采用SYBR GreenⅠ法检测人肠系膜动脉平滑肌sGCα和sGCβ基因表达和构建标准曲线。结果：人肠系膜动脉平滑肌存在sGCα和sGCβ基因表达,质粒标准品经过PCR鉴定并测序,与数据库公布的序列完全一致,标准曲线线性关系好,相关系数R2〉0.99。结论：建立了稳定的定量检测方法,并成功用于检测人肠系膜动脉平滑肌sGCα和sGCβ基因表达,构建质粒标准品能用于后续实验。     

真核表达载体pcDNA3-FHIT的构建及其在COS-1细胞中瞬时表达

目的 :构建FHIT基因的真核表达载体及测定其在COS 1细胞中的瞬时表达。方法 :应用RT PCR方法从正常人甲状腺组织中克隆出FHIT基因 ,在KpnⅠ和 BstXⅠ两个酶切位点插入真核表达载体 pcDNA3中 ,通过酶切分析、基因测序和免疫细胞化学方法鉴定插入基因片段的正确性。结果 :FHIT基因在载体 pcDNA3中插入的位点是正确的 ,没有缺失、插入等突变 ,并在COS 1细胞中有较高的瞬时表达。结论 :成功构建了FHIT基因的真核表达载体 ,并获得其在COS 1细胞中较高的瞬时表达 ,为该基因在基因治疗中的研究提供了有力的分子工具     

FHIT基因转染对人结肠癌细胞系SW480增殖和侵袭力的影响

目的 探讨真核表达质粒pRc/CMV2-FHIT对结肠癌细胞株SW480增殖和侵袭活性的影响。方法 将携有FHIT基因的重组真核表达质粒pRc/CMV2-FHIT转化大肠杆菌DH5α并扩增,抽提纯化质粒并进行酶切鉴定,pRc/CMV2-FHIT体外转染SW480细胞（SW480-FHIT）,筛选稳定转染的细胞并扩增培养,以转染了空质粒pRc/CMV2的SW480细胞（SW480-pRc/CMV2）和正常SW480细胞为对照,用RT-PCR检测FHIT的表达情况,并用四甲基偶氮唑蓝比色法（MTT法）和细胞侵袭实验分别检测FHIT基因转染前、后SW480细胞增殖和侵袭活性的变化。结果 pRc/CMV2-FHIT的酶切鉴定证实含有目的基因FHIT;SW480-FHIT细胞的RT-PCR产物经凝胶电泳有明显的阳性条带,而对照组则无;MTT实验结果显示重组质粒转染组SW480细胞的增殖明显受到抑制;Transwell体外侵袭实验显示转染pRc/CMV2-FHIT能明显抑制SW480细胞的体外侵袭力(P<0.01)。结论 应用基因转染技术重表达FHIT基因能有效抑制细胞的生长、增殖及侵袭活性,为以FHIT为靶向的结肠癌基因治疗提供了新的思路和手段。     

抑癌基因FHIT真核表达质粒的构建

目的 构建抑癌基因FHIT真核表达质粒pHCMVsp1A-FHIT。方法 用限制性内切酶EcoRⅠ酶切抑癌基因FHIT的克隆载体pGEM-FHIT获得FHIT基因片段,长度为0.9kb,将其插入真核表达载体pHCMVsp1A CMV启动子的下游,用HindⅢ酶切鉴定FHIT基因插入方向。结果 PCR扩增及EcoRⅠ、HindⅢ酶切鉴定证实FHIT基因以正确方向插入表达质粒pHCMV1A中。结论 成功构建抑癌基因FHIT真核表达质粒pHCMVsp1A-FHIT,为研究FHIT的抑癌作用提供有效的分子工具。     

Satb2基因实时荧光定量聚合酶链反应标准品的制备及应用研究

目的:制备用于Satb2基因实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)的标准品。方法:提取胚胎上颌突组织总RNA,行逆转录反应获得第一链的cDNA,再通过PCR回收获得预期Satb2基因片段;通过T-A克隆将该片段插入pGMT质粒载体;大量提取质粒,定量后进行标准曲线的制作和实时荧光定量PCR。结果:重组质粒经PCR扩增及序列测定表明,pGMT/Satb2基因已成功克隆。结论:所构建的pGMT/Satb2基因实时荧光定量PCR检测标准品应用Taqman荧光探针技术建立的标准曲线线性关系好,灵敏度和特异性高,准确可靠,此法可作为实时荧光定量PCR检测Satb2基因的标准方法。     

FHIT基因转染对肝癌细胞系HepG2的作用

目的:探讨外源性FHIT基因的表达对肝癌细胞株HepG2的影响. 方法:用脂质体介导法将pcDNA3.1-FHIT及空载体pcDNA3.1( )导入肝癌细胞系HepG2中,G418选择培养,经免疫组化和Western blotting鉴定其过表达. 用流式细胞仪、普通光镜、透射电镜观察FHIT基因的表达对HepG2细胞凋亡和增殖的影响. 结果:获得FHIT基因稳定表达的肝癌细胞株HepG2-FHIT. 转染FHIT基因的HepG2细胞的生长速率明显下降,电镜下超微结构发生了凋亡早期改变,流式分析细胞的生长周期可见S/G2期阻滞. 结论:外源性FHIT基因在体外通过诱导其凋亡及细胞周期俘获作用可有效抑制HepG2生长增殖.     

FHIT基因过表达对人胃癌细胞系MKN-45增殖和粘附的影响

目的探讨FHIT基因过表达对人胃癌细胞系MKN-45增殖和粘附能力的影响。方法将载有人外源性FHIT基因的真核表达质粒pcDNA3.1-FHIT转染FHIT基因mRNA阴性表达人胃癌细胞系MKN-45,分别用MTT法、平板克隆形成实验、黏附实验检测转染前后细胞增殖活性、克隆形成能力及粘附能力的变化。结果FHIT基因的过表达可降低MKN-45细胞的增殖和克隆形成能力(P<0.05),但是对MKN-45细胞与内皮细胞的粘附能力无明显影响。结论FHIT基因过表达可抑制人胃癌细胞系MKN-45的增殖和克隆形成,对于MKN-45细胞与内皮细胞的粘附能力无明显影响。     

FHIT基因mRNA在良、恶性胸腔积液中的表达

目的:检测FHIT基因mRNA在良、恶性胸腔积液中的表达水平。方法:采用巢式逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法对40例良、恶性胸腔积液进行FHIT基因mRNA表达的检测。随机抽取3例FHIT基因的RT-PCR扩增产物的目的片段进行DNA序列测定。结果:22例恶性胸腔积液标本中FHIT基因缺失或异常转录的表达率为68.2%(15/22)。18例良性胸腔积液中FHIT基因均正常表达。FHIT基因mRNA在良、恶性胸腔积液中的表达差异显著(P<0.01)。测序结果表明RT-PCR产物确为FHIT基因。结论:胸腔积液中FHIT基因mRNA的检测有望成为鉴别诊断良、恶性胸腔积液的重要方法。     

胃癌组织中FHIT基因的异常表达

探讨FHIT基因与胃癌关系。方法 :采用PT -PCR及PCR产物直接测序法 ,对 2 6例胃癌组织及其配对正常组织的FHIT基因进行检测。结果 :7例 (2 6 .9% )胃癌组织存在异常FHIT转录本的表达 ,其中 1例无正常FHIT转录本的表达 ;另 6例同时存在正常FHIT转录本的表达 ;配对正常组织均无异常FHIT转录本的表达 ;测序证实异常转录本缺失 1个或 1个以上FHIT外显子。结论 :FHIT转录本的异常是胃癌中常见的和肿瘤特有的改变 ,FHIT基因的异常与我国部分胃癌的发生有关。     

SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测人c-myc基因方法的建立

目的构建含有c-myc基因的重组质粒并以其为模板,建立以SYBR GreenⅠ染料为荧光指示剂的实时荧光定量PCR(FQ-PCR)技术检测c-myc的标准曲线,为FQ-PCR准确检测c-myc奠定基础。方法用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)法从人食管鳞癌组织的总mRNA中反转录扩增c-myc cDNA,将纯化的PCR产物与pGEM-T Easy载体进行连接,转化宿主菌DH-5α,然后挑选阳性克隆重组质粒,分别用PCR扩增、限制性核酸内切酶EcoRⅠ酶切进行鉴定并测序分析。用紫外分光光度计测质粒浓度,计算拷贝数制备FQ-PCR浓度梯度标准品。最后对质粒标准品进行FQ-PCR检测。结果PCR扩增、酶切鉴定及测序分析均证实c-myc重组到pGEM-T Easy载体上。建立了人c-myc标准曲线,其对数与相应的Ct值(循环阈值)具有良好的相关性,相关系数r2=-0.99～-1,斜率为-3.1～-3.6。结论所构建的人c-myc质粒标准品应用SYBR GreenⅠ荧光染料技术建立的标准曲线线性关系好,灵敏性和特异性高,准确可靠,此方法可作为FQ-PCR检测c-myc基因的标准方法。     

FHIT基因表达对多西紫杉醇诱导胃癌细胞凋亡的实验研究

目的探讨外源性FHIT基因的表达对多西紫杉醇（DOC）诱导人胃癌细胞株(MGC 803)凋亡的影响及其分子机制。方法用脂质体将包含有外源性FHIT基因的重组真核表达质粒转染胃癌细胞MGC 803,获得稳定表达重组质粒pRcCMV FHIT的细胞株（已由山东大学附属省立医院中心实验室成功构建）,Western blot法检测外源性FHIT蛋白的表达;采用MTT法检测不同浓度（1.0、5.0、10.0、20.0、40.0?mg/L）及不同时间（24、48、72?h）下多西紫杉醇对MGC 803细胞的抑制率并选择最佳浓度和作用时间;采用流式细胞术检测FHIT转染和DOC单独及联合作用后的细胞凋亡率;蛋白免疫印迹法检测干预前后cleaved Caspase3的蛋白表达。结果获得稳定表达FHIT基因的胃癌细胞株;DOC对MGC 803细胞具有抑制作用,且浓度为20?mg/L、时间为48?h时最明显;DOC+pRcCMV FHIT组细胞的凋亡水平（65.54%）较阴性对照组（3.27%）、pRcCMV组（3.55%）、pRcCMV FHIT组（13.94%）、DOC组（44.13%）、DOC+pRcCMV（45.29%）组明显增高,且差异具有统计学意义（P＜0.05）;DOC+ pRcCMV FHIT组细胞的cleaved Caspase3蛋白表达较其它各组明显增强。结论FHIT基因表达与DOC能够协同促进胃癌细胞的凋亡,这可能与二者能够协同上调Caspase 3蛋白表达相关。