骨髓来源细胞参与肝脏损伤的修复

目的 探讨小鼠骨髓来源干细胞(bone marrow stem cells,BMSCs)在体内分化为肝细胞的可行性及BMSCs是否参与肝功能受损的修复.方法 30只雌性C57BL/6小鼠全身一次性接受10 Gy 60Co射线照射后,立即接受同品系雄性小鼠骨髓干细胞移植.移植后21 d后以CCl4 致骨髓嵌合小鼠肝功能受损,并于CCl4 致伤后第2、3、4、7、14、21、28天取骨髓嵌合小鼠肝脏,冰冻切片行Y染色体FISH和白蛋白(albumin,ALB)免疫荧光双标染色法,检测BMSC阳性细胞在受体小鼠肝内的分化情况,ELISA法检测肝脏基质细胞衍生因子-1(stromal cell-derived factorl,SDF-1)及其趋化因子受体(CXCR4)、肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)、干细胞因子(stem cell factor,SCF)的表达.结果 伤后2、3、4、7、14、21、28 d骨髓嵌合小鼠肝内皆可见FISH和ALB共表达的双阳性细胞,计数Y染色体FISH与ALB双阳性的细胞数量为3.763%～5.578%.ELISA法检测相关干细胞因子发现,在肝损伤后同一批次各时相点肝脏组织匀浆标本中SDF-1、CXCR-4、SCF、HGF 4种因子均呈现增高趋势,并在肝损伤第21天达到高峰表现,与其他时相点相比显著增加(P<0.05),同FISH与ALB荧光双标记共表达计数结果一致.结论 BMSCs 可通过直接分化为肝细胞及分泌相关细胞因子间接促进受体肝脏干细胞增殖参与受损肝脏的修复.     

受体特异性骨髓干细胞诱导肝移植大鼠长期存活的研究

目的 研究受体特异性骨髓干细胞在大鼠移植肝中的诱导分化情况及对大鼠长期存活的影响.方法 雌性受体SD大鼠随机分成空白对照组、D-hanks液组、间充质干细胞组、造血干细胞组.空白对照组仅行原位肝移植术;D-hanks液组在肝移植术后大鼠门静脉注射D-hanks液0.5ml;间充质干细胞组在肝移植术后大鼠门静脉注射雄性SD大鼠骨髓问充质干细胞0.5ml(5×105个/mL);造血干细胞组注射骨髓造血干细胞0.5ml(5×105个/mL).观察大鼠的中位生存时间及术后60d Sry基因原位杂交和白蛋白免疫组化双标检测观察骨髓干细胞的分化情况.结果 间充质干细胞组、造血干细胞组中位生存时间分别为大于180 d、102d,较空白对照组、D-hanks液组明显延长(P＜0.05);间充质干细胞组又较造血干细胞组明显延长(P＜0.05);间充质干细胞组、造血干细胞组Sry基因原位杂交和白蛋白免疫组化双标检测呈阳性,且双阳性细胞百分率间充质干细胞组高于造血干细胞组(P＜0.05).结论 受体特异性骨髓干细胞能诱导大鼠肝移植术后长期存活,并能在移植肝的环境中诱导分化为肝细胞,表达白蛋白,并逐渐替代移植肝本身的细胞;间充质干细胞在移植肝内诱导分化为肝细胞并替代的能力较强;移植的肝脏被受体特异性骨髓干细胞分化来的肝细胞替代,是大鼠长期存活的可能原因.     

骨髓间充质干细胞在致敏小鼠体内示踪归巢的实验研究

 【目的】了解骨髓间充质干细胞在以异基因脾细胞输注致敏小鼠体内的归巢情况。【方法】正常同种异基因小鼠骨髓间充质干细胞的体外培养及鉴定后,体外予经羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯荧光染料标志,经尾静脉注射到致敏组和非致敏组小鼠体内（每组10只）,在6h、24h和48h处死动物,分别应用冰冻切片和流式检测方法了解骨髓间充质干细胞在各个脏器的分布情况。【结果】冰冻切片和流式检测结果均表明骨髓间充质干细胞在致敏小鼠体内迅速和持久在脾,肝脏聚集,而非致敏动物却没有明显聚集到肝脾等脏器,却是最终归巢到了骨髓。其中流式定量结果表明：6h时致敏小鼠脾脏荧光阳性细胞为（3.78±0.66）％,与同期正常小鼠脾脏结果比较P ＜0.05,有统计学意义;而在48h时致敏小鼠骨髓荧光阳性细胞为（0.43±0.35）％,同期正常小鼠骨髓为（5.40±1.58）％,两者比较 P ＜0.05,有统计学意义。【结论】应用异基因脾细胞致敏的小鼠体内肝脾等免疫脏器明显受到致敏影响,其对骨髓间充质干细胞体内归巢的定位具有很高的趋化吸附作用,中止了骨髓间充质干细胞正常状态下向骨髓的归巢。     

体外诱导人骨髓间充质干细胞定向肝细胞分化

目的:研究人骨髓间充质干细胞向肝细胞的诱导分化,为肝组织工程提供理想的细胞来源。方法:以肝细胞生长因子、成纤维细胞生长因子4对种植于基底膜基质中的人骨髓间充质干细胞进行三维立体诱导培养,在培养后不同时间,分别进行形态观察、AFP、Alb的免疫组化荧光染色及靛青绿的摄取与排泌试验。结果:该条件下诱导后的人骨髓间充质干细胞生成肝细胞样细胞,阳性表达肝细胞特有表面标志AFP、Alb,并具备肝细胞特有的摄取与排泌靛青绿的活性功能。结论:肝细胞生长因子、成纤维细胞生长因子4及基底膜基质可能在体外人骨髓间充质干细胞向肝细胞分化的过程中提供适宜的微环境并起重要作用,这为间充质干细胞在肝组织工程中的应用提供了理论与技术上的支持。     

体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞定向分化肝样细胞

目的观察骨髓间充质干细胞体外诱导分化为肝样细胞。方法自大鼠的股骨中提取骨髓细胞,利用 Percoll 法行骨髓间充质干细胞分离、纯化。取第3代的骨髓间充质干细胞,应用肝细胞生长因子(HGF)20ng/ml 表皮生长因子(EGF)1.5μg/ml 联合诱导。两周后免疫荧光染色及逆转录-多聚酶链反应(RT-PCR)鉴定诱导后细胞白蛋白的 mRNA 的表达。结果诱导分化一周骨髓间充质干细胞变为圆形,两周后免疫荧光染色可见肝细胞标志物 CK18和白蛋白表达,RT-PCR 检测有白蛋白的 mRNA 的表达。结论骨髓间充质干细胞体外诱导能定向分化为肝样细胞。     

绿色荧光蛋白作为骨髓间充质干细胞示踪标记物在脑出血脑内的表达

目的 探讨利用绿色荧光蛋白(GFP)作为骨髓间充质干细胞(BMSCs)移植治疗脑出血示踪标记物的可行性.方法 利用GFP空载体重组腺病毒感染BMSCs,应用脑立体定位仪将感染的BMSCs移植入脑出血大鼠纹状体内,移植后5、14 d,脑组织行冰冻切片,荧光显微镜下观察BMSCs在脑组织内分布的表达.结果 感染细胞与未感染细胞体外培养形态无差异,感染细胞及其传代细胞发强绿色荧光.荧光显微镜下观察脑出血模型冰冻切片,移植后各时间点在移植部位周围病灶区内有大量发绿色荧光的细胞.结论 GFP感染BMSCs能在脑出血大鼠脑内稳定持久表达,表明GFP是脑出血干细胞移植治疗的有效示踪标记物,为进一步研究移植细胞在宿主脑内的可塑性研究奠定基础.     

体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞定向分化肝样细胞

目的 观察骨髓间充质干细胞体外诱导分化为肝样细胞。方法自大鼠的股骨中提取骨髓细胞，利用Percoll法行骨髓间充质干细胞分离、纯化。取第3代的骨髓间充质干细胞，应用肝细胞生长因子(HGF)20mg／ml表皮生长因子(EGF)1．5μg／ml联合诱导。两周后免疫荧光染色及逆转录-多聚酶链反应(RT-PCR)鉴定诱导后细胞白蛋白的mRNA的表达。结果诱导分化一周骨髓间充质干细胞变为圆形，两周后免疫荧光染色可见肝细胞标志物CK18和白蛋白表达，RT-PCR检测有白蛋白的mRNA的表达。结论骨髓间充质干细胞体外诱导能定向分化为肝样细胞。     

人鼠肝组织嵌合体模型的制备

目的研究制备人鼠肝组织嵌合小鼠模型。方法将人骨髓干细胞直接注射到一定日龄胎鼠肝组织,每只注射移植约1×109人骨髓干细胞。用免疫组化对出生一定日龄移植小鼠肝脏进行甲胎蛋白免疫组织化学检测,检定分析人肝细胞在小鼠体内嵌合生长情况。结果移植人骨髓干细胞胎鼠出生2月龄、12月龄可检测到甲胎蛋白。结论将人骨髓干细胞移植小鼠肝脏内能够存活并分化成人肝细胞并能够长期存活。     

BrdU标记的骨髓来源间充质干细胞在心脏移植部位数量的变化

目的 :观察BrdU对骨髓来源间充质干细胞的标记率及移植后的骨髓来源间充质干细胞在心脏移植部位不同时间中的数量变化情况。方法 :酶标仪分别测出骨髓来源间充质干细胞及BrdU阳性间充质干细胞光密度值 ,计算标记率。将经BrdU标记后的骨髓来源间充质干细胞注射入冠状动脉左前降支中段结扎处的大鼠左心室壁内 ,术后第 5、10、15、2 0天行抗BrdU抗体免疫组织化学染色。结果 :BrdU对骨髓来源间充质干细胞的标记率约为 4 1.4 1%。移植后第 5天BrdU阳性细胞数多于移植后第 10天 (P <0 .0 5 ) ,而移植后第15、2 0天与第 10天相比BrdU阳性细胞数无明显变化 (P >0 .0 5 )。结论 :BrdU能对骨髓来源间充质干细胞起到较好的标记和“跟踪”作用 ,移植入心脏壁内的间充质干细胞数量第 10天比第 5天减少 ,以后基本稳定的变化过程。     

骨髓间充质干细胞作为胰腺癌基因治疗载体的实验研究

目的:研究小鼠骨髓间充质干细胞对胰腺癌的聚集作用。方法:体外分离培养纯化绿色荧光蛋白转基因小鼠骨髓间充质干细胞,通过Transwell共培养体系观察骨髓间充质干细胞向胰腺癌细胞PNAC-1的迁移;建立裸鼠胰腺癌移植瘤模型,经尾静脉回输骨髓间充质干细胞至荷瘤鼠体内,荧光显微镜动态观察肿瘤组织及其他脏器组织中骨髓间充质干细胞的分布及含量。结果:通过贴壁培养获得小鼠骨髓间充质干细胞,流式细胞仪检测证实,CD44+CD45-、CD90+CD45-细胞均占细胞总数90%以上;Transwell共培养提示骨髓间充质干细胞向胰腺癌细胞PANC-1迁移,且随着肿瘤细胞数的增多,细胞迁移的数量增多(P<0.05);体内实验证实,骨髓间充质干细胞向胰腺癌组织特异性地靶向聚集,10 d内随着时间的延长骨髓间充质干细胞在胰腺癌组织中逐渐增多(P<0.05),10 d后增加不明显。结论:小鼠骨髓间充质干细胞体外向胰腺癌细胞迁移,体内向胰腺癌组织靶向聚集。     

恒磁场对Feridex-GFP 双标记BMSC 在损伤肝脏中定植的影响

目的：评价体外恒磁场作用下,双标记干细胞经外周静脉、门静脉、肝动脉移植在损伤肝脏中的定植 率及治疗急性肝损伤的有效性。方法：分离骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs),经培 养传代纯化、体外诱导,分化为肝样细胞,绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)和菲立磁(Feridex)体外双标 记BMSCs,不同途径移植双标记BMSCs至肝脏,于移植后第1,2,3,4周处死大鼠,测定血清丙氨酸氨基转移酶 (ALT)、门冬氨酸氨基转移酶(AST)、白蛋白(ALB)水平,并取肝组织做苏木精-伊红染色(HE染色)、荧光显微镜下观 察肝内GFP阳性率。结果：双标记BMSCs通过尾静脉、门静脉、肝动脉3种途径及其外加恒磁场作用下,移植后第4周 均能定植于肝脏,改善肝功能;在远期疗效不变的前提下,肝门静脉移植+恒磁场组、肝动脉移植+恒磁场组促进肝 功能的早期恢复。结论：BMSCs移植可有效治疗急性肝损伤,首选经门静脉+恒磁场、肝动脉+恒磁场途径,次选外 周静脉或外周静脉+恒磁场途径。     

小鼠骨髓源性干细胞迁移到缺血再灌注损伤肾脏内表达CK18和RCA的观察

目的观察小鼠骨髓源性干细胞(bone marrow derived stem cells,BMSCs)在缺血再灌注(I/R)损伤肾脏内表达细胞角蛋白18(Cytokeratin 18,CK18)和蓖麻凝集素(Ricinus communis,RCA)的情况.方法制备BALB/c雌鼠肾脏缺血再灌注损伤模型,亚致死剂量60Co照射后通过尾静脉移植同系雄鼠骨髓细胞,于移植后不同时相点采用PCR检测受体鼠骨髓中Sry基因表达,免疫组化染色结合Y染色体荧光原位杂交(Y-FISH)观察受体肾脏中骨髓源性干细胞的分化情况.结果骨髓移植15 d后,PCR检测到受体鼠骨髓中有Sry基因表达;骨髓移植30 d后,连续切片免疫组化染色结合Y-FISH观察到受体鼠肾脏中存在Y /CK18 和Y /RCA 细胞.结论静脉移植的骨髓源性干细胞可迁移到I/R损伤肾脏,并在局部微环境诱导下表达肾小管上皮细胞的表型特征CK18和RCA.     

Effect of impaction on gene-modified cells seeded on granular bone allografts in vitro and in vivo

Background While attempting to restore bone stock, impaction bone grafting employed during revision joint surgery may result in slow and limited allograft incorporation into host bone. A new approach including gene-modified bone marrow stromal cells （BMSCs） in combination with impaction bone grafting may effectively restore bone stock and improve allograft incorporation. This study aimed to investigate the effect of impaction on gene-modified BMSCs seeded on granular bone allografts in vitro and in vivo.Methods Deep-frozen, granular, cancellous bone allografts from canines were prepared to serve as cell delivery scaffolds and were seeded with green fluorescent protein （GFP） genetically-modified BMSCs to construct cell-allograft composites. The composites were impacted in a simulative, in vitro impaction model and cultured for further analysis under standard conditions. Four Beagle dogs, treated with bilateral, uncemented proximal tibial joint hemiarthroplasty with a prosthesis, were implanted with autologous GFP gene-modified cell-allograft composites to repair the bone cavity around each prosthesis.Results A significant reduction in cell viability was observed after impaction by fluorescence microscopy in vitro.However, there remained a proportion of GFP-positive cells that were viable and functionally active, as evidenced by the secretion of GFP protein in vitro and in vivo.Conclusions Gene-modified BMSCs seeded on granular allografts were able to withstand the impaction forces and to maintain their normal functions in vitro and in vivo, in spite of a partial loss in cell viability.     

三羟异黄酮对辐射损伤小鼠骨髓基质细胞的保护作用

目的　探讨三羟异黄酮(genistein,GEN)对辐射损伤小鼠骨髓基质细胞(bonemarrowstromalcells,BMSCs)的保 护作用。方法　成年雄性小鼠辐射前24h给予GEN,6.0Gyγ射线辐射后观察BMSCs的形态变化、成纤维细胞集落 (CFU -F)形成数量、BMSCs层对正常小鼠骨髓细胞(BMCs)的粘附能力以及血管细胞粘附分子(VCAM- 1)、纤维连接素(Fn) 和层粘素(Ln)等细胞粘附分子的变化。结果　GEN处理组辐射后BMSCs虽然形态上与单纯辐射损伤组在光镜下无差异, 但其CFU -F形成数量、对正常BMCs的粘附能力以及VCAM -1、Fn和Ln等细胞粘附分子的表达均较单纯辐射损伤组高而且 恢复较快。结论　GEN可减小辐射对小鼠BMSCs的损伤,促进受损BMSCs增殖、粘附功能恢复,改善骨髓造血微环境,有 利于辐射损伤小鼠造血重建,具有辐射防护作用。     

绿色荧光蛋白标记骨髓基质干细胞在恒河猴体内构建组织工程骨的示踪作用

目的 用绿色荧光蛋白(GFP)标记恒河猴骨髓基质干细胞(rBMSC),以示踪其在体内参与组织工程骨形成的情况.方法 用OBI-293A细胞对腺病毒Ad5.CMV-GFP进行扩增,用Ad5.CMV-GFP转染rBMSc,将转染成功的第三代BMSc在转染后48 h消化制成细胞悬液,接种至块状可吸收HA上,体外培养3 d后,将其植入恒河猴(同体移植)背阔肌的肌袋内,以未转染GFP的BMSC用同样的方法接种块状可吸收HA上,作为对照,术后6周取材,4%的中性多聚甲醛固定,塑料包埋,制作骨磨片PI染色在激光共聚焦显微镜下进行观测.结果 转染GFP后,rBMSc仍贴壁生长,呈梭形或多角形,仍分裂增殖,但增殖速度有所降低.48 h可见细胞发出强烈的荧光,呈全细胞分布,计数转染率达80%.在激光共聚焦显微镜下观察骨磨片,可见材料内有发出较强荧光的细胞结构,能同时被PI染液着色.结论 绿色荧光蛋白能有效示踪组织工程骨种子细胞,种人体内的BMSC是组织工程骨骨组织形成的主要细胞来源.     

全骨髓贴壁培养兔骨髓间充质干细胞的初步研究

目的：探讨兔骨髓间充质干细胞作为组织工程种子细胞修复骨缺损的可能性。方法：选取2月龄约2．5kg重健康新西兰兔8只,采用全骨髓贴壁培养法体外分离、培养兔骨髓间充质干细胞,通过倒置相差显微镜观察、MTT检测、细胞贴壁率检测观察细胞生物学特性。结果：全骨髓贴壁培养法培养出的原代骨髓间充质干细胞活力良好,细胞数量经传代后扩增,且细胞纯度提高,但细胞扩增速度较慢。结论：全骨髓贴壁培养法简便易行,能有效的在体外获得原代骨髓间充质干细胞。所提取的细胞活性良好、纯度较高,能用作组织工程种子细胞治疗骨缺损。     

小鼠c-Kit+lin-骨髓细胞移植生成肝细胞的实验研究

目的 评价小鼠c-Kit^＋Lin-骨髓细胞的肝干细胞潜能,为骨髓源性肝干细胞的临床运用提供可行性实验依据。方法 供体为纯系BALB／C雄性小鼠．c-Kit^＋Lin-骨髓细胞采用免疫磁珠分选法分离细胞。受体为行35Gy全肝照射处理后的同龄同系BALB／C雌性小鼠,立即移植供体c-Kit^＋lin-骨髓细胞。接受c-Kit^＋lin-骨髓细胞移植1月后,活杀取肝做常规病理学检查、Y染色体的原位杂交检查、甲胎蛋白与白蛋白的免疫组化检测。结果 移植1月后小鼠肝脏的组织结构已恢复正常．肝组织细胞中存在原位杂交和免疫组化均呈阳性反应的双阳性细胞。结论 小鼠c-Kit^＋Lin-骨髓细胞具有肝干细胞潜能,移植后可以在肝内定居并分化形成肝细胞。可做为肝病细胞移植疗法的种子细胞。     

绿色荧光蛋白小鼠骨髓间充质干细胞培养及其示踪的可行性

目的观察并比较两种小鼠骨髓间充质干细胞分离培养方法及选取GFP-BMSCs作为移植实验示踪的种子细胞可行性。方法通过骨片培养法(A法)和全骨髓贴壁法(B法)培养扩增小鼠骨髓间充质干细胞,并参照不同的培养方法优化其换液方式;观察两种培养方法原代及传代GFP小鼠骨髓MSCs形态变化;取第3代细胞进行生长曲线测定及多向分化功能检测;观察GFP小鼠骨髓MSC经多次传代及诱导分化后绿色荧光的稳定性。结果 1)A法原代培养可见贴壁细胞增殖形成大小不等的克隆集落,并向周围进一步扩展、融合,而B法在原代培养时由于混杂较多血液系统细胞,传代至3、4代即可获得较纯的BMSCs;2)观察其生长曲线,A法细胞扩增速度快,纯度高,B法细胞由于受杂细胞的影响,扩增难度大;3)BMSCs可被诱导成脂肪细胞,油红O染色可见红色脂肪颗粒;在成骨分化过程中可见骨结节结构形成;4)GFP-BMSCs传代后生物学特性稳定,传代至5代及诱导分化后其GFP表达仍为强阳性。结论与传统全骨髓贴壁法相比,骨片培养法可在原代或1代就获得高浓度的足量干细胞,GFP-BMSCs经多次传代后荧光不减退,可作为体内细胞示踪。     

COA:Effect of impaction on gene modified cells seeded on granular bone allograft in vitro and in vivo

Background Impaction bone grafting during revision joint surgery to restore bone stock may result in slow and limited allograft incorporation into host bone. A new approach has been proposed by gene modified bone marrow stromal cells (BMSCs) in combination with impaction bone grafting may effectively restore bone stock and improve allograft incorporation. This study aims to investigate the effect of impaction on gene modified BMSCs seeded on granular bone allograft in vitro and in vivo. Methods Deep frozen granular cancellous bone allograft from canine was prepared to serve as cell delivery scaffold, which was seeded with green fluorescent protein (GFP) genetically modified BMSCs to construct cell allograft composites. The composites were impacted in a simulative impactor model and treated with successive incubation under the standard condition after impaction in vitro. Four Beagle dogs, treated with bilateral uncemented proximal tibial joint hemiarthroplasty with prosthesises, were implanted with autologous GFP gene modified cell allograft composites to repair the bone cavity around the prothesis to mimic impaction bone grafting in vivo. Results Significant reduction of viable cells was observed after impaction under fluorescence microscope in vitro, but a proportion of GFP positive cells remained alive and functionally active to secret GFP protein in vitro and in vivo. Conclusions Gene modified bone marrow MSCs seeded on granular allograft will withstand the forces of impaction and maintain their normal functions in vitro and in vivo in spite of partial loss.     

小鼠脂肪源Flk1+CD31-CD34-细胞促造血恢复作用观察

目的:观察小鼠成体脂肪源Flk1 CD31-CD34-细胞体内外能否促进造血恢复.方法:用小鼠脂肪源Flk1 CD31-CD34-细胞作滋养层,接种造血细胞,观察培养后1～4周造血细胞数及粒-巨噬细胞系集落形成单位(CFU-GM)的变化,并设对照组.30只经137Cs全身照射0.35 Gy的雌性C57BL/6小鼠随机分为3组,空白对照组尾静脉注射生理盐水,对照组注射骨髓有核细胞,实验组注射骨髓有核细胞及脂肪源Flk1 CD31-CD34-细胞,注射后均检测外周血和骨髓有核细胞数及CFU-GM变化,PCR检测受体小鼠体内Y染色体的表达.结果:体外实验中实验组接种后2～4周造血细胞数均高于对照组(P均＜0.05),接种后1～4周CFU-GM值均高于对照组(P均＜0.05);体内实验中空白对照组小鼠移植后10 d左右死亡,实验组小鼠外周血和骨髓有核细胞数、CFU-GM从第2周起均高于对照组(P均＜0.05),第4周实验组小鼠骨髓细胞有Y染色体表达.结论:脂肪源Flk1 CD31-CD34-细胞能促进小鼠造血恢复.