MDM2、MDMX以及p53在肿瘤中的研究进展

肿瘤抑制基因p53在抑制肿瘤生成中起重要作用。作为p53的主要负性调节因子,鼠双微体(MDM)2能够泛素化降解p53蛋白并降低其活性,而p53则与MDM2的P2启动子序列结合,抑制其转录活性,降低其表达,两者相互作用形成负反馈环。MDMX,又称MDM4,其能够抑制p53的转录激活,调节MDM2的E3连接酶活性,且MDM2与MDMX均具有p53非依赖性致瘤作用。因此探究p53-MDM2、MDMX的相互作用及具体的作用机制可为肿瘤治疗提供新的方向。     

ECRG2基因缺失通过p53途径导致中心体过度复制

目的 探讨ECRG2基因调控中心体复制的分子机制.方法 采用质谱法筛选ECRG2基因作用伙伴;采用免疫共沉淀法鉴定ECRG2与p53发生相互作用的位点;采用Western印迹法检测p53转录活性;采用免疫荧光技术观察ECRG2基因对p53中心体定位能力的影响.结果 结果显示p53是ECRG2基因的一个新的作用伙伴.ECRG2基因通过其N端20个肽与p53发生相互作用,通过p53参与中心体复制.ECRG2基因缺失不但促进p53蛋白泛索化降解程度,降低p21蛋白活性,提高cydinE/CDK2活性,从而启动了中心体过度复制,而且使p53蛋白无法定位于中心体,丧失了对中心体再复制的抑制作用.结论 ECRG2基因通过p53参与中心体复制,一方面,ECRG2通过p53/p21/cyclin E/CDK2途径调控中心体复制;另一方面,ECRG2也可影响p53中心体定位能力,参与p53对中心体再复制的抑制作用.     

突变体p53相关的复合物在乳腺癌中的作用

乳腺癌作为女性最常见的恶性肿瘤,通常可以在其最具侵袭性的亚型中检测到p53突变。而最多见的p53突变是错义突变,最终导致突变体p53蛋白在癌细胞中的高表达。突变体p53蛋白不仅丧失野生型p53蛋白的肿瘤抑制活性,还获得了新的致癌能力,它还可以通过影响乳腺癌细胞的胞吞胞吐改变基因表达。而突变体p53最主要的致癌活性是介导与其他转录因子或转录不直接相关的蛋白质形成异常复合物,而这些复合物与突变体p53的作用是目前靶向治疗的关键。     

十字形结构域蛋白2C 在肿瘤中的研究进展

赖氨酸甲基化是调控染色体结构的组蛋白后修饰中的一种。在肿瘤的形成过程中可观察到其修饰状态的改变,这可能是组蛋白赖氨酸甲基转移酶或去甲基化酶作用的结果。十字形结构域蛋白2C(JMJD2C)是组蛋白去甲基化酶(JMJD2)家族的重要成员之一,包含有一个具有催化组蛋白赖氨酸去甲基化作用的 JmjC 结构域,同时其还具有诱导基因型改变、调控基因表达及介导蛋白质间相互作用等重要功能。近年研究显示,JMJD2C 基因在食管癌、前列腺癌和乳腺癌等多种恶性肿瘤中高表达,剔除 JMJD2C 基因等,可以减慢多种肿瘤细胞的生长。因此,JMJD2C 为一潜在致癌基因,并可能成为肿瘤治疗新的靶点。     

SMYD2蛋白的研究进展

肿瘤抑制基因p53是人类最常见的癌症灭活基因。组蛋白甲基转移酶(SMYD2)在赖氨酸残基370单甲基化p53(p53K370me1)后抑制p53抑制活性,在赖氨酸C末端甲基化p53后增强或抑制p53转录活性;SMYD2在食管肿瘤、视网膜母细胞瘤、乳腺癌上表达具有敏感性和特异性,并具有肿瘤异源性分布趋势。SMYD2与心血管、神经、消化、运动、泌尿和生殖等各个系统的形成、发育密切相关,同时可能是人类致癌基因,对其进一步研究将为癌症的诊断和治疗提供新的思路。     

维生素D_3体外羟化反应的实验研究

本文利用肝脏羟化酶及肾脏羟化酶,对维生素D_3的体外25位羟化作用及1α位羟化作用进行了初步研究。结果表明:应用佝偻病鸡的肝线粒体及微粒体悬液,分别与维生素D_3、NADPH孵化系统在体外进行孵育,均可得到羟化产物—25-OH-D_3,线粒体维生素D_3-25羟化酶的活性为0.49Pmol 25-OH-D_3/2h·10mg pr,微粒体为0.28 pmol 25-OH-D_3/2h·10mg pr。二者转化率分别为11.9％与5.8％,线粒体25-羟化酶活性明显高于微粒体。应用佝偻病鸡的肾线粒体悬液,与25-OH-D_3、NADPH孵化系统在体外进行孵育,可以获得羟化产物-1a,25-(OH)_2-D_3,其转化率为37.5％。     

脯氨酰羟化酶研究进展及其与肿瘤的关系

缺氧诱导因子脯氨酰羟化酶（PHD）作为氧感受器,通过氧依赖性途径催化缺氧诱导因子（HIF）特定的脯氨酸残基发生羟化反应,从而介导缺氧诱导因子降解,对缺氧诱导因子转录活性有影响。PHD表达受多种途径调控,其活性也受分子氧、二价铁、抗坏血酸、三羧酸循环中间产物等多种因素影响。此外PHD与肿瘤的发生发展有关。故对于PHD的深入研究有助于我们认识肿瘤发生发展的机制,为肿瘤的治疗提供更有效的方法。     

p53与主反应基因Egr-1物理相互作用的研究

目的:肿瘤抑制因子p53和主反应基因Egr-1是细胞核转录因子,在介导细胞增殖、分化及细胞凋亡和生长停止的信号传导通路中扮演调控的角色。我们试图证明在体内、外这两种调控蛋白间有一种物理上的联系。方法:体内实验中,用免疫沉淀法和Western blot3分析含有高水平Egr-1活性的细胞裂解物的血清和过度表达Egr-1和突变型p53的人肺癌细胞株中两种蛋白间的相互作用。结果:p53突变在154密码子时与Egr-1没有联系,而当p53蛋白突变点在156,246,247和273殖基则与此锌指转录因子有联系。p53结合全长的Egr-1和1个Egr-1缺失5'活化范围的Egr-1突变体,但不能结合1个缺少包含头两个锌指区的内部片断的Egr-1蛋白,说明结合需要完整的锌指基序存在。肺成纤维细胞系MRC-9表达不同大小的Egr-1蛋白,该蛋白也同样与p53结合。结论:两种调控蛋白之间存在联系,它们之间的相互作用可能改变了它们的多种生物学活性尤其是关于转录控制的特性。     

FIH与锚蛋白重复序列结构域

缺氧诱导因子抑制因子(FIH)是体内调节缺氧诱导因子1(HIF-1)转录活性的主要因子之一。近年FIH研究中最引人注意的是一组含有锚蛋白重复序列结构域的底物蛋白质,这组蛋白普遍存在并参与多种生理功能,其含多个FIH羟化位点,但具有不完全羟化及优势底物的特征,又与FIH、HIF-1之间存在错综复杂的关系。     

IH764—3对胶原生物合成中脯氨酰羟化的作用

从13天龄鸡胚胎提取原胶原脯氨酰羟化酶,在FeSO_4、2-酮戊二酸、抗坏血酸、过氧化氢酶等辅助因子存在下,将底物(Pro-Pro-Gly)10·9H_2O中的Pro羟化成羟脯氨酰(HOPro)的羟化反应体系,观察IH764-3对胶原生物合成中脯氨酰羟化作用的影响。结果表明,脯氨酰羟化酶催化的原胶原脯氨酰底物(Pro-Pro-Gly)10·9H_2O的羟基化作用可被IH764-3所抑制。在酶促反应标准条件下,IH764-3为0.24mmol/L时,对脯氨酰羟化的抑制率为50.78±16.03％。本实验还证明,IH764-3不能与脯氨酰羟化酶结合,提示IH764-3对酶促脯氨酰羟化的抑制是由于其同酶反应所需的Fe~(2 )形成络合物所致。平衡移动法表明,IH764-3与Fe~(2 )形成的稳定络合物的Fe(2 ):IH764-3摩尔比为1:3,表现稳定常数Ks=1.04×10~(12)。     

p53RFP基因启动子荧光素酶报告基因载体的构建及鉴定

目的 构建人p53RFP基因启动子序列不同截短片段的荧光素酶报告基因载体,研究启动子的转录活性.方法 PCR扩增人p53RFP基因启动子区域不同长度的目的片段,克隆到pGL3-Basic中,构建启动子区域3个不同截短片段的荧光素酶报告基因载体,经双酶切和基因测序鉴定正确后,转染HEK293细胞,双荧光素酶报告基因检测系统检测荧光素酶活性.结果 成功构建了p53RFP启动子不同截短片段的荧光素酶报告基因载体,经双荧光素酶报告基因检测分析,3个启动子片段均具有转录活性.结论 成功构建了人p53RFP基因启动子荧光素酶报告基因载体,为研究p53RFP基因的转录调控机制提供了实验基础.     

Wnt3a信号通路通过JMJD6的表观遗传修饰参与神经病理性疼痛

目的：探讨Wnt3a通过Jumonji C结构域6( Jumonji C domain 6,JMJD6)的表观遗传修饰在神经病理性疼痛 中发挥作用的机制。方法：将SD大鼠分为4组：Sham组,慢性缩窄性损伤(chronic constriction injury,CCI)组,CCI+阴性慢病毒表达载体(LV-NC)组;CCI+慢病毒过表达载体(LV-JMJD6)组。构建SD大鼠坐骨神经CCI模型和JMJD6慢病毒 表达载体。CCI术后第3天通过鞘内导管给药,按照分组分别给予生理盐水和含慢病毒的试剂(病毒滴度1×108 TU/mL) 各20 μL。监测大鼠的机械缩足阈值(paw withdrawal mechanical threshold,PWMT)和热缩足潜伏期(paw withdrawal thermal latency,PWTL),并运用蛋白质印迹法检测脊髓水平Wnt3a及NR2B蛋白的表达变化,免疫共沉淀检测JMJD6与Wnt3a之间是否存在直接相互作用。结果：与Sham组相比,CCI术后各组大鼠的PWMT明显降低和PWTL明显缩短(P<0.05)。与CCI组和CCI+LV-NC组相比,CCI+LV-JMJD6组的PWMT在术后第10和14天明显升高,PWTL在术后第14 天明显延长(P<0.05)。CCI术后第14天,CCI组及CCI+LV-NC组Wnt3a和NR2B蛋白表达水平较Sham组明显升高,鞘内注 射慢病毒载体后, CCI+LV-JMJD6组的Wnt3a和NR2B蛋白表达水平较CCI+LV-NC组降低(P<0.05)。免疫共沉淀结果显示Wnt3a与JMJD6之间无直接相互作用。结论：Wnt3a参与调节神经病理性疼痛,其作用可能与JMJD6的表观遗传修饰相关,两者可能通过间接相互作用进行调节。     

基于TCGA数据库分析JMJD6在肝癌组织中的表达及临床意义

目的:分析JMJD6在肝癌中的表达及与预后的关系.方法:从TCGA数据库中下载肝癌患者的mRNA表达数据及患者临床信息.利用Wilcoxon检验比较肝癌组织和正常组织中JMJD6的表达差异,单因素Logistic回归分析JMJD6表达量与临床特征的关系.通过Kaplan-Meier法和Cox回归分析JMJD6表达量与患...     

低剂量三氧化二砷对HepG2细胞p53基因转录水平的下调作用

目的：探讨低剂量三氧化二砷（As2O3）对p53启动子转录活性的调节作用。方法：确定p53启动子区域,聚合酶链反应（PCR）扩增p53p,克隆至真核报告载体pCAT3-Basic中,构建pCAT3-p53p报告载体;以该质粒转染肝癌细胞系HepG2细胞系,用酶联免疫吸附法（ELISA）检测氯霉素乙酰转移酶（CAT）的表达活性;并以小同浓度三氧化二砷刺激HepG2细胞系,用ELISA法检测CAT的表达活性。结果：成功克隆出614bp的新的p53启动子,pCAT3-p53p和不同浓度的三氧化二砷（0．25hcmoL／L）瞬时转染的HepG2细胞的CAT表达活性是pCATF3-Basic守载体的11．2倍,表明pCAT3-p53p具有强的启动子活性。选用0．25、0．5、2．5、5．0μmol／L浓度的三氧化二砷刺激pCAT3p53p转染的HepG2细胞,其CAT吸光度值分别为：0．076、0．186、0．149、0．1l9,CAT活性随着三氧化二砷浓度的倍增呈衰减趋势。结论：p53启动子有反式激活下游基因表达的活性,低剂量：三氧化二砷对p53基因转录水平具有下调作用。     

基于报告基因系统的肝细胞核因子4α活性检测体系的建立

目的 建立一个基于荧光素酶报告基因系统的肝细胞核因子4α(HNF4α)活性检测系统,筛选可调控HNF4α活性的小分子化合物.方法 采用亲和层析法纯化HNF4α蛋白,行蛋白热迁移实验检测相关DNA片段及小分子化合物与HNF4α蛋白的直接相互作用.分别构建含有3个拷贝和9个拷贝的Ninjurin 1(NINJ1)基因启动子区HNF4α反应元件的荧光素酶报告基因质粒pGL3-NINJ1-3p和pGL3-NINJ1-9p,转染肝癌细胞,采用荧光素酶报告基因法检测肝癌细胞内HNF4α转录活性的改变,qPCR检测小分子化合物木犀草素或阿尔维林处理后肝癌细胞中HNF4α及下游基因的表达情况,荧光素酶报告基因法检测小分子化合物处理后细胞内HNF4α转录活性的改变.结果 蛋白热迁移实验证实,NINJ1基因启动子区HNF4α的DNA结合片段可与HNF4α蛋白结合.在过表达HNF4α的肝癌细胞中,pGL3-NINJ1-3p和pGL3-NINJ1-9p均可检测到肝癌细胞中HNF4α活性的改变,且pGL3-NINJ1-9p较pGL3-NINJ1-3p的检测灵敏度更高(P＜0.01).木犀草素和阿尔维林与HNF4α蛋白存在直接相互作用,分别下调和上调HNF4α靶基因;pGL3-NINJ1-9p可检测到木犀草素和阿尔维林对HNF4α转录活性的影响.结论 利用报告基因载体pGL3-NINJ1-9p成功建立了HNF4α活性的检测系统,为筛选调控HNF4α活性的小分子化合物等提供了基础工具.     

马兜铃酸致肾小管上皮细胞损伤中p53和Caspase-3活性的变化

目的：研究马兜铃酸（AA）对人近端肾小管上皮细胞（HK-2）毒性作用中053和Caspase-3活性的改变,对其在AA肾毒性作用中的意义进行探讨．方法：用乳酸脱氢酶（LDH）释放试验测AA对HK-2的直接毒性作用,相差显微镜观察细胞形态学改变,Hoechsd3258染色法观察细胞凋亡形态的改变,流式细胞技术测细胞凋亡百分率,RT-PCR法测p53mRNA的表达水平,分光光度法测细胞Caspase-3活性改变．结果：AA浓度为80,160mg／L时,LDH释放率显著增高（P〈0．01）;10mg／LAA可诱导HK-2细胞凋亡百分率显著增高,AA为40mg／L时,细胞凋亡形态改变最明显和细胞凋亡比例最高（P〈0．01）;各组HK-2细胞053mRNA表达水平有统计学差异;40mg／LAA诱导HK-2细胞凋亡时,细胞内Caspase-3活性显著升高（与正常组比较,P〈0．01）．结论：AA能诱导HK-2细胞凋亡,其凋亡途径可能是非053依赖途径;凋亡过程中存在Caspase-3酶的激活．     

乳腺浸润性导管癌中JMJD3、 MMP-2和VEGF的表达及其与临床病理特征的关系

目的 观察乳腺浸润性导管癌中JMJD3、MMP-2和VEGF蛋白水平的表达,研究过表达JMJD3对乳腺癌细胞增殖以及MMP-2 和 VEGF 表达的影响。方法 用免疫组织化法和 RT-PCR 检测乳腺浸润性导管癌及相对应的癌旁组织中 JMJD3、MMP-2和VEGF蛋白和mRNA的表达情况,分析蛋白表达与乳腺癌患者临床病理特征的关系及上述蛋白的相关性,采用Kaplan-Meier法来评估JMJD3、MMP-2和VEGF蛋白的异常表达与乳腺癌患者生存期之间的关系。通过重组质粒在乳腺癌MDA-MB-231细胞中过表达JMJD3,用CCK-8和免疫组化检测Ki67表达分析其对增殖的影响,用RT-PCR方法检测MMP-2和VEGFmRNA水平表达的变化。结果 免疫组化结果显示,乳腺癌组织中JMJD3阳性强度低于相应癌旁组织（P<0.05）,乳腺癌组织中MMP-2和VEGF阳性强度高于相应癌旁组织（P<0.05）;RT-PCR结果显示,乳腺癌JMJD3 mRNA水平低于癌旁组织,MMP-2和VEGF mRNA水平高于癌旁组织（P<0.05）。JMJD3的表达在乳腺癌直径较小、高分化、TNMⅠ+Ⅱ期、淋巴结无转移及分子分型Luminal A型和Luminal B型表达率较高（P<0.05）,MMP-2和VEGF的表达在乳腺癌肿瘤直径较大、低分化、TNM Ⅲ+Ⅳ期、淋巴结有转移、Luminal B 型和 Her-2 过表达型表达率较高（P<0.05）。Kaplan-Meier 分析结果显示,JMJD3蛋白表达水平较高者的无病生存期高于低表达者（P<0.05）,MMP-2和VEGF蛋白表达水平较高者的无病生存期低于低表达表达者（P<0.05）。Cox 回归模型分析显示,JMJD3、MMP-2 和 VEGF、分化程度是乳腺癌预后的独立危险因素。Spearman 相关分析结果显示,JMJD3与MMP2和VEGF均呈负相关（r=-0.569,-0.533,P<0.05）,MMP2和VEGF呈正相关（r=0.923,P<0.05）。过表达JMJD3能够抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞的增殖、MMP-2和VEGF的表达。结论 JMJD3、MMP-2和VEGF在乳腺浸润性导管癌中的异常表达与肿瘤的增殖、浸润、转移及预后密切相关,三者可作为判断乳腺癌预后不良的重要指标之一。