PEP-1-CAT融合蛋白预处理对在体大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用

目的观察细胞穿透肽PEP-1介导CAT转导入在体大鼠心肌组织的能力,探究PEP-1-CAT融合蛋白对在体大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用。方法以生理盐水为对照,分别从SD大鼠尾静脉注射500μgPEP-1-CAT和CAT融合蛋白,在0.5,1,2,4,8,24h时将其处死,取其心脏,免疫荧光检测CAT的转导能力,用试剂盒检测心肌CAT的酶活性。40只SPF级雄性SD大鼠,随机分为5组,假手术组,心肌缺血再灌注组,100μgPEP-1-CAT融合蛋白预处理组,300μgEP-1-CAT融合蛋白预处理组,500μgPEP-1-CAT融合蛋白预处理组。结扎冠状动脉前降支1h,再灌注2h末,检测血中的LDH和CK活性以及心肌组织内的MDA含量。结果生理盐水组以及CAT组,荧光显微镜下均未见到绿色荧光;PEP-1-CAT各组均可观察到绿色荧光,且8h时强度最大;酶活性检测显示,CAT组与生理盐水对照组差别没有统计学意义（P〉0.05）,而PEP-1-CAT组随着时间的延长,心肌组织中CAT的活性逐渐增加,在8h时达到峰值,为对照组的4.20倍。PEP-1-CAT各剂量组均能显著减少血清中LDH和CK活性和心肌组织的MDA含量（P〈0.01）。结论PEP-1能够介导CAT以时间依赖的方式转导入在体大鼠心肌组织,转导入大鼠心肌组织内的CAT具有相应的酶活性;PEP-1-CAT融合蛋白预处理对在体大鼠心肌缺血再灌注损伤具有保护作用,为临床应用PEP-1-CAT融合蛋白防治心肌缺血再灌注损伤奠定了实验基础。     

PEP-1-CAT融合蛋白预处理对在体大鼠心肌缺血/再灌注损伤的保护作用

目的:研究PEP-1-CAT融合蛋白预处理对在体大鼠心肌缺血/再灌注损伤的保护作用,探讨其可能的作用机制。方法:60只SD大鼠随机分为5组:假手术组(Sham组)、缺血/再灌注组(I/R组)、低剂量预处理组(I/R+100μgPEP-1-CAT)、中剂量预处理组(I/R+300μgPEP-1-CAT)、高剂量预处理组(I/R+500μgPEP-1-CAT)。假手术组和缺血/再灌注组预先注射1mL的0.9%氯化钠溶液,低中高剂量预处理组分别注射100、300、500μg的PEP-1-CAT融合蛋白,7h后结扎冠状动脉前降支1h,再灌注2h后,检测心肌组织中的丙二醛(MDA)和血液中乳酸脱氢酶(LDH)及肌酸激酶(CK)含量,TTC染色测定心肌梗死面积,一步法TUNEL测定凋亡率,免疫荧光测定凋亡蛋白Bax和Bcl-2的表达。结果:与I/R组相比,低中高剂量预处理组显著减少心肌梗死面积(P<0.05或P<0.01),减少MDA的形成(P<0.01)和LDH、CK的释放,使凋亡率下降(P<0.01),下调Bax的表达,上调Bcl-2的表达,使Bax/Bcl-2比值下降。结论:PEP-1-CAT融合蛋白预处理能够明显减少心肌缺血/再灌注损伤,其机制可能与PEP-1-CAT融合蛋白具有抗氧化、抗凋亡作用有关。     

细胞穿透肽PEP-1介导过氧化氢酶转导大鼠心肌H9C2细胞

目的:探索细胞穿透肽PEP-1介导的人过氧化氢酶转导入H9C2细胞的能力。方法:利用基因工程方法表达和纯化His-tag-PEP-1-CAT及His-tag-CAT融合蛋白后,与体外培养的H9C2细胞株共孵育,利用免疫细胞荧光技术和Westernblot检测PEP-1-CAT融合蛋白是否转导入H9C2细胞内;并检测H9C2细胞内的过氧化氢酶活性。结果:制备的PEP-1-CAT融合蛋白纯度为90%以上,其浓度达0.501mg/mL;PEP-1介导的CAT融合蛋白能高效转导入H9C2细胞内,呈时间及剂量依赖性,6h时达峰值;转导入H9C2细胞内的融合蛋白的过氧化氢酶活性亦呈现出时间及剂量依赖的特点。结论:PEP-1-CAT能高效稳定转导入H9C2细胞内,为PEP-1介导的过氧化氢酶防治心肌缺血/再灌注损伤研究奠定基础。     

PEP-1介导过氧化氢酶对大鼠离体心肌缺血再灌注损伤的保护作用

目的:研究细胞穿透肽PEP-1携带过氧化氢酶(CAT)穿透大鼠离体心肌的能力,并探讨PEP-1-CAT融合蛋白预处理对大鼠离体心肌缺血-再灌注损伤的保护作用及其机制。方法:建立大鼠离体心脏Langendorff灌流模型,随机分为5组(n=10):缺血-再灌注组(I/R组)行平衡30 min、停灌30 min与再灌注60 min,CAT组、PEP-1-CAT融合蛋白预处理组(A、B、C、D组)在平衡15 min后依次以10,5,10,20μmol/L的融合蛋白预处理15 min,停灌、复灌与I/R组相同。记录各组左室舒张末压(LVEDP)、左室收缩压(LVSP)、左室内压最大变化速率(±dp/dtmax)及冠脉流量(CF)变化,测定平衡15 min时、再灌注15 min时冠脉流出液乳酸脱氢(LDH)活性。测定再灌注60 min时心肌丙二醛(MDA)含量。结果:PEP-1-CAT融合蛋白能高效转导入离体心肌组织并呈现剂量依赖性。在平衡15 min末,各组LVEDP、LVSP、±dp/dt max以及LDH活性比较差异无统计学差异(P>0.05)。与I/R组比较,B、C、D组在再灌注后各时间点LVEDP降低(P<0.01),LVSP、±dp/dt max以及CF升高(P<0.01),灌注15 min时冠脉流出液LDH活性降低(P<0.01),再灌注后60 min心肌MDA含量降低(P<0.01)。CAT处理组所有结果和对照组相比无统计学意义(P>0.05)。结论:PEP-1-CAT融合蛋白能高效转导入离体心肌织并对大鼠离体心肌缺血-再灌注损伤具有明显的保护作用,将为其治疗心肌缺血再灌注损伤奠定坚实的实验基础。     

PEP-1肽介导人过氧化氢酶转导入人脐静脉内皮细胞

目的:采用体外培养的人脐静脉内皮细胞株(CRL-1730),研究PEP-1肽介导人过氧化氢酶穿透细胞的能力。方法:构建原核表达质粒pET15b-PEP-1-CAT,将其在基因工程菌中表达出N端带有6个组氨酸“标签”(His-tag)的重组蛋白,并通过金属螯合亲和层析对其进行纯化,然后将纯化得到的PEP-1-CAT融合蛋白加入体外培养的人脐静脉内皮细胞,通过Western blot来分析其转导能力。结果:测序分析证实,原核表达质粒pET15b-PEP-1-CAT重组成功。SDS-PAGE和Western blot结果表明,PEP-1-CAT在E.coli中获得了高效表达,经Ni2+-NTA-树脂柱亲和层析纯化得到了融合蛋白PEP-1-CAT,并在体外检测到其具有特异的过氧化氢酶活性,活性值为77.1 U/g。将其加入到体外培养的内皮细胞培养基中,发现它能以剂量依赖及时间依赖的方式转导入细胞内,并能保持酶活性达48 h。结论:PEP-1-CAT融合蛋白能高效地转导入人脐静脉内皮细胞,为防治各种与氧化应激损伤有关的疾病开辟了新的途径。     

PEP-1肽介导入过氧化氢酶转导入人脐静脉内皮细胞

目的：采用体外培养的人脐静脉内皮细胞株（CRL-1730），研究PEP-1肽介导入过氧化氢酶穿透细胞的能力。方法：构建原核表达质粒pET15b—PEP-1-CAT，将其在基因工程菌中表达出N端带有6个组氨酸“标签”（His—tag）的重组蛋白，并通过金属螯合亲和层析对其进行纯化，然后将纯化得到的PEP-1-CAT融合蛋白加入体外培养的人脐静脉内皮细胞，通过Western　blot来分析其转导能力。结果：测序分析证实，原核表达质粒pET15b—PEP-1-CAT重组成功。SDS—PAGE和Western blot结果表明，PEP-1-CAT在E．coli中获得了高效表达，经Ni^2＋ -NTA-树脂柱亲和层析纯化得到了融合蛋白PEP-1-CAT，并在体外检测到其具有特异的过氧化氢酶活性，活性值为77．1U／g。将其加入到体外培养的内皮细胞培养基中，发现它能以剂量依赖及时间依赖的方式转导入细胞内，并能保持酶活性达48h。结论：PEP-1-CAT融合蛋白能高效地转导入人脐静脉内皮细胞，为防治各种与氧化应激损伤有关的疾病开辟了新的途径。     

PEP-1-SOD1融合蛋白预处理对大鼠骨髓间充质干细胞在缺氧无血清条件下的保护作用

目的:研究PEP-1-SOD1融合蛋白转导入大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)的能力及其在缺氧无血清条件下对MSCs的保护作用。方法:将纯化后的SOD1和PEP-1-SOD1蛋白分别加入到培养及鉴定后的第3代MSCs中,免疫荧光法和Western blot分析PEP-1-SOD1穿透入MSCs的变化,黄嘌呤氧化酶法分析其SOD酶活性。将2.5μmol/L PEP-1-SOD1预处理MSCs 45 min后去除PEP-1-SOD1,缺氧无血清条件下再处理24 h,Annexin V/PI双染标记,流式细胞术分析MSCs凋亡情况。结果:PEP-1-SOD1融合蛋白可以转导入MSCs,呈时间和剂量依赖性分布于胞浆和胞核,缺氧无血清条件下MSCs凋亡率明显降低(P<0.05)。结论:PEP-1-SOD1融合蛋白可以高效、稳定转导入MSCs,并对缺氧无血清所诱导的MSCs凋亡具有显著保护作用。     

细胞穿透肽PEP-1介导人过氧化氢酶转导入在体大鼠心肌组织

目的：观察PEP-1介导CAT转导人心肌组织的能力,检测转导的CAT是否具有天然活性．方法：用基因工程手段表达并纯化出PEP-1-CAT和CAT融合蛋白．以生理盐水为对照,分别从SD大鼠尾静脉注射500μg PEP-1-CAT和CAT融合蛋白,在0．5,1,2,4,8,24h时将其处死,取其心脏,免疫荧光及Western Blot检测CAT的转导能力,用试剂盒检测心肌CAT的酶活性．结果：SDS—PAGE和Western Blot证实目的蛋白PEP-1-CAT和CAT得到了高表达,且纯度在90％左右．生理盐水组及CAT组,荧光显微镜下均未见到绿色荧光,Western Blot亦未检测到目的蛋白;PEP-1-CAT各组均可观察到绿色荧光,且8h时强度最大,同时Western Blot也检测到了目的蛋白,8h时量最多;酶活性检测显示,CAT组与生理盐水对照组差别无统计学意义,而PEP-1-CAT组随着时间的延长,心肌组织中CAT的活性逐渐增加,在8h时达到峰值,为对照组的4．20倍．结论：PEP-1能够介导CAT以天然活性方式转导入大鼠心肌组织,且其转导呈时间依赖性．     

BPDE诱导GC-1细胞凋亡及褪黑素的保护作用

目的 探讨7,8-二羟-9,10-环氧苯并[a]芘(benzo[a]pyrene-7,8-diol-9,10-epoxide,BPDE)对小鼠精原细胞株GC-1的细胞毒性机制及褪黑素的保护作用.方法 不同浓度BPDE处理GC-1细胞,采用Annexin V/PI染色及流式细胞仪检测细胞凋亡,JC-1探针染色检测线粒体膜电位,Western blot检测细胞质Cyt C及细胞总蛋白中caspase-9/3的活化水平,DCFH-DA探针及流式细胞仪检测细胞内的活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平.褪黑素预处理细胞后再进行BPDE染毒,采用上述方法检测褪黑素对BPDE细胞毒性的影响.结果 BPDE可提高GC-1细胞凋亡率,存在剂量-效应关系.同时,BPDE可降低细胞线粒体膜电位,促进线粒体Cyt C的释放,提高细胞中caspase-9和caspase-3蛋白的活化水平,并诱导细胞中ROS水平升高.褪黑素预处理则可降低BPDE诱导的细胞凋亡,抑制Cyt C的释放及caspase-9/3的活化,并激活Nrf-2/ARE抗氧化通路,降低细胞ROS水平.结论 BPDE可诱导小鼠精原细胞GC-1线粒体途径细胞凋亡和氧化应激,而褪黑素在这一过程中起保护作用.     

PEP-1肽介导人Cu,Zn-SOD转导入大鼠离体缺血再灌注损伤心脏

目的:构建原核表达载体pET15b-PEP-1-SOD1,观察PEP-1-SOD1融合蛋白在大鼠离体缺血再灌注损伤心肌组织内的转导能力和转导的目的蛋白是否具有酶活性。方法:构建原核表达载体pET15 b-SOD1和pET15b-PEP-1-SOD1,分别转化大肠杆菌,表达和纯化SOD1和PEP-1-SOD1融合蛋白。采用Langendorff灌流系统,大鼠离体心脏停灌30 min后复灌60 min建立缺血再灌注损伤模型。实验分为对照组,SOD1组,25,50,100μmol/L PEP-1-SOD1组。免疫荧光检测PEP-1-SOD1的转导效果,SOD试剂盒检测酶活性。结果:在荧光显微镜下,PEP-1-SOD1融合蛋白预处理组心肌组织中可见特异性的绿色荧光位于心肌细胞胞质内,25,50,100μmol/L组阳性率分别为32.6%,42.5%,60.9%。SOD1蛋白预处理组和对照组未见到绿色荧光。与对照组相比,PEP-1-SOD1各组SOD酶活性均显著增加(P<0.01),且SOD酶活性与PEP-1-SOD1浓度呈正相关,SOD1组与对照组之间无显著性差异(P>0.05)。结论:PEP-1-SOD1融合蛋白以天然有活性的形式穿透进入大鼠离体缺血再灌注损伤的心肌细胞,且具有剂量依赖性。转导入细胞内的PEP-1-SOD1蛋白具有酶活性。本研究为SOD1治疗由氧化应激所导致的各种疾病提供了一种有效的递送途径。     

pET15b-PEP-1-CAT原核表达质粒的构建及PEP-1-CAT融合蛋白的表达与纯化

目的构建pET15b-PEP-1-CAT原核表达质粒,并表达、纯化得到融合蛋白PEP-1-CAT,为防治与氧化应激有关的疾病奠定基础。方法设计并合成两端分别带5出l和Bgl II酶切位点的CAT引物,用PCR方法以pZeoSV2（＋）-CAT质粒为模板,特异性扩增CAT会长cDNA。将扩增的CATcDNA与dATP反应,利用TaqDNA聚合酶具有的非模板依赖性末端转移酶活性在CATcDNA的3＇末端加“A”并纯化．然后应用TA克隆策略将纯化后的CATcDNA插入至中间载体pGEM-TEasy Vector中得到pGEM-T-CAT。人工合成编码PEP-1的双链寡核甘酸,两端分别引入Nde I和Xho I酶切位点,将其插入pET15b中得到重组质粒pET15b-PEP-1。pGEM-T-CAT和pET15b-PEP-1分别经Sal I-Bgl II和Xho I-BamH I双酶切,利用同尾酶（Sol I与Xho I,Bgl II与BamH I）能酶切产生相同黏性末端的特性,将回收得到的CATcDNA片段与pET15b-PEP-1相连,构建出重组质粒pET15b-PEP-1-CAT,经PCR及酶切鉴定,并通过核苷酸序列测序证实。将鉴定正确的pET15b-PEP-1．CAT重组质粒转化BL21（DE3）,用IPTG诱导目的蛋白表达。然后利用重组蛋白N端的组氨酸“标签”（His-tag）对其进行金属螯合亲和层析纯化。结果测序分析证实,克隆入pET15b的PEP-1序列与设计合成的PEP-1由序列一致,CAT序列与GeneBank中登录号为“AY028632”的CATcDNA序列一致。SDS-PAGE和Westernblot结果表明,pET15b-PEP-1-CAT在E-coli中获得可溶性高表达,经Ni^2＋-NTA-树脂柱亲和层析纯化得到了PAGE纯的融合蛋白PEP-1-CAT,并在体外检测到其具有特异的过氧化氢酶活性,活性值为77.15U／g,结论成功构建了原核表达载体pET15b-PEP-1-CAT,并经表达、纯化得到可以天然活性形式穿透细胞的重组过氧化氢酶蛋白,从而为防治心肌缺血再灌注损伤等与氧化应激有关的疾病奠定了基础。     

番茄红素对心肌细胞氧化应激损伤的保护作用

目的：探讨番茄红素（Lycopene）对心肌细胞氧化应激损伤的保护作用及机制。方法体外培养 H9c2心肌细胞,分为正常对照组（对照组）、番茄红素预处理组（Lycopene组）、模型组（H2 O2组）和番茄红素预处理后建立模型组（Lycopene加H2 O2组）。除对照组及Lycopene组外,其余各组用过氧化氢（H2 O2）200μmol／L处理6 h ,建立心肌细胞氧化应激损伤模型。Lycopene组建模前30 min加入5μmol／L的番茄红素。6 h后M T T观察H9c2心肌细胞存活率;分光光度计检测细胞培养液上清中乳酸脱氢酶（LDH）、肌酸激酶同工酶（CK-MB）活性和细胞中丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）活性;激光共聚焦联合流式细胞仪观察细胞内活性氧（ROS）的产生和线粒体膜电位;流式细胞仪检测细胞凋亡;酶标仪检测细胞内ATP水平。结果与对照组比较,H2O2组LDH、CK-BM、ROS、MDA及细胞凋亡率显著增加,差异有统计学意义（P＜0．05）;H9c2心肌细胞存活率、SOD、ATP及线粒体膜电位显著降低,差异有统计学意义（P＜0．05）。与 H2O2组比较,Lycopene加 H2O2组LDH、CK-BM、ROS、MDA及细胞凋亡率显著降低,差异有统计学意义（P＜0．05）;H9c2心肌细胞存活率、SOD、ATP及线粒体膜电位显著增加,差异有统计学意义（P＜0．05）。结论番茄红素可以减轻氧化应激条件下H9c2心肌细胞的损伤,其机制可能与清除细胞内氧化应激产物,增强细胞内抗氧化酶活性及改善线粒体功能有关。     

基质细胞衍生因子-1对骨髓源间充质干细胞迁移的影响

目的:利用Boyden chamber体外迁移体系初步探索基质细胞衍生因子-1(SDF-1)在骨髓源间充质干细胞(MSC)迁移中的作用及其信号转导机制。方法:采用经典的全骨髓贴壁法培养MSC,通过成骨、成脂肪等多向诱导分化以及流式细胞分析其表面标记(CD133、CD34、CD90、CD105)等鉴定MSC特征;以P3-MSC为实验材料,利用Boyden chamber体外迁移体系,先观察不同浓度的hSDF-1α对MSC迁移的影响,随后以50 M wortman-nin、10 uM LY294002、50 uM PD98059、10 uM U73122、0.1 mg/ml AMD3100等不同处理P3-MSC,观察最适宜浓度的hSDF-1α对MSC迁移影响的信号转导机制。结果:培养的MSC呈现出CD90、CD105强阳性,具有成骨、成脂肪等多向分化能力;MSC体外迁移能力随着hSDF-1α浓度(1 ng/ml、10 ng/ml、100 ng/ml、500 ng/ml)的递增而逐渐增强,并且hSDF-1α浓度在100 ng/ml时,MSC迁移到滤膜上的细胞数接近于锋值;Wortmannin、LY294002、PD98059、U70312、AMD3100对MSC迁移均有影响,其中U73122、AMD3100对MSC迁移阻断的效应最显著。结论:SDF-1/CXCR4所介导的MSC迁移与丝裂酶原活化蛋白激酶(MAPK)、磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C(PI-PLC)和蛋白激酶C(PKC)等信号途径有关,且PKC途径可能处于中心环节。     

利用同尾酶技术构建pET15b-PEP-1-CAT重组质粒

目的:利用同尾酶技术构建pET15b-PEP-1-CAT重组质粒,为制备PEP-1-CAT融合蛋白进而为防治心肌缺血再灌注损伤奠定基础。方法:设计并合成两端分别带SalⅠ和BglⅡ酶切位点的CAT引物,用PCR方法以pZeoSV2(+)-CAT质粒为模板,特异性扩增CAT全长cDNA。将扩增的CAT cDNA与dATP反应,利用Taq DNA聚合酶具有的非模板依赖性末端转移酶活性在CAT cDNA的3′末端加"A"并纯化,然后应用TA克隆策略将纯化后的CAT cDNA插入至中间载体pGEM-T Easy Vector中,经PCR、限制性酶切分析鉴定重组子pGEM-T-CAT。人工合成编码PEP-1的双链寡核苷酸,两端分别引入NdeⅠ和XhoⅠ酶切位点,将其插入pET15b中得到重组质粒pET15b-PEP-1,然后酶切鉴定。pGEM-T-CAT和pET15b-PEP-1分别经SalⅠ-BglⅡ和XhoⅠ-BamHⅠ双酶切,利用同尾酶(SalⅠ与XhoⅠ,BglⅡ与BamHⅠ)能酶切产生相同黏性末端的特性,将回收得到的CAT cDNA片段与pET15b-PEP-1相连,构建出重组质粒pET15b-PEP-1-CAT,经PCR及酶切鉴定,并通过核苷酸序列测序证实。结果:获得pET15b-PEP-1-CAT重组子,经测序分析证实,克隆入pET15b的PEP-1序列与设计合成的PEP-1序列一致,CAT序列与GeneBank中登录号为“AY028632”的CAT cDNA序列一致。结论:pET15b-PEP-1-CAT的成功构建为产生融合蛋白H is tag-PEP-1-CAT进而为防治心肌缺血再灌注损伤奠定了基础。