大鼠XAF1基因启动子荧光素酶报告质粒的构建及IRF-1结合位点的鉴定

目的:构建大鼠X染色体连锁的凋亡抑制蛋白相关因子1(X-linked inhibitor of apoptosis associated factor 1,XAF1)基因启动子(全长和截断)荧光素酶报告质粒,并观察在人胚肾细胞HEK293中过表达干扰素调节因子-1(interferon regulatory factor-1,IRF-1)对XAF1基因启动活性的影响,同时,筛选其可能的IRF-1结合位点?方法:采用PCR技术,扩增出大鼠XAF1基因启动子序列(-1497 ~ +166 nt),将XAF1基因启动子插入荧光素酶报告基因载体pGL3-basic中获得pGL3-XAF1-QC,与大鼠野生型IRF-1表达质粒(pcDNA3.1-IRF-1)共转染HEK293细胞,检测其荧光素酶活性,确定IRF-1对XAF1基因的启动作用?同时,应用生物信息学软件预测XAF1基因启动子上IRF-1潜在的结合位点,并构建截断的XAF1基因启动子荧光素酶报告质粒(pGL3-XAF1-1?pGL3-XAF1-2?pGL3-XAF1-3和pGL3-XAF1-4)?将上述全长和各截断的XAF1基因启动子荧光素酶报告质粒和IRF-1过表达质粒共转染HEK293细胞,再行荧光素酶活性测定,筛选IRF-1的结合位点?结果:菌液PCR及核酸测序证实,上述荧光素酶报告质粒均构建成功?将pGL3-XAF1-QC和pcDNA3.1-IRF-1共转染HEK293细胞发现,XAF1基因启动子活性显著增加?而将pGL3-XAF1-QC?pGL3-XAF1(1~4号)和pcDNA3.1-IRF-1共转染HEK293细胞后证实,pGL3-XAF1-3的启动活性显著低于pGL3-XAF1-1和pGL3-XAF1-2?提示IRF-1可能结合在大鼠XAF1基因启动子的-337 ~ -47 nt区域?结论:本实验成功构建了大鼠全长及截断的XAF1基因启动子荧光素酶报告质粒,并初步筛查出IRF-1在XAF1基因启动子上的结合区域,为后续研究奠定了基础?     

大鼠MIP⁃1α基因启动子荧光素酶报告质粒的构建及其IRF⁃8结合元件的初步鉴定

目的：构建大鼠巨噬细胞炎性蛋白-1α(macrophage inflammatory protein-1α,MIP-1α)基因启动子(全长和截短)荧光素酶报告质粒,并观察在人胚肾细胞(HEK-293T)中过表达干扰素调节因子-8(interferon regulatory factor-8,IRF-8)对MIP-1α基因启动活性的影响,同时,筛选其可能的IRF-8结合元件。方法：采用PCR技术,扩增出大鼠MIP-1α基因启动子序列,将MIP-1α基因启动子插入到荧光素酶报告基因载体pGL3-basic中,构建MIP-1α基因启动子全长荧光素酶报告质粒(pGL3-MIP-1α-FL)。将上述pGL3-MIP-1α-FL和本课题组已构建的大鼠IRF-8过表达质粒(pIRES2-IRF-8)共转染HEK-293T细胞,检测细胞内荧光素酶活性,确定IRF-8对MIP-1α基因的启动作用。同时,应用生物信息学软件预测MIP-1α基因启动子上IRF-8的结合元件,并据此构建3个MIP-1α基因启动子截短的荧光素酶报告质粒(pGL3-MIP-1α-1~3)。将上述MIP-1α基因启动子全长和各截短的荧光素酶报告质粒和IRF-8过表达质粒共转染HEK-293T细胞,再测定荧光素酶活性,初步确定IRF-8的结合元件。结果：菌液PCR及核酸测序证实,上述pGL3-MIP-1α-FL(-1400 ~ +94nt)质粒构建成功。将pGL3-MIP-1α-FL和pIRES2-IRF-8共转染HEK-293T后发现,过表达IRF-8可显著增加MIP-1α基因启动子活性。应用生物信息学软件预测发现MIP-1α基因启动子上IRF-8的结合元件(-1157~ -1144nt、-740~ -734nt、-683~ -670nt、-365 ~ -359nt、-249 ~ -236nt),并据此构建3个MIP-1α基因启动子截短的荧光素酶报告质粒,即pGL3-MIP-1α-1(-453 ~ +94nt)、pGL3-MIP-1α-2(-352 ~ +94nt)和pGL3-MIP-1α-3(-3 ~ +94nt)。将pGL3-MIP-1α-FL、pGL3-MIP-1α-1~3和pIRES2-IRF-8共转染HEK-293T后发现,pGL3-MIP-1α-3的启动活性显著低于pGL3-MIP-1α-FL、pGL3-MIP-1α-1和pGL3-MIP-1α-2。提示,IRF-8可能结合在大鼠MIP-1α基因启动子的-352 ~ -3nt区域的IRF-8结合元件(-249 ~ -236nt)上。结论：本实验成功构建了大鼠MIP-1α基因启动子全长及截短荧光素酶报告质粒,并初步筛查出IRF-8在MIP-1α基因启动子上的可能的结合元件,为后续研究奠定了基础。     

大鼠IL-6基因启动子荧光素酶报告质粒的构建及其与C/EBP β结合位点的鉴定

目的:构建大鼠IL-6基因启动子(全长和截短)荧光素酶报告质粒并予鉴定,观察人胚肾细胞(HEK293)中过表达CCAAT/增强子结合蛋白 β(CCAAT/enhancer binding protein β,C/EBP β)对该质粒基因启动子活性的影响?同时,筛选C/EBP β与IL-6基因启动子区的结合位点?方法:采用PCR技术,扩增出大鼠IL-6基因启动子全长序列(-1 791~ +30 nt),将IL-6基因启动子插入荧光素酶报告基因载体pGL3-basic中?将IL-6基因启动子全长荧光素酶报告质粒(pGL3-IL-6-1)和大鼠野生型C/EBP β表达质粒(pIRES2-EGFP-C/EBP β)共转染HEK293细胞,检测其荧光素酶活性,确定C/EBP β对IL-6基因的启动作用?另用生物信息学软件预测IL-6基因启动子上C/EBP β潜在的结合位点,并构建IL-6基因启动子截短的荧光素酶报告质粒(即pGL3-IL-6-2~5)?将上述IL-6基因启动子全长和各截短的荧光素酶报告质粒和C/EBP β过表达质粒共转染HEK293细胞,再行荧光素酶活性测定,筛选出C/EBP β的结合位点?结果:菌液PCR及核酸测序证实,上述荧光素酶报告质粒均构建成功?将pGL3-IL-6-1和pIRES2-EGFP-C/EBP β共转染HEK293细胞发现,IL-6基因启动子活性显著增加?另将pGL3-IL-6-1?pGL3-IL-6-2~5和pIRES2-EGFP-C/EBP β共转染HEK293细胞后发现,pGL3-IL-6-5的启动活性显著低于其他组?提示C/EBP β可能结合在IL-6基因启动子的-618 bp~ -126 bp区域?结论:成功构建了大鼠IL-6基因启动子全长及截短荧光素酶报告质粒,并初步筛查出了C/EBP β在IL-6基因启动子上的结合部位?     

转录因子MZF1对大鼠RGC32基因启动活性的影响及可能的结合部位

目的 :构建大鼠补体应答基因32(response gene to complement,RGC32)启动子(全长和截短)荧光素酶报告质粒,并观察人胚肾细胞(HEK293)过表达髓锌指基因1(myeloid zinc finger gene1,MZF1)对大鼠RGC32基因启动活性的影响。同时,筛选其可能的MZF1结合位点。方法:将RGC32基因启动子全长(-686~-1 nt)插入到荧光素酶报告基因载体p GL3-basic中,获得RGC32基因启动子全长荧光素酶报告质粒(p GL3-RGC32-FL)后,再将p GL3-RGC32-FL与本课题组前期构建的大鼠野生型MZF1表达质粒(p IRES2-EGFP-MZF1)共转染HEK293细胞,检测其荧光素酶活性,以确定MZF1对RGC32基因的启动作用。另用生物信息学软件预测RGC32基因启动子上转录因子MZF1潜在的结合位点,并据此构建3个RGC32基因启动子截短的荧光素酶报告质粒(即p GL3-RGC32-1、p GL3-RGC32-2和p GL3-RGC32-3)。将上述RGC32基因启动子全长和各截短的荧光素酶报告质粒与MZF1过表达质粒共转染HEK293细胞,再行荧光素酶活性测定,以筛选MZF1的结合位点。结果:菌液PCR及核酸测序证实,大鼠RGC32基因启动子(全长和各截短)的荧光素酶报告质粒均构建成功。将p GL3-RGC32-FL和p IRES2-EGFPMZF1共转染HEK293细胞发现,RGC32基因启动子活性显著增加。而将p GL3-RGC32-FL、p GL3-RGC32-1、p GL3-RGC32-2和p GL3-RGC32-3分别与p IRES2-EGFP-MZF1共转染HEK293细胞后显示,p GL3-RGC32-3的启动活性显著低于p GL3-RGC32-FL、p GL3-RGC32-1和p GL3-RGC32-2。提示MZF1可能结合在RGC32基因启动子的-286~-86 nt区域。结论 :成功构建了大鼠RGC32基因启动子全长及截短荧光素酶报告质粒,证实过表达MZF1可促进RGC32基因的启动,并初步筛查出转录因子MZF1在RGC32基因启动子上可能的结合区域。     

大鼠S100A8基因启动子质粒的构建及其SOX7结合元件的初步鉴定

目的：构建大鼠S100钙结合蛋白A8（S100A8）基因启动子荧光素酶报告质粒,并在HEK?293T中检查过表达性别决定区Y框蛋白7（SOX7）基因对S100A8启动子活性的影响,同时筛选可能的SOX7结合元件。方法：采用PCR技术扩增大鼠S100A8启动子全长,经双酶切后连接到pGL3?basic中,命名为pGL3?S100A8?FL。将pGL3?S100A8?FL与前期构建的pIRES2?SOX7质粒共转染HEK?293T,再测定荧光素酶活性。此外,运用JASPAR预测S100A8启动子区可能包含的SOX7结合元件,并依此构建4个启动子截短质粒（即pGL3?S100A8?1~4）。将pGL3?S100A8?FL和pGL3?S100A8?1~4分别与pIRES2?SOX7共转染HEK?293T,检查荧光素酶活性。接着构建SOX7结合元件突变的S100A8启动子质粒（即pGL3?S100A8?M）,与pIRES2?SOX7转染HEK?293T,检测其荧光素酶活性。结果：将pGL3?S100A8?FL与pIRES2?SOX7共转染HEK?293T,发现过表达SOX7可显著增加pGL3?S100A8?FL启动子活性。将pGL3?S100A8?FL和pGL3?S100A8?1~4分别与pIRES2?SOX7共转染HEK?293T,发现pGL3?S100A8?4启动子活性显著低于pGL3?S100A8?FL和pGL3?S100A8?1~3,提示SOX7与S100A8启动子结合元件可能位于-200~+51 nt区域内。将-86~-57 nt元件突变质粒（pGL3?S100A8?M）或pGL3?S100A8?FL与pIRES2?SOX7共转HEK?293T,发现pGL3?S100A8?M启动子活性显著低于pGL3?S100A8?FL。提示SOX7可能与S100A8启动子-86~-57 nt元件结合。结论：成功构建大鼠S100A8基因启动子全长、截短和突变荧光素酶报告质粒,并初步确定S100A8启动子区的SOX7结合元件。     

NF⁃κB p65调控IRF⁃8基因启动子活性及其启动子结合元件的初步鉴定

目的：探讨大鼠核因子?κB（nuclear factor?κB,NF?κB）p65亚基在细胞内过表达和其活性变化对干扰素调节因子?8（interferon regulatory factor?8,IRF?8）基因启动的影响,并初步筛查IRF?8启动子上可能的p65结合元件。方法：采用聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）技术扩增大鼠p65基因蛋白编码区（complete sequence coding,CDS）序列,将其插入到空载pIRES2?EGFP质粒中,构建大鼠野生型（wild type,WT）p65过表达质粒（pIRES2?p65 WT）。在此基础上,将p65第535位丝氨酸（serine,S）突变为天冬氨酸（aspartic,D）或丙氨酸（alanine,A）,分别构建p65持续活化突变型质粒（pIRES2?p65 S535D）和p65显性负性突变型质粒（pIRES2?p65 S535A）。之后应用生物信息学软件预测IRF?8基因启动子区p65的结合元件,并据此构建IRF?8启动子全长（full?length,FL）和3个截短的荧光素酶报告质粒,即pGL3?IRF?8?FL（-1 892 ~ +174 nt）、pGL3?IRF?8?1（-1 360 ~ +174 nt）、pGL3?IRF?8?2（-752 ~ +174 nt）和pGL3?IRF?8?3（-68 ~ +174 nt）。将上述质粒行不同组合共转染人胚肾293T（human embryonic kidney 293T,HEK?293T）细胞,Western blot和荧光素酶实验分别检查p65的表达和IRF?8的启动子活性,并分析IRF?8启动子区可能的p65结合元件。结果：菌液PCR及测序证实上述质粒构建成功。分别将pIRES2?p65 WT、pIRES2?p65 S535D、pIRES2?p65 S535A和pGL3?IRF?8?FL共转染HEK?293T,发现过表达pIRES2?p65 WT或pIRES2?p65 S535D均可明显增加IRF?8启动子活性,且以pIRES2?p65 S535D更为显著;而过表达pIRES2?p65 S535A后,IRF?8启动子活性无明显变化。将pGL3?IRF?8?FL、pGL3?IRF?8?1~3和pIRES2?p65 S535D共转染HEK?293T后发现,pGL3?IRF?8?3的启动子活性显著低于pGL3?IRF?8?FL、pGL3?IRF?8?1和pGL3?IRF?8?2,提示大鼠IRF?8启动子-752~68 nt区域可能存在p65结合元件。结论：在HEK?293T细胞内过表达野生型或持续活化突变型p65可显著促进IRF?8基因的启动,且p65与IRF?8启动子的结合元件可能位于-752~-68 nt部位。     

人TLR9真核表达载体在HEK293T细胞中的表达

目的 构建人Toll样受体9(TLR9)全长序列与绿色荧光蛋白GFP的重组质粒,观察融合蛋白在HEK293T细胞内表达并检测其应答CpG DNA的能力.方法 PCR法扩增TLR9全长,限制性内切酶BamH Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切绿色荧光真核表达质粒pcDNA3/GFP和TLR9全长,构建重组质粒pcDNA3-TLR9/GFP,脂质体转染人胚肾293T细胞(HEK293T),荧光显微镜下观察绿色荧光融合蛋白在细胞内的表达与分布;将重组质粒与NF-κB荧光素酶报告质粒pGL2-luc共转染HEK293T细胞,CpG DNA(10 mg/L)刺激后,化学发光法检测细胞内荧光素酶活性.结果 成功构建pcDNA3-TLR9/GFP质粒,经酶切及测序分析证实载体构建正确;转染细胞后,在荧光显微镜下观察到TLR9/GFP融合蛋白大量表达;重组质粒与pGL2-luc共转染细胞,应用荧光报告系统检测显示,CpG DNA刺激后荧光素酶活性显著高于生理盐水对照组(P<0.01).结论 重组质粒pcDNA3-TLR9/GFP在HEK293T细胞中表达的TLR9/GFP绿色荧光融合蛋白,能够识别CpG DNA并诱导增加胞内NF-κB转录活性.     

乙型肝炎病毒前S2蛋白激活人酰基蛋白硫酯酶1启动子

目的：探讨乙型肝炎病毒（HBV）前S2蛋白（preS2）对人酰基蛋白硫酯酶1（APT1）启动子的作用。方法生物信息学方法确定人APT1启动子序列。PCR扩增人APT1启动子和HBV preS2基因,分别插入pGL3和pcDNA3．1（－）质粒构建人APT1启动子荧光素酶报告基因质粒 pGL3‐APT1和 HBV preS2真核表达质粒 pcDNA3．1（－）‐preS2。将 pGL3‐APT1和pcDNA3．1（－）‐preS2共转染人肝癌细胞系 HepG2,然后通过检测细胞荧光素酶活性来评价 preS2对人APT1基因启动子的作用。数据用独立样本 t检验分析。结果测序结果证实pcDNA3．1（－）‐preS2与pGL3‐APT1与实验设计相符。pGL3‐APT1的荧光素酶活性是阳性对照质粒pGL3‐Control的荧光素酶活性的1．2倍（P＜0．01）。pcDNA3．1（－）‐preS2与pGL3‐APT1共转染HepG2细胞的荧光素酶活性为无preS2基因质粒pcDNA3．1（－）与pGL3‐APT1共转染 HepG2细胞荧光素酶活性的2．6倍（P＜0．01）。结论本研究克隆的人APT1启动子序列具有高启动子活性;HBV preS2可激活人APT1启动子。     

含hNIS报告基因的乏氧调控重组质粒的构建及其功能鉴定

目的构建乏氧应答启动子调控的人钠/碘共同转运体（hNIS）报告基因重组质粒,为实体瘤微环境乏氧的实时监测提供研究基础。方法合成乏氧反应元件（HRE）的核苷酸片段,克隆入pGL3-promoter,构建为pGL3-promoter-5×HRE载体。然后将扩增的hNIS基因插入pGL3-promoter-5×HRE载体中,构建为pGL3-promoter-5×HRE-NIS重组质粒并进行测序验证。以DMSO处理组作为对照,CoCl_2处理HEK293细胞模拟乏氧;将经验证的pShuttle-NIS质粒转染HEK293乏氧细胞,同时将构建的pcDNA3.1-HIF-1α质粒和pShuttle-NIS质粒按照3：1比例转染HEK293细胞,转染空质粒pcDNA3.1和pShuttle-NIS质粒组作为对照。通过qRT-PCR法检测hNIS基因表达的变化。并用高锝酸盐（~（99m）TcO_4~-）处理双质粒共转染的HEK293细胞,洗脱游离~（99m）TcO_4~-后通过γ计数器采集细胞放射性计数,检测所表达NIS蛋白的功能。结果克隆的基因产物与预期一致,序列无碱基的突变。共转染HIF-1α质粒组及转染pShuttle-NIS的CoCl_2处理组,其hNIS mRNA的表达量显著高于转染空质粒及DMSO处理组（均P〈0.01）。共转染HIF-1α质粒组细胞的~（99）TcO_4~-摄取率显著高于空质粒对照组（P〈0.01）。结论 pGL3-promoter-5×HRE-NIS重组质粒转染后能介导细胞摄取~（99m）TcO_4~-,为微环境细胞乏氧的核素显像提供实验依据。     

转录因子GATA结合蛋白3对哮喘易感基因ADAM33表达的影响

目的:探讨转录因子GATA结合蛋白3(GATA binding protein 3,GATA3)对解整合素金属蛋白酶33(a disintegrin and metalloproteinase 33,ADAM33)基因启动子活性及mRNA表达的影响.方法:以人正常肺上皮BEAS-2B细胞DNA为模板经PCR扩增得到AD...     

人Sox2对CD133基因启动子的调控研究

目的构建人Sox2基因的真核表达载体并研究其对CD133基因启动子的调控。方法采用PCR方法,从人乳腺癌细胞MCF-7的cDNA中扩增出Sox2基因全长,将其定向克隆至真核表达载体pcDNA3.0中,构建重组质粒pcDNA-Sox2,经限制性内切酶、PCR鉴定及测序正确后,分别将空载pcDNA3.0与重组质粒pcDNA-Sox2转染人神经胶质瘤U251细胞系,通过RT-PCR和Western blot方法,验证Sox2 mRNA和蛋白的表达。同样采用PCR方法,以人全基因组DNA为模板扩增CD133基因的启动子P1-3片段,并将此片段克隆到PGL3-basic荧光素酶报告基因质粒中,经限制性内切酶、PCR鉴定及测序正确后,将空载PGL3-bas-ic与PGL3-CD133-p1-3转染人神经胶质瘤U251细胞系,用双荧光素酶检测方法分析Sox2对CD133基因转录水平上的调控。结果扩增出954bp的Sox2基因,并检测到重组质粒Sox2 mRNA和蛋白的表达。扩增出2440bp的CD133-p1-3启动子片段,且Sox2可上调CD133基因启动子的表达。结论成功构建了人Sox2基因真核表达载体,以及CD133启动子荧光素酶报告质粒,并检测到Sox2与CD133之间存在一定的调控关系,为进一步研究人Sox2对CD133的作用奠定了基础。     

人参皂苷Rb1对NEP基因启动子活性的影响

目的 构建NEP启动子缺失体-荧光素酶报告基因质粒,探查神经内肽酶(NEP)基因启动子中与人参皂苷Rb1影响NEP启动子活性有关的位点。方法 用NEP基因5′上游启动区2.4kb片段和荧光素酶报告基因载体pGL3-basic构建NEP启动子-荧光素酶报告基因质粒pGL3-nep2.4;用Erase-a-Base System对pGL3-nep2.4质粒2.4kb DNA插入片段5′端进行缺失,构建NEP启动子缺失体-荧光素酶报告基因质粒;用Rb1处理NEP启动子缺失体转染的人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞,检测双荧光素酶活性,观察Rb1对NEP启动子活性的影响。结果 成功构建了含NEP启动子DNA序列的重组质粒pGL3-nep2.4。荧光素酶活性检测显示,转染pGL3-nep2.4质粒的SH-SY5Y细胞荧光素酶活性是转染pGL3-basic的13.1倍(P<0.01)。Rb1处理可使转染pGL3-nep2.4质粒的SH-SY5Y细胞荧光素酶活性增加,其是对照组的2.9倍(P<0.01);细胞荧光素酶活性检测亦显示,NEP基因上游启动区-894~-857bp(Region Ⅰ)及-100~-82bp(Region Ⅳ)片段缺失后,启动子活性分别是缺失前的29%(P<0.01)和25%(P<0.01),-559~-534bp(Region Ⅱ)及-223~-179bp(Region Ⅲ)片段缺失后,启动子活性分别是缺失前的5.12倍(P<0.01)及1.81倍(P<0.01)。Rb1处理后,RegionⅠ、Ⅱ和Ⅲ缺失体质粒转染细胞荧光素酶活性均与对照组无统计学差异(P>0.05),Region Ⅳ缺失质粒pGL3-226转染细胞荧光素酶活性也与对照组无明显差异(P>0.05),而含Region Ⅳ质粒pGL3-244转染细胞荧光素酶活性则是对照组的1.61倍(P<0.01)。结论 NEP基因5′上游2.4kb DNA片段有较强的启动子活性,Rb1能明显增加其活性。NEP基因2.4kb DNA片段有2个正调控区(RegionⅠ和Region Ⅳ)和2个负调控区(RegionⅡ和Region Ⅲ),Rb1通过Region Ⅳ发挥正调控作用。     

二甲双胍和LPS通过转录因子RUNX2调控NFATc2基因的转录

目的 构建人T细胞活化核因子C2（NFATc2）基因启动子荧光素酶报告基因载体pGL3-NFATc2-promoter,检测其转录活性,探究二甲双胍和脂多糖对其转录活性的影响。方法 利用UCSC网站查找人NFATc2基因的启动子序列并设计上下游引物PCR扩增人NFATc2基因启动子片段;用限制性内切酶KpnⅠ和HindⅢ双酶切质粒pGL3-basic,将人NFATc2基因启动子片段插入到pGL3-basic质粒,重组质粒命名为pGL3-NFATc2-promoter。将pGL3-NFATc2-promoter与内参质粒pRL-TK共转染293F细胞,检测其荧光素酶活性。同时构建人NFATc2基因启动子不同片段长度的报告基因载体并进行荧光素酶活性检测,分别给予不同浓度的二甲双胍和脂多糖处理24 h后检测二甲双胍和脂多糖对NFATc2转录活性的影响。进一步突变NFATC2基因启动子上转录因子RUNX2的结合位点探究二甲双胍和脂多糖对NFATc2的转录调控作用。结果 研究成功构建了不同片段长度（2170、2077、1802、1651、1083、323 bp）的人NFATC2基因启动子荧光素酶报告基因载体pGL3-NFATc2-promoter,经酶切及测序鉴定完全正确。将不同片段长度的pGL3-NFATc2-promoter转染到293F细胞,发现pGL3-1651 bp具有最高转录活性,荧光素酶活性约为pGL3-2170 bp的3.3倍（1.8433±0.1457 vs 0.5467±0.0850）。中浓度（5 mmol/L）和高浓度（10 mmol/L）的二甲双胍分别上调pGL3-1651 bp的转录活性多达2.5、3倍（1.3467±0.1601 vs 0.8867±0.0321,1.8124±0.2771 vs 0.8867±0.0321）。不同剂量的脂多糖均能上调pGL3-1651 bp的转录活性不低于1.6倍（1.4813±0.0616 vs 0.8867±0.0321）。突变pGL3-1651 bp上的RUNX2结合位点后,二甲双胍和脂多糖上调的pGL3-1651 bp转录活性均受到抑制,转录活性下降（2.1667±0.1527 vs 1.233±0.1155;2.3667±0.2887 vs 1.1333±0.3786）。结论 pGL3-NFATc2-promoter在293F细胞中能被转录激活,并证实脂多糖和二甲双胍转录激活pGL3-NFATc2-promoter依赖于转录因RUNX2。     

大鼠野生型IRF-1基因和IRF-1 shRNA真核表达质粒的构建及鉴定

目的:构建大鼠野生型干扰素调节因子1(interferon regulatory factor-1,IRF-1)基因及其特异性短发夹状小干涉RNA(shRNA)真核表达质粒,并观察IRF-1在大鼠肾小球系膜细胞(GMC)中过表达及沉默IRF-1基因的情况。方法:用DNA重组技术将针对大鼠IRF-1基因的CDS区序列和针对其不同位点所设计的3种shRNA序列分别克隆到pcDNA3.1及pGCsi.U6.neo.GFP真核表达质粒中。在酶切鉴定及序列测定正确后,用GenEscortTMⅢ转染试剂将上述两种质粒分别转染入培养的大鼠GMC中,然后用Western blot检查IRF-1融合蛋白的表达,同时筛选最佳沉默效率的shRNA。结果:限制性酶切及核酸序列分析证明,两种重组质粒均构建成功。Western blot证实构建的pcDNA3.1/IRF-1质粒在大鼠GMC中能正确表达,且IRF-1shRNA-2具有最佳沉默效率。结论:本实验成功构建了大鼠野生型IRF-1及其特异性的shRNA真核表达质粒,为进一步研究IRF-1基因的生物学功能提供了必要的实验材料。     

乙肝病毒截短型中蛋白表达载体的构建及反式激活作用的研究

目的:构建含有不同长度的乙肝病毒(HBV)截短型中蛋白的表达载体,并研究其反式激活作用。方法:设计引物扩增两条不同长度的HBV截短型中蛋白基因片段,分别定向克隆入真核表达载体pcDNA3,构建重组表达质粒pcS2与pcTS。重组子经HindⅢ单酶切、PCR及测序鉴定。将测序正确的重组子与报告质粒pGL3-control共转染肝癌细胞系HepG2,检测荧光素酶表达强度。结果:构建了两种HBV截短型中蛋白基因的表达质粒pcS2与pcTS,通过共转染证明均具有反式激活作用,且pcS2反式激活作用强于pcTS(P<0.01)。结论:成功构建了具有反式激活作用的重组表达载体,并证明HBV截短型中蛋白发挥反式激活作用的关键区段在前S2区。