结核杆菌复苏因子基因的克隆、表达及复苏作用的研究

目的研究结核杆菌复苏因子基因的复苏作用。方法PCR扩增结核杆菌复苏因子基因片段并克隆至表达载体pET30a中,IPTG诱导表达复苏因子蛋白,经树脂纯化后进行SDS-PAGE和Western blot分析;按不同浓度和不同组合进行休眠结核菌复苏培养。结果PCR扩增获得结核杆菌复苏因子基因片段,大小分别为1 200、900、500、500和450 bp,与理论值相符。重组质粒转化pET30a菌,IPTG诱导获得有活性的复苏因子蛋白,分子质量单位为36 ku。复苏实验证明,复苏因子蛋白有促结核杆菌复苏和生长作用,以低浓度组合效果最佳。结论结核杆菌复苏因子蛋白对休眠结核杆菌有促复苏作用。     

重组结核杆菌融合蛋白(EC)用于诊断结核分枝杆菌感染的有效性和安全性系统评价

目的: 系统评价重组结核杆菌融合蛋白(EC)相较于结核菌素纯蛋白衍生物(TB-PPD)用于诊断结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)感染的有效性和安全性。方法: 检索临床指南数据库、生物医学文献数据库、卫生行政部门和行业协会官方网站及不良反应监测官方网站,检索时间均自建库截止到2022年2月。英文检索词:Recombinant Mycobacterium tuberculosis fusion protein、CFP10/ESAT6;中文检索词:重组结核分枝杆菌融合蛋白、重组结核杆菌融合蛋白、宜卡、CFP10/ESAT6。收集重组结核杆菌融合蛋白(EC)和结核菌素纯蛋白衍生物(TB-PPD)诊断MTB感染有效性和安全性的指南、共识、团体标准、系统评价和原始研究等。由2名研究者独立筛选文献、提取资料并评价纳入研究的偏倚风险,根据异质性大小采用Meta分析或描述性分析。结果: 纳入指南2部、专家共识3篇、团体标准2部,均指出重组结核杆菌融合蛋白(EC)和结核菌素纯蛋白衍生物(TB-PPD)可用于诊断MTB感染和结核病辅助诊断。纳入系统评价1篇,结果显示,重组结核杆菌融合蛋白(EC)皮肤试验共招募参与者887名,其敏感度为86.06%(95%CI:82.39%~89.07%)。纳入原始研究4篇,均为随机对照试验,有效性Meta分析结果显示,不区分人群,重组结核杆菌融合蛋白(EC)和结核菌素纯蛋白衍生物(TB-PPD)的敏感度(89.3% vs. 90.4%)和阴性似然比(0.177 vs. 0.220)的差异无统计学意义,重组结核杆菌融合蛋白(EC)的特异度(85.5% vs. 47.3%)、诊断比值比(42.238 vs. 8.040)、阳性似然比(6.048 vs. 1.710)、阳性预测值(66.0% vs. 35.1%)、阴性预测值(96.2% vs. 94.0%)优于结核菌素纯蛋白衍生物(TB-PPD),差异有统计学意义。安全性结果显示,重组结核杆菌融合蛋白(EC)和结核菌素纯蛋白衍生物(TB-PPD)不良事件均为局部瘙痒和疼痛,均未发生严重不良事件。结论: 重组结核杆菌融合蛋白(EC)可用于MTB感染诊断、辅助结核病诊断,相较于结核菌素纯蛋白衍生物(TB-PPD),其有效性表现更优。     

结核菌素试验的临床应用进展

<正>结核菌素试验(PPD试验)是基于Ⅳ型变态反应原理的一种皮肤试验,从结核菌的液体培养基中提取出结核蛋白,注射于皮内,依据是否产生变态反应出现硬结,来判断机体有无感染过结核杆菌。目前世界卫生组织和国际防痨和肺病联合会推荐使用结核菌纯蛋白衍化物PPD-RT23,由标准人型结核杆菌H37Rv菌株培养获得,以便于国际间结核感染率的比较。一、结核菌素试验的机制凡感染过结核杆菌的机体,会产生相应的致敏     

利用适配子筛选结核杆菌H37Rv毒力基因方法探讨

目的 建立结核杆菌H37Rv的基因组文库,利用特异性结合H37Rv的适配子,筛选出H37Rv的毒力基因.方法 H37Rv经溶菌酶、蛋白酶K破菌后,提取结核杆菌基因组,用Sau3AI酶切后,连入pET28a,转入大肠杆菌BL21表达,提取蛋白,非变性蛋白电泳后,转入PVDF膜,用生物素标记的适配子与蛋白杂交,SABC试剂显色,将能与适配子反应的克隆子测序,与结核杆菌基因组序列比对,找出可疑的毒力基因.结果 建立了含有711个克隆子的H37Rv基因组表达文库,通过比较分析,找出两个可疑基因：aroF与PPK.结论 本研究利用适配子筛选出了2个结核杆菌H37Rv的毒力基因,建立了一种从结核杆菌基因组文库中筛选H37Rv毒力基因的方法.     

结核分支杆菌ESAT-6真核表达质粒的构建及蛋白表达的鉴定

目的 用6kDa早期分泌性抗原靶蛋白(ESAT-6)基因构建真核表达重组质粒pcDNA3．1( )-ESAT-6，并鉴定其在真核细胞(COS-7)中的蛋白表达。方法 以结核杆菌H37Rv株基因组DNA为模板，用PCR对ESAT-6基因进行扩增，将扩增的产物连接于测序载体pUCm—T上，经测序反应确定无误后，再将PCR反应产物克隆于真核表达载体pcDNA3．1( )上。并用脂质体介导真核表达重组质粒pcDNA3．1( )-ESAT-6转染真核细胞COS-7，72h后，通过SDS—PAGE和免疫印迹鉴定ESAT-6基因表达的蛋白。结果 用结核杆菌基因ESAT-6构建重组真核表达质粒pcDNA3．1( )-ESAT-成功，通过SDS—PAGE证明重组质粒转化的细胞内有一分子量6kDa的特异蛋白，免疫印迹证明该6kDa蛋白能与抗ESAT-6单克隆抗体反应。结论 结核杆菌早期分泌性蛋白ESAT-6真核表达重组质粒成功构建，该质粒转染的细胞能够产生、分泌结核杆菌早期分泌性蛋白ESAT-6。     

胃蛋白酶消化和戊烷分界面浓缩检查痰内人型结核桿菌

试验室内通常对痰的处理,是采用碱或酸消化后沉淀的方法来检查和分离结核杆菌,而这些方法对结核杆菌并不是没有害处。不同的学者提议用蛋白水解酶(Proteolytib enzymes)作为痰的消化剂;几年来更认为碳氢化合物以及其他不溶于水的脂肪溶剂,可以作为结核杆菌的浓缩剂。但因种种原因,在以酶消化的同时又用碳氢化合物浓缩的方法,并未广泛座用于试验室诊断;曾经被采用的是,用胃蛋白酶消化和戊烷(Pentane)浓缩方法检查痰和分离结核杆菌,并收到     

结核分枝杆菌ESAT-6基因体外扩增、克隆及在耻垢分枝杆菌中的表达

目的体外扩增结核杆菌ESAT-6基因,并构建大肠杆菌-分枝杆菌穿梭质粒ps3000-ESAT-6和重组耻垢分枝杆菌。方法采用聚合酶链式反应(PCR)方法,体外扩增结核杆菌ESAT-6基因,克隆入pGEMT载体。然后,构建亚克隆ps3000-ESAT-6大肠杆菌-分枝杆菌穿梭质粒,经电转化方法,将ESAT-6基因的穿梭质粒转化到耻垢分枝杆菌(Mycobacteri-umsmegmatis mc~2155)中,热诱导此重组耻垢分枝杆菌,用SDS-PAGE电泳观察ESAT-6蛋白的表达,Western blotting鉴定其生物学活性。结果成功扩增了结核杆菌ESAT-6基因;正确构建穿梭质粒ps3000-ESAT-6,用pET表达系统ESAT-6纯化蛋白免疫小鼠的多抗血清通过Western blot证实了该重组耻垢杆菌中有表达并具有生物学活性。结论ESAT-6重组耻垢分枝杆菌构建成功,为下一步表达ESAT-6蛋白的重组BCG(BacilliCalmette-Guérin)疫苗的研究奠定了基础。     

聚合酶链反应快速诊断结核性心包炎

应用聚合酶链反应(PCR)技术建立了扩增结核杆菌复合物MPB64蛋白基因的方法。对6种抗酸分枝杆菌和4种普通菌进行检测,结果仅人型结核杆菌、牛型结核杆菌及卡介菌(BCG)扩增出240bp特异性条带;用~(32)P标记的寡聚核苷酸探针进行斑点杂交进一步证实了该结果。PCR检测人型结核杆菌的敏感性可达10fgDNA或10个菌体。应用PCR检测36例临床诊断为心包炎(Pericarditis)的心包液标本,结果结核菌的阳性率为72.22％,明显高于抗酸染色(8.33％)及细菌培养(19.44％)的阳性率(P<0.001)。表明:PCR是一种特异、敏感、快速的诊断结核性心包炎(Tuberculous pericarditis)的方法。     

结核杆菌体内诱导基因的筛选及初步分析

目的筛选结核杆菌在人体内诱导表达的基因，进而作为候选的免疫及药物分子新靶位。方法构建结核杆菌基因组表达文库，应用体内诱导的抗原技术，用吸收过的结核患者血清筛选文库，对阳性克隆测序得到开放阅读框（ORF）。结果实验共确定r51个ORF。按照功能分为8类：毒力、解毒及调节相关基因1个，细胞壁与细胞处理相关基因13个，中间代谢和呼吸相关基因11个，脂类代谢基因7个，信号通路基泪2个，PE／PPE蛋白家族基因3个，保守假设蛋白基因12个，与牛型分枝杆菌同源的保守假设蛋白基因2个。结论应用体内诱导抗原技术可以筛选到结核杆菌进入人体后诱导表达的基因，其中部分基因可以作为结核病预防、诊断和治疗研究的候选靶位。     

结核杆菌Ag85A DNA疫苗在小鼠体内的免疫效应比较

目的探索增强结核杆菌DNA疫苗有效性的新方法，为研制并开发新一代高效结核杆菌DNA疫苗奠定基础。方法分别构建结核杆菌Ag85A抗原基因真核表达质粒及其与小鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的真核嵌合表达质粒，体外转染COS7细胞检测两种重组质粒的表达活性后，将其分别用作DNA疫苗给BALB／c小鼠肌内注射，检测小鼠体内特异性体液免疫和细胞免疫应答相关指标，同时进行动物免疫保护性实验，比较分析两种DNA疫苗在小鼠体内的免疫效应。结果结核杆菌Ag85A抗原蛋白基因与小鼠粒细胞一巨噬细胞集落刺激因子的嵌合DNA疫苗在小鼠体内的免疫原性明显强于Ag85A抗原基因非嵌合DNA疫苗，但两种DNA疫苗的免疫保护性无明显差异。结论粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子与结核杆菌免疫保护性抗原基因嵌合DNA疫苗能显著增强结核病DNA疫苗的免疫原性。     

结核杆菌Ag85A及ESAT-6双价抗原融合表达载体的构建及其在大肠杆菌中的高效表达

目的　为结核病新型疫苗研究提供靶基因和靶抗原。方法　采用PCR扩增的方法获得结核杆菌两种免疫保护性抗原Ag85A及ESAT - 6的基因 ,将其定向克隆入真核及原核穿梭表达型载体 pBK -CMV构建含嵌合目的基因的重组质粒 ,转化大肠杆菌后用IPTG进行诱导表达 ,并通过SDS -PAGE和Western -blotting对表达蛋白进行初步分析。结果　 1)从结核杆菌H37Rv株基因组DNA中扩增出Ag85A及ESAT - 6基因。 2 )成功构建了结核杆菌Ag85A及ESAT - 6双价抗原融合表达质粒 pBK - 85A -E6。 3)重组质粒 pBK - 85A -E6经IPTG诱导后能在大肠杆菌中稳定表达 38kDa的融合蛋白。 结论　成功构建了结核杆菌Ag85A及ESAT - 6双价抗原融合表达载体 ,并在大肠杆菌中实现了稳定表达 ,为进一步研究其在结核病基因工程疫苗研制中的应用奠定了基础。     

检测纯蛋白衍化物(结核菌素)的抗体用于结核性脑膜炎的早期诊断

结核性脑膜炎是一型严重的肺外结核,早期诊断方可有效治疗。但脑脊液涂片找结核杆菌的阳性率很低(最高者不超过20%),而脑脊液结核杆菌培养又需数周时间。为探索结核性脑膜炎的早期诊断方法,作者采用酶联吸附试验(ELISA)检测了4例结核性脑膜炎,9例化脓性脑膜炎和12例非脑膜炎引起痉挛性疾患的患者脑脊液中纯蛋白衍生物(PPD)的 IgG 抗体。4例结核性脑膜炎患者其脑脊液结核杆菌培养均为阳性。检测结果表明,结核性脑膜炎组光密度(0.924±0.159)显著高于化脓性脑膜炎组光密度(0.405±0.089,P<0.005)和非脑膜炎引起的痉挛性     

结核分枝杆菌Ag85B基因体外扩增、克隆及在耻垢分枝杆菌中的表达

目的体外扩增结核杆菌Ag85B基因,构建大肠埃希菌-分枝杆菌穿梭质粒ps3000-Ag85B,并重组耻垢分枝杆菌(Mycobacteriums megmatis mc2155)。方法采用聚合酶链式反应(PCR)方法,体外扩增结核杆菌Ag85B基因,克隆入pGEMT载体;构建亚克隆ps3000-Ag85B大肠埃希菌-分枝杆菌穿梭质粒,电转化方法将有Ag85B基因的穿梭质粒转化到耻垢分枝杆菌中。热诱导此重组耻垢分枝杆菌,用SDS-PAGE电泳观察Ag85B蛋白的表达,Western blot鉴定其生物学活性。结果PCR扩增结核杆菌Ag85B基因片段大小为990bp,构建的穿梭质粒ps3000-Ag85B酶切片段为990bp,与理论值相符。经Western blot检测,该重组耻垢杆菌表达蛋白能被结核病患者血清识别。结论Ag85B重组耻垢分枝杆菌构建成功,为下一步表达Ag85B蛋白的重组BCG(Bacilli Calmette-Guérin)疫苗的研究奠定了基础。     

发现结核杆菌噬菌体中含抗菌肽

近日,中科院昆明动物所研究员赖仞领导的课题组,从结核杆菌噬茵体中识别出一小分子多肽。该抗茵肽有望成为一种治疗结核杆菌感染的辅助药物,或作为研发抗结核药物的模板。噬菌体作为一种真细菌的病毒,可有效地与宿主细菌相互作用。为此,赖仞课题组推测结核杆菌噬菌体可产生相关的功能物质,与结核杆菌相互作用,甚至直接抑制或杀灭结核杆菌。     

结核分枝杆菌原核泛素蛋白酶体的研究进展

泛素-蛋白酶体系统是细胞内蛋白质降解的重要机制,并参与细胞生理功能调控。研究发现,结核分枝杆菌泛素样蛋白-蛋白酶体系统可调控并介导结核杆菌逃避宿主的免疫监视和杀灭。因此,介于结核分枝杆菌中的类泛素-蛋白酶体系统在结核分枝杆菌的生理功能及其致病过程中的重要性,且被认为是新的结核病药物治疗靶点。此文就真核生物泛素-蛋白酶体系统(Ubiquitin-proteasome system,UPS)与Mtb中的类泛素-蛋白酶体系统(Pup-proteasome system,PPS)的差异展开比较,通过辅助因子Pup,Mpa,Dop,PafA及靶蛋白在Mtb中类泛素-蛋白酶体系统中介导蛋白质降解的过程,进一步阐明辅助因子的缺失和突变对新兴的耐药结核杆菌产生的影响展开作一综述。     

结核杆菌Rv0901基因真核表达质粒的构建及在细胞内的表达与鉴定

目的构建结核杆菌Rv0901基因的真核表达质粒并进行表达,为研究Rv0901基因的功能提供材料。方法以结核杆菌基因组DNA为模板PCR扩增Rv0901基因序列,将Rv0901基因定向克隆到真核表达质粒pcDNA3.1（＋）获得重组表达质粒,体外转染Cos7细胞,RT-PCR检测转染的情况,并提取转染细胞总蛋白和收集细胞培养液上清检测蛋白的表达,Western-blotting检测蛋白表达的特异性。结果成功扩增出Rv0901基因序列,成功构建重组真核表达质粒pcDNA3.1-Rv0901,重组质粒转染细胞后的RT-PCR能扩增出Rv0901基因序列,转染细胞总蛋白和细胞培养液上清均能特异表达Rv0901基因蛋白。结论成功构建Rv0901基因真核表达质粒并在真核细胞内进行了良好表达,为研究该基因功能打下了坚实基础。     

美发现结核杆菌控制铜代谢蛋白的基因

美国Stanford同步加速辐射实验室（SSRL）的科学家最近发现了结核杆菌控制铜代谢蛋白的基因。铜是生物必不可少的一种元素，但是其含量必须受到严格控制，因为过量的铜会导致细胞死亡。[第一段]     

不同结核杆菌抗原在结核病体免疫诊断中价值的研究

目的 研究不同结核杆菌单体蛋白抗原在结核病体液免疫诊断中的价值。方法以快速免疫色谱法检测结核杆菌５种单体蛋白的抗原性，观察其在结核病诊断中的敏感性和特异性。并与ＰＰＤ皮试及脂阿拉糖甘露聚糖相比较。结果 ＩＣＴＴＢ卡诊断结核病的特异性为８７．６％，ＬＡＭ诊断结核病的特异性６２．９％，ＰＰＤ皮试诊断结核病的特异性为６８．９％，前者与后二者间差异分别有非常显著意义；如果去除抗原４，５，那么诊断结核病的特     

结核分枝杆菌热休克蛋白Hsp16.3的表达、纯化及鉴定

目的构建结核分枝杆菌小分子热休克蛋白Hsp16.3原核表达载体,获得Hsp16.3蛋白,并进行纯化及鉴定。方法以结核分枝杆菌H37Rv株基因组DNA为模板,应用PCR方法扩增Hsp16.3基因,以pET28a为载体,构建重组质粒pET28a-Hsp16.3,测序正确后,转入宿主菌BL21(DE3)进行诱导表达。融合蛋白经SDS-PAGE,Western blot分析鉴定,并通过镍柱进行亲和层析纯化,表达蛋白分子质量约17ku,能被结核杆菌16ku单抗和小鼠抗His Tag单抗识别。结果成功构建了Hsp16.3原核表达载体pET28a-Hsp16.3,并在宿主菌BL21(DE3)中表达,表达蛋白分子质量单位约17ku,能被结核杆菌16ku单抗和小鼠抗His Tag单抗识别。结论 Hsp16.3基因克隆入宿主菌中并成功表达,纯化Hsp16.3蛋白具有生物学活性,为Hsp16.3的进一步研究奠定了基础。     

重组结核杆菌热休克蛋白Acr2的原核表达、纯化及鉴定的研究

目的原核表达、纯化结核杆菌热休克蛋白Acr2分子,并分析其免疫反应性。方法采用PCR法扩增结核杆菌Acr2基因,并构建重组表达质粒PET22b-Acr2,转化大肠埃希菌BL21(DE3)菌株,并用IPTG诱导Acr2蛋白表达。以及使用镍离子亲和层析柱纯化该表达产物,并通过Western blot检测其免疫反应性。结果 PCR、双酶切和测序结果均表明PET22b-Acr2重组质粒构建成功,其在大肠埃希菌中主要以包涵体蛋白形式进行表达。复性后的包涵体蛋白经镍离子亲和层析柱纯化后,可获得纯化的Acr2重组蛋白,该重组蛋白分子质量约为18.3ku,与结核分枝杆菌Acr2蛋白的理论预测值相符。经Western blot检测显示该重组蛋白能被结核病人血清特异性识别。结论原核表达质粒PET22b-Acr2被成功构建,以及Acr2重组蛋白被有效进行表达和纯化,从而为进一步研究其生物学功能奠定了基础。