结核杆菌体内诱导基因的筛选及初步分析

目的筛选结核杆菌在人体内诱导表达的基因，进而作为候选的免疫及药物分子新靶位。方法构建结核杆菌基因组表达文库，应用体内诱导的抗原技术，用吸收过的结核患者血清筛选文库，对阳性克隆测序得到开放阅读框（ORF）。结果实验共确定r51个ORF。按照功能分为8类：毒力、解毒及调节相关基因1个，细胞壁与细胞处理相关基因13个，中间代谢和呼吸相关基因11个，脂类代谢基因7个，信号通路基泪2个，PE／PPE蛋白家族基因3个，保守假设蛋白基因12个，与牛型分枝杆菌同源的保守假设蛋白基因2个。结论应用体内诱导抗原技术可以筛选到结核杆菌进入人体后诱导表达的基因，其中部分基因可以作为结核病预防、诊断和治疗研究的候选靶位。     

不同抗原酶联免疫斑点检测技术对结核性胸膜炎辅助诊断价值的比较

目的 探讨结核分枝杆菌不同抗原的酶联免疫斑点检测技术(ELISPOT)对结核性胸膜炎的辅助诊断价值.方法 分离55例结核性胸膜炎患者和43例恶性胸腔积液患者的胸腔积液单个核细胞(PEMCs),经早期分泌抗原靶6 kD(ESAT-6)、培养滤液蛋白10 kD (CFP-10)、ESAT-6/CFP-10融合蛋白(E/C)...     

结核分枝杆菌感染T细胞斑点试验对淋巴结结核的辅助诊断价值研究

目的 探讨评价结核分枝杆菌感染T细胞斑点试验（T-SPOT.TB）对淋巴结结核的辅助诊断价值.方法 本研究募集北京胸科医院2011年7月至2013年12月收治住院的淋巴结肿大患者185例,最终分为确诊结核性淋巴结组（51例）、非结核性淋巴结疾病组（105例）,其余诊断不明确或临床诊断淋巴结结核患者予以剔除.所有患者均行外周血T-SPOT.TB及免疫印迹法检测结核分枝杆菌抗体.采用SPSS 17.0进行统计学分析,非正态分布的计量资料数据用中位数（上下四分位数）[M（P25,P75）]表示,两组间斑点形成个数（SFCs）数据比较采用Mann WhitneyU检验,组间样本率的比较采用x2检验,以P＜0.05为差异具有统计学意义.结果 T-SPOT.TB和免疫印迹法检测结核分枝杆菌抗体的敏感度分别为92.2％（47/51）和60.8％（31/51）,特异度分别为79.0％（83/105）和77.1％（81/105）,T-SPOT.TB敏感度显著高于免疫印迹法检测结核分枝杆菌抗体方法,差异有统计学意义（x2=13.95,P＜0.01）.结核分枝杆菌特异抗原刺激下结核性淋巴结组SFCs中位数为242个（57,621个）/106外周血单个核细胞（PBMCs）,非结核性淋巴结疾病组SFCs中位数为0个（0,20个）/106 PBMCs,结核性淋巴结组SFCs数量显著高于非结核性淋巴结疾病组,应用Mann Whitney U检验,两组间差异具有统计学意义（U=472.0,P＜0.01）.在T-SPOT.TB结果阳性的69例患者中,47例结核性淋巴结患者SFCs的M（P25,P75）为280个（98,684个）/106 PBMCs,显著高于对照组22例非结核性淋巴结疾病患者SFCs的M（P25,P75）52个（35,93个）/106 PBMCs（U=146.5,P＜0.01）.结论 T-SPOT.TB方法在淋巴结结核的诊断中有着较高的敏感度,有可能成为淋巴结结核辅助诊断的一项重要手段.     

应用于结核性胸膜炎分子生物学检测的胸腔积液核酸提取方法初步比较分析北大核心CSCD

目的筛选鉴定有助于结核性胸膜炎分子生物学检测的胸腔积液核酸提取方法。方法收集18例结核性胸膜炎患者胸腔积液样本,分别采用6种方法提取核酸,应用微滴数字PCR技术分析样本中结核分枝杆菌特异性核酸IS6110和IS1081数量,以此评估不同胸腔积液核酸提取方法的优劣。结果对于胸腔积液原液或胸腔积液离心上清,采用柱法和磁珠法提取的核酸样本中靶标数量无明显差别。对于胸腔积液离心沉渣,采用物理破碎法提取的核酸样本中IS6110和IS1081数量显著高于化学破碎法(IS6110,Z=-3.408,P=0.001;IS1081,Z=-3.297,P=0.001)。相比于小体积(0.7 mL)胸腔积液原液直接提取,大体积(4 mL)胸腔积液离心的上清和沉渣(物理破碎)中提取的核酸样本含有更多的靶标数量(分别IS6110,Z=-3.237,P=0.001,IS1081,Z=-2.667,P=0.008;IS6110,Z=-3.157,P=0.002,IS1081,Z=-2.250,P=0.024)。结论大体积胸腔积液离心上清游离核酸提取法和离心沉渣物理破碎核酸提取法能够富集更多的结核分枝杆菌核酸,是较好的用于结核性胸膜炎分子生物学检测的核酸制备方法。     

基于基因芯片的miRNA表达差异在结核性脑膜炎与病毒性脑膜炎诊断中的价值

目的: 评价基于基因芯片的miRNA表达差异在结核性脑膜炎(tuberculous meningitis,TBM)与病毒性脑膜炎(viral meningitis,VM)诊断中的价值。方法: 选取2017年12月至2019年9月在首都医科大学附属北京胸科医院和首都医科大学附属北京天坛医院治疗的TBM患者28例和VM患者27例作为验证样本进行实时荧光定量逆转录PCR(qRT-PCR)验证。选取前期收集的8例TBM患者和5例VM患者作为基因芯片样本进行全基因组miRNA微阵列分析,通过预测差异性miRNA的靶基因、基因本体(GO)富集分析、京都基因与基因组百科全书(KEGG)信号通路分析、构建蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络筛选出两病间前10个差异性miRNA枢纽基因。再采用qRT-PCR对患者间表达差异明显的miR-21-5p进行验证,并通过受试者工作特征曲线(ROC)下面积(AUC)分析miRNA的诊断价值。结果: 通过miRNA微阵列分析初步筛选出26个差异表达的miRNA(14个表达上调,12个表达下调)和对应的靶基因3217个。经GO富集分析、KEGG信号通路分析筛选出190个相关靶基因,对其进行PPI网络分析,筛选出前10个靶基因作为核心靶基因。对基因芯片检测样本的hsa-miR-21-5p相对表达量进行qRT-PCR验证,发现TBM患者hsa-miR-21-5p的表达水平[15.890(3.423,25.581)]较VM患者[0.807(0.614,0.955)]明显上调(Z=-2.355,P=0.019),差异倍数(TBM/VM)在基因芯片和qRT-PCR中分别是4.817和4.660,两种检测方法结果基本一致;对28例TBM和27例VM患者的hsa-miR-21-5p进行qRT-PCR结果比较,发现hsa-miR-21-5p在TBM患者的相对表达量为4.825(2.433,21.362),明显高于VM患者[0.204(0.112,0.711)],差异有统计学意义(Z=-5.000,P=0.000),且ROC曲线区分TBM与VM患者的AUC为0.893(0.806~0.980),敏感度为85.7%,特异度为88.9%。结论: 相较于VM患者,作为基因芯片检测中表达差异明显的miR-21-5p在TBM患者中表达明显上调,可作为鉴别TBM与VM的潜在生物标志物。     

复苏因子薄层琼脂快速培养法诊断结核性胸膜炎的应用研究

目的 建立胸腔积液结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,M.tb)复苏因子薄层琼脂(Rpfs-TLA)快速培养法并评估其临床应用价值。方法 收集2016年7月至2018年11月北京胸科医院103例结核性胸膜炎和34例其他胸膜疾病患者的胸腔积液,经过离心、消化处理后进行M.tb复苏因子薄层琼脂和普通薄层琼脂培养,比较Rpfs-TLA与普通TLA培养M.tb的阳性率、平均报阳时间、菌落形成单位数的组间差异。结果 胸腔积液Rpfs-TLA培养组和普通TLA对照组M.tb的阳性率分别为43.7%和29.1%,差异有统计学意义(χ²=54.56,P<0.001)。Rpfs-TLA培养显微镜下微菌落与肉眼可视菌落平均报告时间为11.87 d和18.13 d,差异有统计学意义(t=31.82,P<0.001)。Rpfs-TLA与普通TLA培养显微镜下微菌落的平均报告时间为11.87 d 和20.60 d,差异有统计学意义(t=16.62,P<0.001)。Rpfs-TLA诊断结核性胸膜炎的灵敏度为43.7%,特异度为100%,准确度为57.7%。结论 Rpfs-TLA 是一种准确、快速、廉价且易于培养的方法,可为结核性胸膜炎诊断提供帮助。     

结核分枝杆菌复苏因子D基因在真核细胞中的表达

目的构建结核分枝杆菌复苏因子D基因（RpfD）真核表达载体,为结核分枝杆菌复苏因子DNA疫苗的研究奠定基础。方法 PCR扩增复苏因子D基因片段,克隆至PcDNA3.1（-）载体中,重组质粒测序正确后,转染至CHO细胞中。通过G418筛选,RT-PCR检测克隆基因mRNA在真核细胞的表达,Westernblot检测目的蛋白的表达。结果构建了PcDNA-RpfD表达载体,RT-PCR证实构建的载体能在CHO细胞中表达RpfD基因mRNA,Western blot证实转染了载体的CHO能表达RpfD蛋白质。结论成功构建PcDNA-RpfD真核表达载体,转染细胞CHO能表达RpfD蛋白质。     

不同抗原的酶联免疫斑点检测技术对结核病的辅助诊断价值比较

目的比较不同MTB抗原的酶联免疫斑点检测技术（ELISPOT）,探索其对活动性结核病的辅助诊断价值。方法对结核组132例和对照组90例观察对象应用PPD、克隆表达的早期分泌抗原靶6000（ESAT-6）和ESAT-6／培养滤液蛋白10000（CFP-10）融合蛋白（简称E／C）进行酶联免疫斑点检测（ELISPOT）,检测外周血单个核细胞（PBMC）中经3种抗原刺激后斑点形成细胞（SFC）的数量;对照组同时进行PPD试验。计量资料用中位数（四分位间距）表示,计量资料的比较采用Mann-Whitney u检验,计数资料的比较采用X^2检验。结果结核组PPD—ELISPOT、E／C—ELISPOT、ESAT-6-ELISPOT形成的SFC数分别为255（93～526）、148（40～354）和28（10～116）,均明显高于对照组的10（5～41）、10（0～20）和5（0～15）,差异均有统计学意义（U值为1390．5～2510．5,均（P〈0．01）;E／C—ELISPOT和PPD-ELISPOT的敏感度分别为90．3％和84．8％,均明显高于ESAT-6-ELISPOT（62．1％）,差异均有统计学意义（X^2值分别为17．496和28．541,均P〈0．01）;E／C—ELISPOT和ESAT-6-ELISPOT的特异度分别为8414％和88．9％,均明显高于PPD—ELISPOT（68．9％）,差异均有统计学意义（膏值分别为6087和10．808,P〈0．05和P〈0．01）。结论E／C-ELISPOT有可能作为辅助诊断结核病的方法,但其特异度易受MTB潜伏感染的影响。     

噬菌体硝酸盐还原实验方法的建立与评估

目的 采用噬菌体与硝酸盐还原实验结合的技术,以期建立一种新的快速、简易、廉价的结核杆菌药敏检测方法.方法 对49株结核杆菌的临床分离株以噬菌体硝酸盐还原实验(PhaB-NRA法)与改良罗氏绝对浓度法对结核杆菌进行利福平、异烟肼药物敏感性测定,以绝对浓度法作为参照标准判定PhaB-NRA法的敏感性、特异性、准确性及其可行性.结果 PhaB-NRA法对利福平进行药物敏感性测定的敏感性、特异性、准确性分别为89.1%、91.67%、89.8%;对异烟肼进行药物敏感性测定的敏感性、特异性、准确性分别为86.21%、90.0%、87.8%.它们与绝对浓度法的符合率分别为利福平:0.746;异烟肼:0.750.结论 PhaB-NRA法简化了实验步骤、缩短了药敏检测时间,且无需昂贵的仪器,有望成为快速结核杆菌药物敏感性测定的初筛方法.     

γ-干扰素释放试验中两种细胞计数方法的对比分析

目的比较Muse Cell Analyzer自动细胞分析仪和显微镜人工镜检两种计数方法对外周血单个核细胞(PBMC)悬液的计数结果,探讨Muse Cell Analyzer自动细胞分析仪用于γ-干扰素释放试验(T-SPOT.TB)中细胞定量的可行性。方法随机抽取T-SPOT.TB检测中的60份血液标本,对其外周血单个核细胞悬液,分别用人工显微镜和Muse Cell Analyzer自动细胞分析仪计数PBMC,同时进行T-SPOT.TB检测,对结果进行比较分析。结果人工显微镜和Muse Cell Analyzer自动细胞分析仪两种计数方法相关性好(r=0.967);细胞悬液用人工显微镜计数所得PBMC浓度为(6.03±2.18)×109/L,用Muse Cell Analyzer自动细胞分析仪计数所得PBMC浓度为(6.10±2.34)×109/L,两者比较差异无统计学意义(P>0.05);按两种计数方法所得T-SPOT.TB检测结果一致性好。结论 Muse cell analyzer自动细胞分析仪计数可取代人工显微镜计数法用于T-SPOT.TB检测中对细胞悬液中PBMC的计数。