结核分枝杆菌复苏因子基因克隆及其蛋白质的表达

结核病仍然是严重危害人类健康的重大公共卫生问题。如何提高临床标本结核杆菌培养阳性率、缩短培养时间是提高结核病诊疗和控制水平的关键。     

对氨水杨酸钠耐药与结核分枝杆菌胸苷酸合成酶基因突变的研究

目的检测结核分枝杆菌临床分离株对氨水杨酸钠（PAS）耐药和胸苷酸合成酶（thyA）基因突变的关系，探讨结核分枝杆菌PAS耐药的分子机制。方法95株结核分枝杆菌临床分离株中的51株PAS敏感株和44株PAS耐药株的PAS耐药相关基因thyA基因进行PCR扩增，扩增产物纯化后进行序列测定，与结核分枝杆菌标准株H37Rv的野生型thyA基因序列进行比对，判断这些临床分离株thyA基因有无突变。结果51株PAS敏感株thyA基因未检出突变，44株PAS耐药株中有16个临床分离株的thyA基因检测到突变，突变检出率为36．4％（16／44）。突变类型包括置换、颠换、插入、缺失，均为单碱基改变或单碱基缺失，其中2株为thyA基因2个位点联合突变。结论结核分枝杆菌thyA基因突变是其产生PAS耐药的重要原因之一。结核分枝杆菌胸苷酸合成酶是PAS作用的重要靶位。     

结核杆菌体内诱导基因的筛选及初步分析

目的筛选结核杆菌在人体内诱导表达的基因，进而作为候选的免疫及药物分子新靶位。方法构建结核杆菌基因组表达文库，应用体内诱导的抗原技术，用吸收过的结核患者血清筛选文库，对阳性克隆测序得到开放阅读框（ORF）。结果实验共确定r51个ORF。按照功能分为8类：毒力、解毒及调节相关基因1个，细胞壁与细胞处理相关基因13个，中间代谢和呼吸相关基因11个，脂类代谢基因7个，信号通路基泪2个，PE／PPE蛋白家族基因3个，保守假设蛋白基因12个，与牛型分枝杆菌同源的保守假设蛋白基因2个。结论应用体内诱导抗原技术可以筛选到结核杆菌进入人体后诱导表达的基因，其中部分基因可以作为结核病预防、诊断和治疗研究的候选靶位。     

结核分枝杆菌休眠菌复苏初期与活跃期的差异表达基因分析

目的 寻找休眠结核分枝杆菌复苏的关键基因，探讨结核分枝杆菌复苏的机制。方法 取7H9培养20天的H37Rv作为对数生长期的活跃结核分枝杆菌，并提取RNA。取一部份对数生长期的H37Rv加入亚甲兰作为无氧标志，37℃密封培养，无氧状态下生长的H37Rv会随着培养基中的氧气耗尽而进入休眠状态，继续无氧培养1个月的陈旧菌即为休眠菌，取休眠菌，加入适量5个复苏因子蛋白质组合，37℃有氧培养三天，提取RNA。用mRNA纯化试剂盒纯化RNA。利用抑制性消减杂交（SSH）技术分析复苏因子蛋白刺激三天的休眠结核分枝杆菌和对数生长期结核分枝杆菌的基因组mRNA的表达差异。并通过基因克隆技术、基因测序和序列分析，寻找差异表达基因。结果我们通过SSH杂交，以活跃结核分枝杆菌cDNA为Tester的正相杂交和以复苏因子蛋白刺激三天的休眠结核分枝杆菌cDNA为Tester的反相杂交的各自Tester高表达或特异性表达的片段都得到了选择性扩增，杂交产物经连接pTA2载体、转化DH5α、蓝白斑筛选，正相获得78个阳性菌落，反相获得46个阳隆菌落。阳性单个菌落经液体LB培养基培养，以菌液为模板，T7、M13为引物，扩增插入片段，能扩增到明显的带，且带大于350pb的为阳性。则正相得到66个阳性扩增带，反相得到39个阳性扩增带。这105个阳性扩增带的菌液经测序分析，将序列完全相同的特异性序列筛选合并，正相获得41个不同的特异性序列，反相获得32个不同的特异性序列。再去掉因消减杂交不完全而使正、反相中都获得的相同序列，则正相有30个特异性序列，反相有21个特异性序列。51个序列通过Genbank检索，因有不同序列检索得到对应同一基因的情况，因此，正相30个特异性序列经检索后对应22个不同的基因，反相21个特异性序列经检索后对应9个不同的基因。在我们的实验中有2个基因是正、反相共有的（ribosomal RNA 23S rrl和Rv3661）。最后正相获得了20个活跃结核分枝杆菌特异性表达或高表达的功能基因，反相获得了7个休眠结核分枝杆菌特异性表达或高表达的功能基因，根据其功能不同分为8大类。结论利用SSH杂交技术可以筛选到复苏因子蛋白刺激三天的休眠结核分枝杆菌和活跃结核分枝杆菌的差异表达基因。为寻找休眠结核分枝杆菌复苏的关键基因奠定了基础。     

基于基因芯片的miRNA表达差异在结核性脑膜炎与病毒性脑膜炎诊断中的价值

目的: 评价基于基因芯片的miRNA表达差异在结核性脑膜炎(tuberculous meningitis,TBM)与病毒性脑膜炎(viral meningitis,VM)诊断中的价值。方法: 选取2017年12月至2019年9月在首都医科大学附属北京胸科医院和首都医科大学附属北京天坛医院治疗的TBM患者28例和VM患者27例作为验证样本进行实时荧光定量逆转录PCR(qRT-PCR)验证。选取前期收集的8例TBM患者和5例VM患者作为基因芯片样本进行全基因组miRNA微阵列分析,通过预测差异性miRNA的靶基因、基因本体(GO)富集分析、京都基因与基因组百科全书(KEGG)信号通路分析、构建蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络筛选出两病间前10个差异性miRNA枢纽基因。再采用qRT-PCR对患者间表达差异明显的miR-21-5p进行验证,并通过受试者工作特征曲线(ROC)下面积(AUC)分析miRNA的诊断价值。结果: 通过miRNA微阵列分析初步筛选出26个差异表达的miRNA(14个表达上调,12个表达下调)和对应的靶基因3217个。经GO富集分析、KEGG信号通路分析筛选出190个相关靶基因,对其进行PPI网络分析,筛选出前10个靶基因作为核心靶基因。对基因芯片检测样本的hsa-miR-21-5p相对表达量进行qRT-PCR验证,发现TBM患者hsa-miR-21-5p的表达水平[15.890(3.423,25.581)]较VM患者[0.807(0.614,0.955)]明显上调(Z=-2.355,P=0.019),差异倍数(TBM/VM)在基因芯片和qRT-PCR中分别是4.817和4.660,两种检测方法结果基本一致;对28例TBM和27例VM患者的hsa-miR-21-5p进行qRT-PCR结果比较,发现hsa-miR-21-5p在TBM患者的相对表达量为4.825(2.433,21.362),明显高于VM患者[0.204(0.112,0.711)],差异有统计学意义(Z=-5.000,P=0.000),且ROC曲线区分TBM与VM患者的AUC为0.893(0.806~0.980),敏感度为85.7%,特异度为88.9%。结论: 相较于VM患者,作为基因芯片检测中表达差异明显的miR-21-5p在TBM患者中表达明显上调,可作为鉴别TBM与VM的潜在生物标志物。     

应用于结核性胸膜炎分子生物学检测的胸腔积液核酸提取方法初步比较分析北大核心CSCD

目的筛选鉴定有助于结核性胸膜炎分子生物学检测的胸腔积液核酸提取方法。方法收集18例结核性胸膜炎患者胸腔积液样本,分别采用6种方法提取核酸,应用微滴数字PCR技术分析样本中结核分枝杆菌特异性核酸IS6110和IS1081数量,以此评估不同胸腔积液核酸提取方法的优劣。结果对于胸腔积液原液或胸腔积液离心上清,采用柱法和磁珠法提取的核酸样本中靶标数量无明显差别。对于胸腔积液离心沉渣,采用物理破碎法提取的核酸样本中IS6110和IS1081数量显著高于化学破碎法(IS6110,Z=-3.408,P=0.001;IS1081,Z=-3.297,P=0.001)。相比于小体积(0.7 mL)胸腔积液原液直接提取,大体积(4 mL)胸腔积液离心的上清和沉渣(物理破碎)中提取的核酸样本含有更多的靶标数量(分别IS6110,Z=-3.237,P=0.001,IS1081,Z=-2.667,P=0.008;IS6110,Z=-3.157,P=0.002,IS1081,Z=-2.250,P=0.024)。结论大体积胸腔积液离心上清游离核酸提取法和离心沉渣物理破碎核酸提取法能够富集更多的结核分枝杆菌核酸,是较好的用于结核性胸膜炎分子生物学检测的核酸制备方法。     

复苏因子薄层琼脂快速培养法诊断结核性胸膜炎的应用研究

目的 建立胸腔积液结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,M.tb)复苏因子薄层琼脂(Rpfs-TLA)快速培养法并评估其临床应用价值。方法 收集2016年7月至2018年11月北京胸科医院103例结核性胸膜炎和34例其他胸膜疾病患者的胸腔积液,经过离心、消化处理后进行M.tb复苏因子薄层琼脂和普通薄层琼脂培养,比较Rpfs-TLA与普通TLA培养M.tb的阳性率、平均报阳时间、菌落形成单位数的组间差异。结果 胸腔积液Rpfs-TLA培养组和普通TLA对照组M.tb的阳性率分别为43.7%和29.1%,差异有统计学意义(χ²=54.56,P<0.001)。Rpfs-TLA培养显微镜下微菌落与肉眼可视菌落平均报告时间为11.87 d和18.13 d,差异有统计学意义(t=31.82,P<0.001)。Rpfs-TLA与普通TLA培养显微镜下微菌落的平均报告时间为11.87 d 和20.60 d,差异有统计学意义(t=16.62,P<0.001)。Rpfs-TLA诊断结核性胸膜炎的灵敏度为43.7%,特异度为100%,准确度为57.7%。结论 Rpfs-TLA 是一种准确、快速、廉价且易于培养的方法,可为结核性胸膜炎诊断提供帮助。     

涂阳肺结核患者密切接触者结核感染及危险因素分析

目的了解涂阳肺结核患者密切接触者结核感染情况及影响因素。方法采用T-SPOT.TB试剂盒检测与76例涂阳肺结核患者的243例密切接触者结核潜伏感染(LTBI)情况,采用Pearsonχ2检验分析LTBI的影响因素。结果 248例密切接触者中活动性肺结核检出率为2.02%,在243例密切接触者(剔除5例活动性肺结核患者)中T-SPOT.TB的阳性率为46.9%,经单因素分析显示于涂阳肺结核患者确诊前2个月内接触者及夫妻关系的密切接触者,LTBI危险性高,且差异有统计学意——分别为(χ2=6.925,P=0.006)和(χ2=8.447,P=0.038)。结论与涂阳肺结核患者密切接触者较普通人群结核感染发生率高,且不同接触人群LTBI发生比率不同。     

北京市昌平区某高校大学新生结核潜伏感染调查

目的 调查大学新生结核潜伏感染情况,以便采取预防性措施。 方法 2010年10月随机纳入北京市昌平区某高校入学新生TST≥10 mm的健康受试者420例,应用ELISPOT检测经抗原刺激后分泌IFN-γ的效应T淋巴细胞(即斑点形成细胞,SFCs)数量,并对ELISPOT阳性者进行为期3年的结核感染发病情况监测。 结果 ELISPOT检测LTBI总的阳性率为41.2%,在BCG接种(阳性率41.5%)和未接种(阳性率40.0%)中差异无统计学意义(χ²=0.064, P=0.447),在TST直径10~14、15~19和≥20 mm组间(37.6%、45.4%和64.3%)差异有统计学意义(χ²=8.408, P=0.015),173例未治疗的 ELISPOT+/TST+者经3年的ATB监测,发病率为0。 结论 北京市昌平区某高校大学新生LTBI比率高,但仅以ELISPOT和TST双阳性者为预防性治疗指标,尚不足够。     

结核分枝杆菌glcB基因原核表达质粒的构建、表达和纯化

目的构建结核分枝杆菌glcB基因原核表达工程株,并进行表达、纯化。方法用PCR 扩增结核分枝杆菌glcB基因, 并克隆入pTA2质粒。测序正确后, 再亚克隆入pET30a(+)质粒, 构建pET30a(+):glcB重组体,转化宿主菌大肠埃希菌BL21 (DE3)。结果结核分枝杆菌glcB基因工程株经0.4mM异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导后,表达出相对分子质量为92kD重组蛋白。SDS-PAGE 分析显示,IPTG诱导4h重组蛋白的表达量最高。表达蛋白以包涵体形式存在于胞质中, 表达量占全菌蛋白质的50％。经Ni-NTA 柱纯化,获得纯度为90%的重组蛋白。结论成功地构建了结核分枝杆菌glcB基因工程表达株,并获得GlcB重组蛋白, 为研究新型血清学诊断活动性结核病奠定了基础。