微血管内皮细胞的分离、纯化和功能特性

近年来的研究表明,微血管内皮细胞在形态、表型和功能等方面都不同于大血管内皮细胞,因此,采用微血管内皮细胞,而不是脐静脉内皮细胞来研究发生于组织器官水平的病变已经成为一种共识。然而,由于细胞分离培养技术的限制,微血管内皮的研究在我国还是一个薄弱的研究领域。近年来随着微血管内皮细胞分离、纯化、培养技术的提高,各种不同组织器官的微血管内皮细胞相继培养成功。利用体外培养的微血管内皮细胞作为细胞模型来研究各种疾病的发病机制已经成为医学研究的重要手段。本文回顾了近年来的相关文献,就微血管内皮细胞的分离培养、鉴定及不同组织器官微血管内皮细胞的功能特性作一简要综述。     

人肾上腺微血管内皮细胞的形态、表型和功能特性

目的 研究人肾上腺微血管内皮细胞的表型和功能特性。方法 用亚细胞克隆法分离和纯化人肾上腺微血管内皮细胞;流式细胞术检测内皮细胞标志血管性血友病因子（vWF）和CD31的表达、低密度脂蛋白的摄取和细胞的表型;扫描电子显微镜检查细胞表面的微绒毛和窗孔样结构;RT—PCR和免疫细胞化学法检测细胞内源性血管内皮细胞生长因子（VEGF）的表达,并比较各种不同器官微血管内皮细胞对肾上腺糖皮质激素诱导细胞毒的敏感性。结果 人肾上腺微血管内皮细胞表达经典内皮细胞标志vWF和CD31,并摄取低密度脂蛋白;同时表达α-1抗胰蛋白酶、肿瘤坏死因子受体（TNFR）p55和细胞间黏附分子-1。扫描电子显微镜显示细胞表面存在大量微绒毛和窗孔样结构。RT-PCR显示人肾上腺微血管内皮细胞高表达VEGF mRNA,免疫细胞化学法显示其细胞内高表达VEGF。对肾上腺皮质激素诱导的细胞毒性反应中,人脑微血管内皮细胞最敏感,人肺和肝窦内皮细胞次之,而人肾上腺微血管内皮细胞表现高度抵抗。结论 人肾上腺微血管内皮细胞是特殊分化的,具有不同于其他器官组织内皮细胞的表型和功能特性。     

小鼠脑血管内皮细胞的分离和培养

目的 探讨鼠脑微血管内皮细胞的体外培养方法并进行形态学和功能学的研究。方法 取新生小鼠脑组织，采用胶原酶消化、差速离心、滤过分离等技术．进行原代培养；待细胞贴满瓶底时．进行传代培养。取原代和传代细胞各6孔，吸取培养上清液，用放免法和化学法测定ET和NO的含量。结果 经ⅧF：Ag免疫组化和细胞形态鉴定．证明培养的是血管内皮细胞．并且培养的脑微血管内皮细胞能合成和分泌ET和N()。结论采用胶原酶消化、差速离心、滤过分离等技术是获取内皮细胞的可靠方法，这为脑血管疾病的研究提供有用工具。     

人腹膜微血管内皮细胞的原代培养

目的分离和培养人腹膜微血管内皮细胞。方法取非炎症且非转移性肿瘤患者施行腹部外科手术的大网膜组织,经Ⅰ型胶原酶消化,两次筛网过滤、离心等步骤获取人微血管段,接种24 h待内皮细胞从微血管段爬出贴壁后,去除微血管段获得内皮细胞进行传代培养。组织形态学观察及免疫组化法鉴定所培养的细胞。结果运用此法进行的原代培养,血细胞在换液和传代过程中被去除,成纤维细胞污染被减至最少;组织形态学观察显示内皮细胞呈铺路石样生长,免疫组化鉴定表明Ⅷ因子阳性;证实所培养的细胞为人腹膜微血管内皮细胞,其纯度较高,生长状态良好。结论实验成功分离和培养了人腹膜微血管内皮细胞,为体外研究腹膜透析的病理生理学改变,提供了细胞来源。     

人腹膜微血管内皮细胞的原代培养

目的 分离和培养人腹膜微血管内皮细胞.方法 取非炎症且非转移性肿瘤患者施行腹部外科手术的大网膜组织,经Ⅰ型胶原酶消化,两次筛网过滤、离心等步骤获取人微血管段,接种24 h待内皮细胞从微血管段爬出贴壁后,去除微血管段获得内皮细胞进行传代培养.组织形态学观察及免疫组化法鉴定所培养的细胞.结果 运用此法进行的原代培养,血细胞在换液和传代过程中被去除,成纤维细胞污染被减至最少;组织形态学观察显示内皮细胞呈铺路石样生长,免疫组化鉴定表明Ⅷ因子阳性;证实所培养的细胞为人腹膜微血管内皮细胞,其纯度较高,生长状态良好.结论 实验成功分离和培养了人腹膜微血管内皮细胞,为体外研究腹膜透析的病理生理学改变,提供了细胞来源.     

严重急性呼吸综合征病毒相关受体在不同器官组织微血管内皮细胞的表达

目的研究严重急性呼吸综合征（SARS）冠状病毒（CoV）相关受体血管紧张素转换酶2（ACE2）和CD209L在人8种不同器官组织微血管内皮细胞上的表达,分析两种受体表达水平与SARS器官病变之间的相关性。方法应用反转录聚合酶链式反应（RT—PCR）、Western印迹、免疫细胞化学3种方法分析比较SARS—CoV相关受体,ACE2、CD209L在人8种不同器官组织微血管内皮细胞上的表达。结果人的各种器官组织的血管内皮细胞均表达SARS—CoV相关受体ACE2与CD209L,其中ACE2在肺微血管内皮细胞表达最高,在淋巴内皮细胞表达最低,而CD209L在淋巴内皮细胞表达相对较高。结论人的微血管内皮细胞是SARS-CoV作用的重要靶点,肺微血管内皮细胞和淋巴内皮细胞的损伤可能分别由两种不同的SARS—CoV受体介导。     

改良豚鼠耳蜗微血管内皮细胞的分离与体外培养

目的 探寻耳蜗微血管内皮细胞的分离与体外培养新方法。方法 选取豚鼠4只，无菌条件下分离其耳蜗血管纹和螺旋韧带，37℃下，Ⅳ型胶原酶(0．5mg／ml)消化3h，将消化获得的细胞接种后用内皮细胞条件培养液进行培养，反复刮除杂细胞。用ABC免疫酶染色法检测Ⅷ因子相关抗原来鉴定培养的内皮细胞，设阳性对照、阴性对照和空白对照。结果 所培养的耳蜗微血管内皮细胞纯度极高，胞浆内均含有内皮细胞特有的Ⅷ因子相关抗原。结论 本实验培养获得了纯净的耳蜗微血管内皮细胞，其方法简便、可操作性强，为血迷路屏障的体外研究奠定了坚实的基础。     

组织块法培养原代肺微血管内皮细胞的技术及经验体会

血管内皮细胞是组成所有血管内表皮的连续单层细胞，在血管功能调节及心血管疾病的发生发展中起着重要作用，陈思峰建立的组织块法培养肺微血管内皮细胞避免了化学和机械的损伤，使用体外培养的内皮细胞来研究许多疾病的病理生理过程的实验更加准确可靠。但国内目前掌握这种技术方法的人很少，再将用此方法培养肺微血管内皮细胞成功的经验体会总结一下。     

不同细胞密度对小鼠心肌微血管内皮细胞小管生成的影响

目的 探讨小鼠心肌微血管内皮细胞的体外小管生成实验的最佳细胞浓度，从而为心脏微血管的研究提供体外实验模型。方法 组织块贴壁法培养小鼠心肌微血管内皮细胞，将小鼠心肌微血管内皮细胞分成5×103个/孔、1×104个/孔、2×104个/孔、3×104个/孔4组，并接种至Matrigel胶包被的48孔板中，细胞接种后24 h在倒置显微镜下观察拍照，并用Image J软件对形成的管腔数量、分支数量进行统计，统计结果用（x-〗±s)表示，数据采用SPSS 17.0软件分析。结果 组织块贴壁法可成功培养小鼠心肌微血管内皮细胞，分离培养的小鼠心肌微血管内皮细胞vWF相关抗原阳性表达。细胞密度为5×103个/孔时无管腔样结构生成，当细胞浓度为1×104个/孔、2×104个/孔、3×104个/孔时可有管腔样结构生成。细胞浓度为2×104个/孔时形成的管腔数量及分支数量高于1×104个/孔、3×104个/孔（P＜0.05）。 结论 分离培养的小鼠心肌微血管内皮细胞具有血管形成能力。在一定的细胞接种浓度范围内，接种的细胞密度越大，体外血管形成能力增强，但细胞浓度超过血管形成的最佳浓度后，随着接种细胞浓度的增大，小鼠心肌微血管内皮细胞的体外血管形成能力减弱。     

糖尿病微血管病变临床病理研究探讨

糖尿病是一种慢性代谢障碍性疾病，随着发病率的逐年增高，已成为人类健康的主要威胁。糖尿病微血管病变是糖尿病最为常见和最严重的慢性并发症，是一组以微血管结构和功能改变为特征的病变，主要表现为糖尿病肾病、糖尿病视网膜病变、糖尿病外周神经病变（DPN）、糖尿病心肌病变（DCM）等。微血管结构的病理改变主要表现为基底膜增厚。周细胞丢失，以及继发的血管内皮细胞增生和功能紊乱。然而不同的靶组织损伤特点及部位亦不完全相同。视网膜的血管内皮细胞、肾小球的系膜细胞、外周神经的神经节细胞和施万细胞似乎更易受到损害。现对糖尿病微血管病变的病理研究情况综述如下。     

豚鼠耳蜗微血管内皮细胞的分离培养与鉴定

目的：建立稳定可靠的耳蜗微血管内皮细胞分离培养方法。方法：采用 显微解剖法分离出耳蜗血管纹,组织块培养法进行体外培养。结果：按种后2d,部分组织块边缘有散在的细胞生长,之后细胞数逐渐增多,10d左右以组织块为中心可见成片细胞组成的细胞集落。倒置显微镜下,单个培养细胞多呈长梭形,而融合成片状单层的培养细胞排列紧密,有内皮细胞培养时典型的“铺路石样”外观。经纯化后,95％以上的培养细胞第VIII因子相关抗原显示阳性反应。结论：本研究方法能够获取体外培养的耳蜗微血管内皮细胞。     

人非小细胞肺癌血管内皮细胞的分离培养及鉴定

目的:建立人非小细胞肺癌血管内皮细胞体外分离培养体系,研究其体外生长特性。方法:利用酶消化法分离出肺癌组织微血管片段,采用植块培养法培养原代内皮细胞,先后以局部消化法和差速黏附法进行纯化;应用光镜、免疫细胞化学及免疫荧光技术对所获得的人肺癌血管内皮细胞进行鉴定。结果:所获人非小细胞肺癌血管内皮细胞呈FⅧ-RAg、CD34阳性;电镜下生长状态良好、可传代培养。结论:本研究摸索并建立了人非小细胞肺癌血管内皮细胞的分离培养方法,所获人非小细胞肺癌血管内皮细胞对肿瘤血管生成及抗肿瘤药物的研究具有重要价值。     

大鼠脑微血管内皮细胞的原代培养与鉴定

目的探讨大鼠脑微血管内皮细胞培养方法。方法 5～7 d龄SD大鼠脑皮质用胶原酶消化得到脑微血管段后,接种于培养瓶进行原代培养。培养的细胞采用倒置显微镜进行形态学观察,免疫荧光法鉴定Ⅷ因子相关抗原,MTT法测定细胞活力。结果倒置显微镜下细胞呈单层＂铺路石样＂排列的典型特征;Ⅷ因子相关抗原免疫荧光检测得阳性细胞率达95%;MTT法测定结果显示第120 h细胞活力最强。结论该培养方法能成功地分离并培养出纯度较高的大鼠脑微血管内皮细胞,对更深入地研究脑微血管内皮细胞的生物学特性及功能具有重要意义。     

血管抑素体外对兔视网膜微血管内皮细胞增生的抑制

目的 观察血管抑素对体外培养的兔视网膜微血管内皮细胞生长的抑制作用及对细胞外信号调节蛋白激酶1(ERK-1)活化的影响。方法 利用L-Lysine耦联的Sepharose 4B亲和层析柱从血浆中分离和纯化血管抑素。原代培养兔视网膜微血管内皮细胞，MTT法检测不同浓度的血管抑素对其生长的抑制作用，Western blot检测血管抑素对血管内皮细胞生长因子刺激的视网膜微血管内皮细胞ERK-1水平的影响。结果 血管抑素在体外能显著抑制视网膜微血管内皮细胞增生，其ED50约为160μg／ml。VEGF刺激兔视网膜微血管内皮细胞后，ERK-1被迅速激活，而血管抑素能使其表达量降低35．6％。结论 血管抑素有望成为极有临床价值的防治视网膜新生血管形成的新药。     

大鼠脑微血管内皮细胞的原代培养

目的分离、培养原代脑微血管内皮细胞,建立体外血脑屏障模型。同时探索高纯度、活性好的脑微血管内皮细胞的分离培养方法。方法取3周大鼠大脑,分离皮质,经过匀浆、葡聚糖离心以及消化后,取纯度较高的脑微血管段种植于胶原蛋白包被过的塑料培养瓶中进行培养。显微镜观察及检测Ⅷ因子相关抗原。结果镜下细胞呈长梭形,7d左右细胞可融合,Ⅷ因子相关抗原免疫组化检测为阳性,且阳性细胞占绝大部分。结论本实验成功分离大鼠脑微血管内皮细胞,并进行原代培养,为脑微血管内皮细胞的进一步研究提供了模型,也为构建更高级的大鼠体外血脑屏障奠定基础。     

细胞三维培养的研究进展

近年来，三维培养技术逐渐成为细胞培养领域研究的热点，其利用各种方法及材料，使细胞呈空间立体方式生长，使其更接近于体内生长模式，形成类似体内组织的结构，发挥其功能。由于该项技术既有利于诱导各类细胞的分化定向及分化后表型的维持和增殖，又有望在体外构建与各类组织、器官相应的细胞三维生长类似物或等同物，因此，细胞三维培养技术对组织工程学和临床应用都有重要意义。现就三维培养技术的研究进展作一综述。     

大鼠脑微血管内皮细胞的培养

血管内皮细胞在动脉粥样硬化的发病机制中发挥重要作用。本文通过胶原酶消化、密度梯度离心等技术建立一种程序简便、经济、稳定、获得细胞纯度较高的体外分离、长期培养大鼠脑微血管内皮细胞的方法。     

大鼠脑微血管内皮细胞的培养与鉴定

目的:探讨大鼠脑微血管内皮细胞体外培养方法,为血管内皮细胞的研究打下基础.方法:用胶原酶消化大鼠脑皮质制成细胞悬液再进行培养;用光镜、电镜及免疫组化检测进行鉴定.结果:分离的大鼠脑微血管内皮细胞体外培养一周左右可长成单层,光镜下为多角形或扁平梭形,呈"铺路石样"排列,透射电镜可见Weibel-Palade小体.第Ⅷ因子相关抗原免疫组化测定阳性.结论:该分离细胞培养法可培养出大鼠的脑微血管内皮细胞.     

高糖对牛视网膜微血管内皮细胞损伤的实验研究

目的　利用体外培养的牛视网膜微血管内皮细胞来观测高浓度葡萄糖在细胞的损伤中所起的作用。方法体外培养牛视网膜微血管内皮细胞。通过MTT (四唑氮盐 )法及3 H -TDR掺入法研究高糖对牛视网膜微血管内皮细胞的损伤作用。结果　内皮细胞在含高糖 (2 8、 4 0mmol/L)DMEM培养基及不同培养时间 (2d、 7d)下MTT测定结果与对照组 (生理浓度葡萄糖 ,5 5mmol/L)比较有显著性差异P <0 0 5 ,3 H -TDR掺入法研究结果显示高糖对视网膜微血管内皮细胞的增殖有明显抑制作用 ,亦呈剂量及时间依赖性损伤细胞。结论　高浓度葡萄糖对牛视网膜微血管内皮细胞有显著的损伤作用     

大鼠脑微血管内皮细胞的培养与鉴定

目的探讨大鼠脑微血管内皮细胞体外培养方法,为血管内皮细胞的研究打下基础。方法用胶原酶消化大鼠脑皮质制成细胞悬液再进行培养,用光镜及免疫组织化学检测进行鉴定。结果分离的大鼠脑微血管内皮细胞体外培养5～7d左右可长成单层,光镜下为多角形或扁平梭形,呈"铺路石样"排列,第Ⅷ因子相关抗原免疫组织化学测定阳性。结论该分离细胞培养法可培养出大鼠的脑微血管内皮细胞。