双向电泳技术分析大鼠快慢肌蛋白的表达差异

目的：建立骨骼肌蛋白分离的双向电泳（2-DE）技术体系，分析趾长伸肌与比目鱼肌中快慢肌蛋白的表达。方法：提取大鼠趾长伸肌和比目鱼肌的总蛋白，定量，然后进行第一向等电聚焦0EF）和第二向十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）技术分离总蛋白，GS-800获得凝胶图像，并测量不同凝胶间蛋白斑点在IEF和SDS-PAGE方向上的位置偏差，使用PDQuest7．3软件对凝胶图像进行分析，找出趾长伸肌与比目鱼肌蛋白表达的差异。结果：在趾长伸肌和比目鱼肌组织的蛋白表达谱上，分别检测到680±19和660±27个蛋白点，平均匹配点数为590±13和580±17，匹配率达86．7％和87．8％，不同凝胶间蛋白质点在IEF方向的偏差为（0．51±0．48）mm，在SDS-PAGE方向上的偏差为（0．53±0．42）mm，对比分析趾长伸肌和比目鱼肌组织的2-DE图谱，发现有27个点存在明显的表达差异，在比目鱼肌中高表达的点有12个，在趾长伸肌中高表达的点有15个。结论：建立了骨骼肌蛋白分离的双向电泳技术体系，发现成年大鼠趾长伸肌和比目鱼肌的双向电泳图谱相似，但是有部分蛋白质点存在表达差异．这些差异表达的蛋白，可能与快慢肌本身的生理特性相关。     

大鼠星形胶质细胞与C6胶质瘤细胞的蛋白质组学分析

目的探讨星形胶质瘤细胞与星形胶质细胞间的蛋白谱变化。方法选择星形细胞来源的C6胶质瘤细胞和体外培养纯化大鼠皮层的星形胶质细胞进行蛋白组学分析。星形细胞和C6细胞双向凝胶电泳（2-DE）的凝胶图像用PDQuest软件比较,差异蛋白质点进行基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）和生物信息分析,部分蛋白质的差异表达结果用半定量逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）验证。结果获得了24个有明显表达变化的蛋白点;17个蛋白质得到质谱结果,与星形胶质细胞相比,经生物信息学分析确认的6个蛋白质中,磷酸甘油酸变位酶1、生物转化酶、谷胱甘肽S-转移酶P、钙网织蛋白和膜联蛋白A2在C6细胞中表达量较高,而波形蛋白和肌动蛋白γ-肌动蛋白在C6细胞中表达量较低。磷酸甘油酸变位酶1、膜联蛋白A2和波形蛋白经半定量RT-PCR验证与2-DE结果相符。结论本研究发现的差异表达蛋白质与许多重要的细胞生理活动和功能有密切关系,包括无氧酵解过程、细胞骨架组装、生物转化和信号转导,可能与胶质瘤的生长迅速、浸润迁移和抗药性相关。     

层粘连蛋白受体与配体在C6胶质瘤细胞中的表达及意义

目的 检测层粘连蛋白受体与配体在C6胶质瘤细胞中的表达水平，探讨两者在胶质瘤细胞侵袭性生长和诱导神经干细胞迁移中的意义。方法 从新生3～5d的SD大鼠大脑皮层中分离和培养星形胶质细胞为对照，同时培养C6胶质瘤细胞。采用半定量RT—PCR方法分析层粘连蛋白受体和配体mRNA在星形胶质细胞和C6胶质瘤细胞中表达的差异。结果 星形胶质细胞和C6胶质瘤细胞中均表达层粘连蛋白受体和配体mRNA，而C6胶质瘤细胞呈明显高表达（P〈0．05，P〈0．01）。结论 C6胶质瘤细胞中表达上调的层粘连蛋白受体和配体可能是胶质瘤细胞侵袭性生长和诱导神经干细胞迁移的因素之一。     

双向电泳分析失神经支配大鼠腓肠肌蛋白的表达变化

目的:建立骨骼肌蛋白分离的双向电泳(2-DE)技术体系,寻找失神经支配骨骼肌与正常骨骼肌蛋白的表达差异。方法:建立失神经腓肠肌模型,提取腓肠肌总蛋白,进行第一向等电聚焦(IEF)和第二向十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)技术分离总蛋白,使用PDQuest软件对凝胶图像进行分析,并测量了凝胶蛋白斑点在IEF和SDS-PAGE方向上的位置偏差。结果:失神经组和正常组腓肠肌组织3块凝胶的平均蛋白质点数分别为560±16和545±13,平均匹配点数分别为471±19和447±17,匹配率达84.1%和82.1%。对比分析了两种腓肠肌组织的双向电泳图谱发现,平均匹配点数为445±8;发现在失神经支配后有80个点发生了明显而稳定的质和量(大于10倍或小于0.1倍)的改变。不同凝胶间蛋白质点在IEF方向的偏差为(1.203±0.763)mm,在SDS-PAGE方向上的偏差为(1.062±0.529)mm。结论:失神经组和正常组腓肠肌的双向电泳图谱存在明显差异,失神经后表达下调的蛋白可能与维持肌肉正常功能相关,而表达上调的蛋白则可能与肌萎缩的发生过程相关。     

BMECs经TCM和ACM条件培养Caveolin-1的表达对比及其机制的探讨

目的探讨Caveolin-1在大鼠C6胶质瘤细胞件培养液（TCM）和星形胶质细胞条件培养液（ACM）条件培养对脑血管内皮细胞（BMECs）表达的关系。方法对BMECs进行原代培养，以TCM进行培养，以ACM进行培养作为对照，进行免疫荧光染色和Western blot检测Caveolin-1表达情况。结果免疫荧光显示BMECs中Caveolin-1的表达定位于细胞浆，实验组染色强度高于对照组；Western blot蛋白测定结果显示实验组的IDV灰度值为60831±2865.197，明显高于对照组的IDV灰度值18645±3607.659，差异有统计学意义（P＜0.05）。结论 Caveolin-1在TCM培养BMECs细胞中高表达，验证了组织微环境改变可以引起周围血管内皮细胞表型改变这一假设，为胶质瘤靶向治疗载体的选择上提供了一定的理论依据。     

C6胶质瘤细胞培养上清诱导神经干细胞迁移的初步研究

目的:观察体外培养的胶质瘤细胞在体外能否引起神经干细胞的迁移,从而为研究胶质瘤细胞中存在促进神经干细胞迁移的物质打下基础。方法:分别培养神经干细胞、星形胶质细胞和C6胶质瘤细胞。以星形胶质细胞为对照,做细胞迁移实验,观察其结果;将C6胶质瘤细胞、星形胶质细胞的无血清培养上清分别浓缩,并行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,观察其结果。结果:(1)C6胶质瘤细胞的培养上清引起神经干细胞迁移的数目明显多于星形胶质细胞的培养上清和新鲜无血清培养基(P<0.01);(2)将无血清培养的等浓度的C6胶质瘤细胞、星形胶质细胞的上清浓缩蛋白电泳,可见二者蛋白条带存在明显差异。结论:(1)从新生大鼠大脑皮层组织可以培养出神经干细胞和星形胶质细胞。(2)C6胶质瘤细胞无血清培养的上清中存在着能够诱导神经干细胞迁移的物质。     

C6胶质瘤细胞对体外共培养大鼠神经干细胞增殖影响的初步研究

目的探索与C6胶质瘤细胞体外共培养后大鼠神经干细胞（Neural Stem Cells NSCs）的增殖变化。方法分别培养神经干细胞、星形胶质细胞和C6胶质瘤细胞。利用共培养池（cell culturetranswell inserts）建立两种细胞的体外共培养模型。应用相差显微镜及电镜观察各组共培养后NSCs的形态变化;共培养后NSCs MTT法作生长曲线。结果原代培养后获得神经干细胞及星形胶质细胞;与C6胶质瘤细胞共培养7天后的NSCs增殖较对照组快,电镜观察可见核质比增高,细胞器较发达。结论 C6胶质瘤细胞对体外共培养的大鼠NSCs的增殖有一定促进作用。     

水通道蛋白1、4在培养大鼠星形胶质细胞、BT325细胞及人脑胶质瘤组织中的表达

目的 水通道蛋白作为细胞膜特异性水转运蛋白在脑内分布广泛,参与脑内水平衡调节,与脑肿瘤、脑创伤等多种疾病导致的脑水肿有关.本实验主要研究水通道蛋白1、4在培养大鼠星形胶质细胞、人多形性胶质母细胞瘤系BT325细胞及人脑胶质瘤组织中的表达情况.方法 应用胶质纤维酸性蛋白(GFAP)免疫细胞化学染色鉴定培养大鼠星形胶质细胞及BT325细胞.应用反转录PCR法检测GFAP、AQP1及AQP4在不同组织细胞中的表达.结果 实验中培养大鼠星形胶质细胞及BT325细胞GFAP免疫细胞化学染色阳性.体外培养大鼠星形胶质细胞、人胶质母细胞瘤组织及对照组标本均有GFAP表达,同时也有AQP1及AQP4表达.BT325细胞只有GFAP表达,无AQP1及AQP4表达.结论 AQP1、4在培养大鼠星形胶质细胞及胶质瘤组织中均有表达,可能对脑功能的维持及肿瘤性脑水肿的发生、消散有重要影响.     

正常大鼠脊髓蛋白质组学实验研究

目的调整和优化实验条件,建立正常大鼠脊髓蛋白组学双向电泳体系。方法取正常大鼠腰部脊髓,运用BIO-RAD PROTEAN IEF Cell加垂直SDS-PAGE BIO-RAD PROTEANRⅡXi Cell,进行等电聚焦(IEF)和聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。结果采用不同的聚焦条件,获得了较清晰的大鼠脊髓蛋白质2-DE谱。根据标准蛋白的回归方程,在正常脊髓的2-DE图中,清晰获得大约800多个蛋白点的等电点和分子量信息。结论在大鼠脊髓蛋白组学双向电泳过程中,样品的制备和实验条件得到进一步优化。初步获得正常大鼠脊髓蛋白组学信息。     

桩蛋白在大鼠星形胶质细胞中的表达

目的：初步探讨桩蛋白（paxillin）在大鼠星形胶质细胞及神经元中的表达。方法：通过组织切片、细胞培养、免疫荧光和RT-PCR方法,观察桩蛋白在大脑皮层及体外培养的星形胶质细胞以及神经元中的表达。结果：桩蛋白在大鼠脑皮质的星形胶质细胞中表达,神经元未见明显表达;在体外培养的星形胶质细胞以及神经元中的表达情况与体内一致,主要表达于星形胶质细胞的胞浆及突起中。结论：桩蛋白主要表达于星形胶质细胞而非神经元中。本实验结果为进一步研究桩蛋白在星形胶质细胞中的生物学作用奠定了基础。     

鼻息肉的2-DE图谱建立和蛋白质组学分析

目的:建立鼻息肉及鼻黏膜双向凝胶电泳(two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis,2-DE)图谱,鉴定差异表达蛋白质。方法:收集鼻息肉及鼻黏膜样本各7例,采用固相pH梯度2-DE,凝胶银染,扫描图像,ImageMaster2-DE软件比较分析等方法,识别差异表达蛋白质,通过质谱分析得到相应肽质指纹图谱(peptide mass fingerprint,PMF),采用PeptIdent软件查询Swiss-Protand TreMBL数据库,鉴定差异表达蛋白质。结果:建立了鼻息肉和鼻黏膜蛋白质的2-DE图谱。鼻息肉和鼻黏膜3块凝胶的平均蛋白质点数分别为825±78和936±62;平均匹配点数为682±96和821±78,匹配百分率为82.7%和87.7%;同一鼻息肉的3块胶在蛋白质点位置上有较好的重复性,不同胶间蛋白质点在等电聚焦(IEF)方向偏差为(1.06±0.14)mm,在SDS-PAGE方向偏差为(1.45±0.21)mm。比较分析两种组织各7例样本的2-DE图谱,鼻息肉和鼻黏膜蛋白质点数为1458个和1617个,平均匹配点数为1026个。质谱分析差异蛋白质点40个,获取34张PMF,查询数据库鉴定出蛋白质24个。结论:建立了分辨率高和重复性好的鼻息肉及鼻黏膜2-DE图谱,识别鉴定出一些与鼻息肉病变相关的蛋白质。     

两种样品制备方法对血清蛋白质双向凝胶电泳分离效果的影响

目的 评价两种样品制备方法对血清蛋白质双向凝胶电泳(2-DE)分离效果的影响,建立高分辨率、高重复性的血清2-DE图谱,为鉴定疾病相关血清蛋白质奠定基础.方法 分别用热SDS法和直接溶解法处理大肠癌血清样品,采用固相pH梯度双向凝胶电泳技术分离总蛋白质,图像软件分析后,对其中3个差异蛋白质点行基质辅助激光解吸电离/飞行时间质谱鉴定.结果 应用热SDS法处理血清总蛋白质进行双向电泳,可获得分辨率高、重复性好的人血清双向电泳图谱.对直接溶解和热SDS法处理的蛋白样品进行3次重复性检测,凝胶的平均蛋白质点数为675±46和702±49,平均匹配点数为573±42和623±52,匹配率为85.3%和89.6%,分析3块不同胶间蛋白质点在IEF方向的位置偏差为(0.85±0.30)mm和(0.81±0.28)mm,在SDS-PAGE方向上的偏差为(1.02±0.18)mm和(0.97±0.12)mm.热SDS处理的2-DE胶蛋白质点质谱可获得高质量质谱图,并可以检测到相对低丰度的血清蛋白质.结论 热SDS法是一种更有效的血清蛋白质样品制备方法,我们利用热SDS法处理血清样品建立了分辨率较高且重复性好的人血清蛋白质双向凝胶电泳图谱.     

侵袭性与非侵袭性垂体腺瘤的蛋白质差异表达谱的建立

目的：建立分辨率高和重复性好的侵袭性与非侵袭性垂体腺瘤的双向凝胶电泳图谱 ,并识别鉴定出其差异表达的蛋白质。方法： 利用固相 pH梯度双向凝胶电泳分离侵袭性与非侵袭性垂体腺瘤的总蛋白质,凝胶经银染显色后,运用ImageMaster 2D图像分析软件进行比较分析、识别差异表达的蛋白质,应用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱 (MALDI-TOF-MS)及数据库搜索鉴定部分差异蛋白质点。结果：得到了分辨率较高、重复性较好的侵袭性与非侵袭性垂体腺瘤的双向凝胶电泳图谱,将同一侵袭性垂体腺瘤组织和非侵袭性肿瘤组织分别进行了3次双向凝胶电泳,3块凝胶的蛋白质点数分别为1 080±24和1 035±28,匹配点数分别为975±45和918±56,匹配率分别达90.3％和88.7％。同一组织的3块胶在蛋白质点位置上有较好的重复性 ,不同胶间蛋白质点在等电聚焦(IEF)方向的偏差是(1.563±0.259) mm,在十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)方向上的偏差为(1.088±0.206) mm。比较分析侵袭性垂体腺瘤和非侵袭性垂体腺瘤凝的双向凝胶电泳图谱,发现两者间的99个表达有明显差异的蛋白质点。初步对其中30个差异蛋白质点进行了肽质量指纹图分析,鉴定出一些与细胞周期调控、信号转导等有关的蛋白质。 结论：建立了分辨率较高且重复性较好的侵袭性与非侵袭性垂体腺瘤的双向凝胶电泳图谱,并识别鉴定出一些侵袭性与非侵袭性垂体腺瘤之间差异表达的蛋白质,为进一步筛选侵袭性垂体腺瘤的蛋白质表达数据库提供了基础。     

人支气管上皮蛋白质样品制备方法及其癌变各阶段组织2-DE图谱的建立

目的： 改良、优化支气管上皮组织的蛋白质样品制备方法,建立人支气管上皮癌变过程各阶段组织的2-DE图谱,为识别鉴定肺鳞癌癌变相关蛋白质奠定基础。方法：收集、筛选人支气管正常上皮、鳞状化生、不典型增生和上皮浸润癌组织标本。改良的脱氧胆酸-三氯醋酸(deoxycholate-trichloroaetic acid,DOC-TCA)法提纯支气管上皮总蛋白质,应用固相pH梯度双向凝胶电泳分离各阶段组织的总蛋白质,凝胶经银染显色后,用ImageMaster 2D软件分析双向电泳图谱。结果：应用改良的DOC-TCA法提纯的支气管上皮总蛋白质进行双向电泳,可获得分辨率高、重复性好的人支气管上皮组织的双向电泳图谱。正常上皮、鳞状化生、不典型增生和浸润癌4种组织凝胶的蛋白质点数依次为1 190±63,1 227±69,1 272±71,1 326±82。选取同例鳞状上皮化生组织进行3次重复性检测,3块凝胶的平均蛋白质点数为1 216 ±75 ,平均匹配点数为1 082±67,匹配率达 89.3% , 且3块胶在蛋白质点位置上有较好的重复性,不同胶间蛋白质点在IEF方向的偏差为（0.835±0.247） mm ,在SDS-PAGE方向上的偏差为（0.921±0.104） mm。结论：改良的DOC-TCA沉淀法是一种较好的支气管上皮组织蛋白质样品制备法,初步建立了分辨率较高且重复性好的人支气管上皮癌变各阶段组织的双向凝胶电泳图谱。     

脑脊液双向电泳技术体系的建立

目的:建立用于脑脊液(CSF)蛋白分离的双向电泳(2-DE)技术体系,寻找多发性硬化患者和对照组脑脊液蛋白质差异,从分子水平探讨多发性硬化患者脑脊液蛋白整体变化规律。方法:分别取对照组及多发性硬化患者的脑脊液,用三氯乙酸(TCA)沉淀蛋白质后,加入适量裂解液使蛋白质充分裂解,离心后取上清液上样。进行第1向等电聚焦(IEF)电泳和第2向十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),染色脱色后,分析所得蛋白质斑点。结果:对照组和多发性硬化患者脑脊液2-DE图谱上均可得到近200个蛋白质斑点,其中2个蛋白质在多发性硬化患者脑脊液中含量增加,4个蛋白质在多发性硬化患者脑脊液中含量减少,12个蛋白质斑点为多发性硬化患者脑脊液特有。结论:对照组和多发性硬化患者脑脊液的双向电泳图谱存在明显差别,这些发现可为研究多发性硬化疾病机制提供线索。     

血清双向凝胶电泳体系的建立

目的:建立血清双向凝胶电泳(two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis,2-DE)技术体系.方法:用Proteoprep blue albumin depletion kit将血清中高峰度蛋白去除.预冷丙酮沉淀蛋白质后,加入样品溶解液充分溶解,进行等电聚焦电泳(isoelectric focusing,IEF)和十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel elecrophoresis,SDS-PAGE),行硝酸银染色后,运用ImageMaster软件行初步分析.结果:通过调整,优化2-DE技术条件,建立了稳定的2-DE技术.结论:建立了相对稳定的人血清蛋白质2-DE技术,其稳定性、重复性好,为开展疾病蛋白质组学的研究奠定了基础.