腺病毒携带EB病毒LMP1反义基因抑制人鼻咽癌细胞的生长

[[摘要] 目的 研究EB病毒LMP1反义基因对人鼻咽癌CNE2细胞恶性表型的逆转作用。方法 用反义LMP1DNA的腺病毒载体AdEasy -GFP-ALMP1转染人鼻咽癌细胞CNE2,Western2blot法检测转染前、后瘤细胞的LMP1表达;用MTT法和细胞生长曲线实验观察转染前后细胞体外生长增殖特性。结果 建立反义CNE2细胞;转染后LMP1蛋白表达降低;转染后细胞活力和生长速度均有下降。结论 将反义LMP1腺病毒载体导入细胞能成功抑制CNE2细胞的生长,逆转其恶性表型。本研究还为鼻咽癌的基因治疗提供了实验依据。 [关键词] EB病毒 反义LMP1基因 鼻咽肿瘤 基因治疗     

EBV反义LMP-1转染CNE2细胞对裸鼠致瘤的作用

目的：研究反义LMP1基因转染CNE2细胞对裸鼠的成瘤作用。方法：用反义LMP1转染的CNE2细胞、空载体转染的CNE2细胞以及原始CNE2细胞分别接种裸鼠，观察三种细胞的成瘤能力及细胞的恶性程度。结果：反义LMP1转染的CNE2细胞比空载体转染的CNE2细胞及原始CNE2细胞在裸鼠体内成瘤能力(包括平均瘤重及总瘤重)和镜下细胞恶性程度都有所降低。结论：反义LMP1能成功抑制LMP1的表达，逆转NPC细胞的恶性表型，为临床应用反义技术进行鼻咽癌基因治疗提供了实验依据。     

EGFR反义RNA的转染对人类鼻咽癌CNE－2细胞EGFR的表达下调及恶性表型的抑制

目的 利用反义RNA抑制靶基因表达的策略，下调EGFR的表达而探讨对人类低分化鼻咽癌CNE-2细胞的恶性表型的抑制性效应。方法 将人EGFR的N-端1．35kb片段反向构建人逆转录病毒表达载体pLXSN中，并用脂质体介导转染人鼻咽癌CNE-2细胞，G418筛选并分离阳性克隆，将两个EGFR反义cDNA转染的克隆细胞命名为CNE-2／AS4和CNE-2／AS8，而空载体转染的细胞命名为CNE-2／pLXSN。125I-EGF配体结合分析细胞膜上EGFR的表达，台盼蓝染色法测定细胞生长的改变，并用软琼脂集落形成实验检测细胞转化，最后，将筛选的各组阳性克隆细胞分别注射人裸鼠皮下，不同时间观察肿瘤生长的抑制改变及肿瘤的转移状况。结果配体结合实验结果显示。两个选择的克隆CNE-2／AS4和CNE-2／AS8细胞表面EGFR的数量分别较未转染细胞CNE-2下降18％、45％，表明EGFR反义RNA的表达下词了细胞膜上EGFR的表达；同时，EGFR反义RNA表达的CNE-2细胞生长速率和软琼脂生长能力也较对照组细胞明显降低。注射入裸鼠皮下后，EGFR反义RNA表达的阳性克隆细胞表现出肿瘤生长减慢。淋巴结和肺转移能力也明显降低。结论这些实验结果提示EGFR反义cDNA转染的CNE-2细胞能下调：EGFR的过量表达并部分抑制鼻咽癌的恶性表型，这为进一步阐明：EGFR在鼻咽癌的发生、演化中的功能作用提供了有用的工具。     

潜伏膜蛋白1基因真核表达载体的构建及其在鼻咽癌细胞中的表达

目的：构建真核细胞中表达潜伏膜蛋白1（LMP1）基因的增强荧光表达载体,观察其在鼻咽癌细胞中的表达。方法：从鼻咽癌C15细胞中获取编码LMP1的cDNA片段,经双酶切亚克隆到pEGFP-C1质粒载体,构建pEGFP-C1-LMP1真核表达载体。重组质粒经双酶切和测序鉴定,利用脂质体介导的方法将pEGFP-C1-LMP1体外瞬时转染鼻咽癌CNE2细胞,激光共聚焦显微镜观察LMP1的表达及其细胞内定位。结果：重组载体经SalⅠ和BglⅡ双酶切后,行琼脂糖凝胶电泳,可见1条与理论预测值一致的目的条带。DNA序列鉴定证实插入片段与GenBank提供的序列一致。将pEGFP-C1-LMP1瞬时转染鼻咽癌细胞株CNE2后,LMP1基因表达产物定位于细胞膜和细胞质中。结论：成功构建LMP1真核表达载体,并可在鼻咽癌CNE2细胞株中表达。     

EGFR反义RNA的转染对人类鼻咽癌CNE-2细胞EGFR的表达下调及恶性表型的抑制

目的利用反义RNA 抑制靶基因表达的策略,下调EGFR的表达而探讨对人类低分化鼻咽癌CNE-2细胞的恶性表型的抑制性效应。方法将人EGFR的N-端1.35kb片段反向构建入逆转录病毒表达载体pLXSN中,并用脂质体介导转染人鼻咽癌CNE-2细胞,G418筛选并分离阳性克隆,将两个EGFR 反义cDNA转染的克隆细胞命名为CNE-2/AS4 和CNE-2/AS8,而空载体转染的细胞命名为CNE-2/pLXSN。125I-EGF配体结合分析细胞膜上EGFR的表达,台盼蓝染色法测定细胞生长的改变,并用软琼脂集落形成实验检测细胞转化,最后,将筛选的各组阳性克隆细胞分别注射入裸鼠皮下,不同时间观察肿瘤生长的抑制改变及肿瘤的转移状况。结果配体结合实验结果显示,两个选择的克隆CNE-2/AS4 和CNE-2/AS8细胞表面EGFR的数量分别较未转染细胞CNE-2下降18%、45%,表明EGFR反义RNA的表达下调了细胞膜上EGFR的表达;同时,EGFR反义RNA表达的CNE-2细胞生长速率和软琼脂生长能力也较对照组细胞明显降低。注射入裸鼠皮下后,EGFR反义RNA表达的阳性克隆细胞表现出肿瘤生长减慢,淋巴结和肺转移能力也明显降低。结论这些实验结果提示EGFR 反义cDNA转染的CNE-2细胞能下调EGFR的过量表达并部分抑制鼻咽癌的恶性表型,这为进一步阐明EGFR在鼻咽癌的发生、演化中的功能作用提供了有用的工具     

hTERT基因反义cDNA转染对卵巢癌细胞系SKOV3生物学行为的影响

目的: 研究反义hTERT基因对卵巢癌细胞系SKOV3生物学行为的影响.方法: 构建反义hTERT基因的真核表达载体,采用LIPOFCTAMINETM Reagent转染卵巢癌细胞系SKOV3,通过RT-PCR、Trap-ELASA、生长曲线、裸鼠体内致瘤能力等方法比较转染前后细胞hTERT基因表达、端粒酶活性、细胞生长、致瘤性等方面的变化.结果:转化细胞系细胞hTERT基因的表达受到抑制,端粒酶活性下调,肿瘤细胞的增殖与生长速度明显降低,细胞的克隆形成能力及裸鼠体内的成瘤能力下降,肿瘤的恶性表型部分逆转.结论:应用反义技术下调hTERT基因表达可有效降低端粒酶活性并部分逆转卵巢癌细胞的恶性表型,hTERT基因可望成为卵巢癌基因治疗的新靶点.     

EB病毒潜伏膜蛋白LMP2A对人鼻咽癌细胞增殖与迁移特性的影响

目的:制备重组慢病毒载体pLMP2A,并检测其在人鼻咽癌细胞CNE1的表达情况及潜伏膜蛋白2A(latent membrane protein 2A,LMP2A)对人鼻咽癌细胞CNE1增殖?迁移?侵袭的影响?方法:利用DNA重组技术将EB病毒编码的LMP2A基因克隆到慢病毒表达载体plv-GFP中,通过酶切?测序验证,将重组慢病毒载体pLMP2A与包装质粒pdelta-8.91?pVSVG共转染人胚肾上皮细胞株293T,包装重组慢病毒LV-LMP2A,并感染人鼻咽癌细胞CNE1,经单克隆筛选后,用RT-PCR?免疫荧光和Western blot检测LMP2A在人鼻咽癌细胞CNE1的表达,CCK8法检测LMP2A对人鼻咽癌细胞CNE1增殖的影响,划痕实验?Transwell侵袭实验检测LMP2A对人鼻咽癌细胞CNE1迁移和侵袭的影响?结果:酶切及测序结果表明,成功制备了重组慢病毒载体pLMP2A;RT-PCR?Western blot?免疫荧光结果显示筛选出的细胞克隆能高表达EBV-LMP2A,CCK8结果显示LMP2A能促进人鼻咽癌细胞CNE1增殖,划痕实验结果显示LMP2A能促进人鼻咽癌细胞CNE1迁移,Transwell侵袭实验结果显示LMP2A能提高人鼻咽癌细胞CNE1侵袭能力?结论:成功制备了慢病毒载体pLMP2A,包装的慢病毒能够成功感染人鼻咽癌细胞系CNE1,使LMP2A基因得以高表达,并发现LMP2A能够促进人鼻咽癌细胞株CNE1增殖?迁移?侵袭,为进一步探讨EB病毒在鼻咽癌中的发病机制及基因治疗奠定了基础?     

重构型Caspase-3基因对CNE2细胞的作用

目的 探讨Caspase-3基因表达对人鼻咽癌细胞CNE2的凋亡诱导作用.方法 应用重组技术将重构型Caspase-3基凶亚克隆至带有报告基因的真核表达载体pEGFP中,脂质体介导转染人鼻咽癌细胞CNE2通过RT-PCR方法检测转染后Caspase-3基因的表达:荧光显微镜、电镜观察细胞形态学变化;MTT法检测转染Caspase-3基因对CNE2细胞生长的影响.结果 RT-PCR方法证实重构型Caspase-3基因可在CNE2细胞内表达,形态学观察显示转染组细胞较对照组出现明显细胞凋亡特征,结果表明Caspase-3对CNE2的细胞生长有抑制作用.结论 重构型Caspase-3对CNE2细胞的生长有抑制作用.     

表皮生长因子受体反义基因转染对人恶性胶质瘤细胞体外生长的影响

目的探讨表皮生长因子受体（ＥＧＦＲ）反义基因转染对人恶性胶质瘤细胞Ｕ８７ＭＧ体外生长的影响。方法构建ＥＧＦＲ反义基因表达载体，应用脂质体转染法将其导入Ｕ８７ＭＧ细胞；ＰＣＲ方法鉴定转染克隆；Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹杂交检测ＥＧＦＲ蛋白表达水平；通过绘制生长曲线和软琼脂集落形成实验测定反义ＥＧＦＲ基因对恶性胶质瘤细胞体外生长的抑制作用。结果转染反义ＥＧＦＲ基因的细胞克隆株ＡＳ１ＡＳ６的ＥＧＦＲ蛋白表达水平均有不同程度的降低；ＡＳ１ＡＳ６细胞体外生长明显减慢，ＡＳ１ＡＳ６细胞克隆形成率明显降低。表明Ｕ８７ＭＧ细胞体外生长速度和恶性转化能力均与ＥＧＦＲ表达呈正相关。结论反义ＥＧＦＲ基因转染可以明显抑制Ｕ８７ＭＧ细胞生长，ＥＧＦＲ对Ｕ８７ＭＧ细胞生长具有重要的调控作用     

反义P~(53)基因和mdm_2基因对肺腺癌细胞恶性表型双重抑制作用的实验研究

目的研究反义P53基因和mdm2基因对肺腺癌细胞中突变型P53的双重抑制,并观察其抑制肺腺癌细胞生长和促进恶性表型逆转作用。方法利用能表达反义产P53和mdm2基因的逆转录病毒表达载体在脂质体介导下,将PDOR－mdm2基因转染含有PDOR－FP53的肺腺癌GLG-82细胞中。经G418筛选获得GLG-82细胞同时含有反义P53基因和mdm2基因的克隆,这种双重转染的GLC－82细胞命名为PDOR－FP53／mdm2,并与导入空载体PDOR－neo和GLC-82亲本细胞作比较。通过DNA、RNA杂交观察外源基因转染细胞中表达情况,细胞生长曲线测定和3H－TdR掺入、软琼脂培养集落形成试验、流式细胞仪测定观察其对肺腺癌GLC-82细胞恶性表型的抑制作用。结果DNA、RNA杂交证实反义P53和mdm2基因转染GLC－82细胞成功并获得表达。细胞生长曲线测定和3H-TdR掺入试验结果表明,转染PDOR-PP53／mdm2基因的GLC-82细胞较转染PDOR-neo的GLC-82细胞活力减弱、增殖能力下降、DNA合成受阻、软琼脂培养集落形成率低。细胞周期分析结果显示,转染PDOR－FP53／mdm2的细胞G1期峰增高和S期峰降低,提示DNA合成减慢,细胞增殖受到抑制。结论反义P53基因和mdm2基因对肺腺癌细胞恶性表型有双重抑制作用。     

人胰岛素样生长因子Ⅱ型受体反义基因对肝癌细胞恶性表型的影响

目的 研究人胰岛素样生长因子Ⅱ型受体（IGF-ⅡR）反义基因对SMMC-7721人肝癌细胞恶性表型的逆转作用。方法 构建IGF-ⅡR正、反义基因真核表达质粒,用磷酸钙-DNA共沉淀的方法,导入SMMC-7721人肝癌细胞株,经G418培养基筛选稳定的抗性细胞。采用Northern杂交检测对转染细胞内源性IGF-ⅡR基因转录的抑制,观察转染细胞克隆形成率,细胞生长曲线,软琼脂生长及裸鼠致瘤能力的变化。结果 IGF-ⅡR反义基因转染肝癌细胞的内源性IGF-ⅡR基因转录受到有效抑制,转染细胞克隆形成率明显降低,并失去在软琼脂上生长的能力,裸鼠致瘤性明显降低,但细胞生长曲线无明显变化。结论 IGF-ⅡR反义基因可以有效阻断IGF-Ⅱ至IGF-ⅡR的自泌/旁泌生长刺激信号环路,一定程度地抑制肝癌细胞的恶性表型。     

人端粒酶蛋白催化亚单位反义基因转染对胃癌细胞恶性表型的逆转作用

目的 探讨人端粒酶蛋白催化亚单位（hTRT）反义基因治疗对胃癌细胞恶性表型的逆转作用。方法 采用基因重组技术,构建hTRT正比、反义真核表达载体,采用脂质体法导入SGC－790细胞、反义真核表达载体,并导入SGC－790胃癌细胞株中,获得稳定表达正、反义基因的细胞系7901－S、7901－AS1和7901－AS2。7901－AS1和7901－AS2出现显著生长抑制现象,端粒酶活性明显下降,细胞凋亡增加,异型性减小,G0／G1期细胞增加,S和G2M期细胞减少,增殖指数减小,软琼脂中克隆形成,裸鼠体内成瘤消失。结论 hTRT反义基因治疗可以明显抑制SGC－7901细胞的增殖,部分逆转肿瘤细胞的恶性表型,其机制可能主要是通过诱导细胞分化而非诱导细胞凋亡途径实现的,提示hTRT基因可以作为肿瘤治疗的靶基因。     

人鼻咽癌DNA的转化活性

本文以鼻咽癌活检组织及CNE_1细胞株DNA为实验材料,用磷酸钙沉淀法转染了NIH/3T3 小鼠纤维母细胞、Rat-1 大鼠纤维母细胞和JB_6Cl_(41)小鼠上皮细胞,并以软琼脂培养法检测了转染后的MIH/3T3 细胞集落生成情况。实验表明:鼻咽癌及其CNE_1细胞DNA均可以诱发NIH/3T3细胞、Rat-1细胞转化,也可使NIH/3T3细胞获得在软琼脂上生长的能力,但不能使JB_6Cl_(41)细胞转化。本文还讨论了鼻咽癌及其CNE_1细胞DNA诱发的受体细胞转化与EB病毒感染间的关系,并对鼻咽癌转化基因的性质作了初步估计。     

反义hTR对人胃癌细胞株SGC-7901恶性表型的逆转作用

目的 探讨反义ｈＴＲ基因转染对胃癌细胞系ＳＧＣ－７００１恶性有型的逆转作用及其在肿瘤基因治疗中的价值。方法 构建包含端粒重复序列模板区的反义ｈＴＲ基因真核表达载体用脂质体法将其转染率胃癌细胞系ＳＧＣ－７９０１,比较观察反义ｈＴＲ基因转染后７９０１细胞的ｈＴＲＲＮＡ表达、端粒酶活性、体外生长增殖降低,体外生长增殖能力降低,接触抑制恢复、细胞凋亡率增加、软琼脂集落形成能力和裸鼠体内致瘤能力完全消失。结     

反义CDK4基因抑制人结肠癌细胞HT29生长

目的 将反义CDK4导入人结肠癌细胞株HT29细胞,观察其对肿瘤细胞生长的影响。方法 采用lipofectamine转染方法转染HT29细胞,Northern印迹,Western印迹,形态学和流式细胞术等方法用于转染效果的鉴定。结果 转化细胞有反义CDK4的表达,而内源性CDK4mRNA表达和蛋白合成下调,并且转化细胞的恶性行为及表型部分逆转,细胞生长受到抑制、软琼脂集落形成能力明显降低,同时揭示G1期阻滞。HT29-asCDK4细胞有较高的凋亡率。结论 反义CDK4基因可抑制HT29细胞的生长和增殖、诱导其凋亡。为结直肠癌的基因治疗提供了一种新的可能的途径。     

hTERT基因永生化人毛乳头细胞系的转化特征

目的 探讨hTERT基因永生化人毛乳头细胞系是否具有转化特征.方法 采用脂质体转染法,将hTERT基因导入体外培养的正常人毛乳头细胞,经G418筛选得到阳性克隆,连续传代培养.应用RT-PCR 法检测 hTERT mRNA 的表达.采用细胞形态学观察、染色体核型分析、软琼脂克隆形成实验和裸鼠致瘤实验分析转染细胞是否具有转化特征.结果 转染后获得1个阳性细胞克隆,扩大培养后细胞生长良好,现已连续传至50代.检测证实转染细胞稳定表达hTERT mRNA,细胞形态与未转染细胞基本相同,染色体核型正常,在软琼脂内不能生长,无裸鼠致瘤性.结论 hTERT基因永生化人毛乳头细胞系基本上是正常细胞而无明显转化特征.     

Influence of recombinant retroviral vector expressing antisense TGF alpha on malignant phenotype of human pancreatic carcinoma cell line.

OBJECTIVE To observe the effects of antisense TGF alpha on the growth of human pancreatic carcinoma cell line cells.

METHODS A recombinant retroviral vector expressing antisense TGF alpha was constructed, and transfected the ecotropic packaging cell line psi-2 with lipofectin. After the amphotropic packaging cell line PA317 was transfected with the virus supernatant of psi-2, the replication-defective, amphotropic retroviral supernatant was used to infect human pancreatic carcinoma cell line PC-7. Following puromycin selection, puromycin-resistant colonies were pooled and expanded to a cell line PC-7/AS-TGF alpha.

RESULTS The retroviral integration in the genomes of psi-2, PA317 and transformant PC-7 cells was confirmed by Southern blot hybridization. Northern blot hybridization showed a down regulation of endogenous TGF alpha in PC-7/AS-TGF alpha cell line. The high levels of growth inhibition and reduction of 3H-TdR incorporation in PC-7/AS-TGF alpha were evident. Also, the soft agar colony-formation and tumorigenicity in nude mice were significantly suppressed by antisense TGF alpha.

CONCLUSIONS The antisense TGF alpha expressing vector can block the target gene expression, suppress the cell growth and partially reverse the malignant phenotype of pancreatic carcinoma cells.

     

EBV-LMP1促CNE2细胞迁移的作用机制

目的：探讨EBV-LMP1对鼻咽癌细胞CNE2迁移表型的影响及作用机制。方法：用RV-LNSX，RV-LMP1和RV-LMP1^TRADD。逆转录病毒分别感染CNE2细胞，G418筛选后，观察和检测转基因细胞的形态学特点，在基质中的运动迁移能力以及R-钙黏蛋白（E-Cadherin）表达的变化；用pLNSX，pLNSX-LMP1和pLNSX—LMPI^TRADD质粒分别与E-Cadherin报告基因共转染293细胞，检测LMP1对E-Cadherin启动子活性的影响。结果：与CNE2和CNE2-LNSX细胞相比，CNE2-LMP1在培养过程中由扁平、鹅卵状上皮细胞形态逐渐演变为细胞间接触消失的长梭状纤维细胞形态，相对迁移明显增大（n=3，P〈0.05）。且E-Cadherin表达明显下调或缺失；随着共转染野生型LMP1（pLNSX-LMP1）剂量的增加（0．2，0、6，1．0μg），对E／-Cadherin启动子转录活化的抑制率增加，呈明显浓度依赖性；LMPI^TRADD不改变CNE2细胞形态学及迁移表型，对E-Cadherin启动子的转录活性及蛋白表达亦无明显影响。结论：抑制E-Cadherin启动子活化可能是EBV-LMP1下调E-Cadherin蛋白表达、促CNE2细胞迁移的机制之一，位于LMP1羧基端的TRADD可能是其促迁移的主要活性部位。