单纯疱疹病毒TK基因介导GCV治疗人RB肿瘤的实验研究

为探讨HSV－TK基因介导的GCV系统对人视网膜母细胞瘤（RB）基因治疗的有效性,利用电穿孔技术把重组逆转录病毒载体pLXSNTK导入包装细胞PA317,筛选出逆转录病毒产生细胞PA317/TK,收获病毒。体外实验：用逆转录病毒感染RB细胞,筛选出含TK基因的RB细胞（RB/TK）,用GCV分别处理RB、RB/TK及不同比例的混合细胞。体内实验：建立人RB裸鼠原位异种移植模型,瘤内注射病毒液后再经GCV处理。结果：体外实验RB/TK细胞对GCV的敏感性显著高于RB细胞,并存在旁观者效应;RB荷瘤裸鼠内TK/GCV系统对RB细胞的生长也有明显的抑制作用。提示HSVTK/GCV系统有望成为人RB肿瘤的基因治疗途径。     

旁观者效应在肝癌基因治疗中的作用

目的：观察HSV－tk/ACV(Herpes Simplex Virus thymidine kinase gene/Acyclovir）系统基因治疗恶性肿瘤过程中旁观者效应的作用。方法：HSV－tk基因重组逆转录病毒载体转染PA317细胞为PA317－tk细胞。培养PA317－tk细胞即可获得有感染力的携带HSV－tk基因的病毒颗粒,然后转染肝癌细胞株SMMC－7721细胞为SMMC－tk细胞。SMMC－TK细胞与SMMC－7721细胞以不同百分比混合,用ACV（100ug/ml）培养基培养,MTT法检测ACV对各组细胞抑制率（Inhibit Rate,IR),根据各组IR与该组SMMC－tk细胞数的百分比值（IR／SMMC－tk%,IR/St）的大小判断旁观者效应作用的有无和强弱。结果：旁观效应试验表明,含SMMC-tk细胞10％,20％,30％,40％,50％,60％,70％,80％,90％,100％各组IR／St比值分别为2．15,1．91,1．83,1．47,1．30,1．11,1．02,0．93,0．84,0．76。10％－70％各组IR／St比值均大于1,存在明显旁观者效应,以10％,20％,30％,40％组最强,80％－100％三组IR／St比值小于1,旁观者效应不明显。结论：研究结果证实用HSV－tk/ACV系统基因治疗恶性肿瘤,适宜比例TK^ 细胞时,存在明显的旁观者效应,TK／细胞为10％时旁观者效应最强,这对于HSV－TK／ACV系统基因治疗恶性肿瘤具有重要意义。     

HSV-TK/GCV系统对卵巢癌细胞OVCAR3杀伤作用的研究

目的评价HSV—TK／GCV系统对卵巢癌细胞OVCAR3的杀伤作用及旁观者效应。方法用含HSV—TK重组腺病毒载体转染人卵巢上皮性癌细胞OVCAR3，用四甲基偶氮唑蓝（MTT）法计算细胞存活率以评价杀伤作用；转染的OVCAR3细胞（TK^＋）与未转染的OVCAR3细胞（TK^-）以不同比例混合，再加入GCV，MTT法计算细胞存活率以评价旁观者效应。结果HSV—TK／GCV系统可明显杀伤OVCAR3细胞，在感染复数（MOI）为100时，平均细胞存活率为26％；HSV—TK／GCV系统对该细胞的杀伤作用有明显的“旁观者效应”，当TK^＋细胞占10％、20％、30％、40％、50％时，细胞平均存活率分别为82％、52％、41％、35％、32％。免疫细胞化学检测OVCAR3细胞的细胞膜上有Cx43的表达。结论HSV—TK／GCV系统对人卵巢上皮性癌细胞OVCAR3有明确的杀伤作用及旁观者效应。     

单纯疱疹病毒胸苷激酶丙氧鸟苷自杀基因系统对宫颈癌Hela细胞系体外杀伤作用的研究

目的：观察单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)丙氧鸟苷(GCV)自杀基因系统对人宫颈癌Hela细胞系体外杀伤作用及其旁观效应。方法：采用脂质体转染法将GINaTK载体转入包装细胞PA317。取病毒上清液感染Hela细胞,得到带有HSV-TK基因的Hela／TK细胞,并将其用于体外实验。结果：载体HSV-TK导入了PA317细胞。体外实验结果显示,当Hela／TK细胞数占混合细胞10％时,低浓度(10mg／L)的GCV就可将50％左右的肿瘤细胞杀死。GCV作用后的实验组Hela／TK细胞基因组经琼脂糖凝胶电泳后可观察到典型的DNA梯状条带。结论：逆转录病毒可介导HSV-TK基因转入人宫颈癌Hela细胞并获稳定表达,HSV-TK／GCV自杀基因系统在体外对宫颈癌细胞有杀伤作用,且存在明显的旁观效应。     

转TK基因的人肺腺癌细胞对三种原药敏感性的研究

构建了含有单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSV－TK）基因的重组逆转录病毒载体LTKSN，经PA317细胞包装后，感染人肺腺癌细胞株A549。用G418筛选到稳定表达HSV－TK基因的细胞克隆A549／TK，A549／TK与野生型A549细胞相比，生长曲线无明显差异，细胞形态亦无改变。细胞毒试验证明．HSV－TK对GCV的敏感性很高，半杀伤浓度IC50为0．5μmol／L，比野生型细胞提高了1000倍。三种不同的原药GCV、ACV和BVDU对A549／TK具有效果不等的杀伤作用。旁杀伤效果十分明显，低浓度GCV就可以将含33％A549／TK的混合细胞中的大部分肿瘤细胞杀死。     

HSV-TK/GCV系统治疗鼠膀胱癌细胞T739旁观者效应的实验研究

目的 为探讨HSV－TK／GCV系统治疗鼠膀胱癌细胞T739的旁观者效应。方法 台盼蓝染色计数法对GCV单独作用T739－TK细胞、T739细胞或其两者按不同比例混合在不同容积等情况下的杀伤作用进行研究。结果 HSV－TK／GCV系统有效的杀伤T739－TK细胞，且这种作用有明显的旁观者效应，旁观者效应的强弱与T739－TK细胞所占比例以及细胞间接触程度成正相关。结论 HSV－TK／GCV系统不仅能有效的杀伤T739－TK细胞，而且对T739细胞有明显的旁观者效应。     

单纯疱疹病毒胸苷激酶基因对人胶质母细胞瘤细胞的杀伤效应研究

目的　研究单纯疱疹病毒胸苷激酶 (HSV1 TK)基因转染并联合抗病毒药更昔洛韦 (Ganciclovir ,GCV)对人胶质母细胞瘤细胞的杀伤效应。方法　采用基因工程技术构建带HSV1-TK基因的逆转录病毒重组体pLX SN TK ,采用脂质体介导入PA317包装细胞 ,建立重组逆转录病毒载体分泌细胞株PA317 TK ;用该细胞上清液转导人胶质母细胞瘤细胞 ,用不同浓度GCV作用人胶质母细胞瘤细胞SW0 38 C2 TK和野生型SW0 38 C2 ,采用噻唑蓝(MTT)比色法检测 72h后细胞存活率 ,并求出半杀伤浓度。结果　重组逆转录病毒载体pLXSN TK能有效地将TK基因导入SW0 38-C2细胞内 ,并使其获得对GCV的敏感性 ;体外细胞毒实验 :在 2 0 μmol LGCV存在的情况下 ,野生型细胞无明显改变 ,而实验组细胞明显死亡 ,半杀伤浓度IC50 为 0 8μmol L ,与SW0 38 C2相比 ,对GCV的敏感性提高了 6 0 0倍 ,旁杀效果也较明显。结论　SW0 38 C2转染TK基因后 ,能有效地被GCV杀灭。显示了其潜在的临床应用价值     

HSV-tk/GCV自杀基因系统对视网膜母细胞瘤的体外抗肿瘤效应

目的 研究单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶／更昔洛韦(herpes simplex virus thymidine kinase／ganeyclov—ir,HSV—tk／GCV)自杀基因系统对视网膜母细胞瘤(retinoblastoma,Rb)细胞的体外杀伤作用以及旁观者效应发生的机制。方法 应用脂质体将pCMV／hytk-IRES-hrGFP质粒导入HXO-Rb44细胞株。用潮霉素筛选出阳性细胞克隆并命名为HXO-Rb44／tk。RT—PCR鉴定hytk基因在HXO-Rb44／tk细胞中的转录结果。比较HXO-Rb44和HXO-Rb44／tk细胞的形态特征及生长特性。通过MTT法检测GCV对不同比例HXO-Rb44／tk和HXO-Rb44混合细胞的杀伤作用(“旁观者效应”)。并通过上清移换实验研究旁观者效应发生的机制。结果HXO-Rb44／tk细胞经RT—PCR可检测出530bp的hytk基因片段。HXO-Rb44／tk和HXO-Rb44细胞的形态特征及生长特性无明显差异。HXO-Rb44／tk细胞仅占很低比例时即可观察到明显的旁观者效应,而GCV作用的HXO-Rb44／tk细胞上清对HXO-Rb44细胞无杀伤作用。结论 HSV—tk基因转移联合GCV治疗可作为Rb基因治疗的一种有效方法,旁观者效应可能是GCV代谢产物通过缝隙连接进行细胞间转运来实现的。     

逆转录病毒介导的HSV-TK基因系统对人胃癌细胞的转染及杀伤作用逆转录病毒介导的HSV-TK基因系统对人胃癌细胞的转染及杀伤作用

目的：探讨逆转录病毒介导的单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSV-TK）基因系统对人胃癌细胞的转染及杀伤作用。方法 应用PA317细胞包装的逆转录病毒介导的HSV-TK基因系统,在体外以逆转录病毒上清感染法将TK基因导入MKN28人胃癌细胞,并初步观察更昔洛韦（GCV）对转染TK基因的MKN28胃癌细胞的杀伤作用。结果：TK基因可成功转导入MKN28细胞,且对细胞的生长状态无明显影响。但对GCV的敏感性却显增加;同时还观察到显的“旁观效应”。结论：逆转录病毒介导的HSV-TK系统对人胃癌细胞有较高的转染效率,GCV对转染阳性的胃癌细胞有显的杀伤作用。     

双自杀基因CD+TK对胰腺癌BxPC-3细胞的影响

目的探讨逆转录病毒介导的双自杀基因对胰腺癌BxPC-3细胞的杀伤作用及胰腺癌的基因治疗方法。方法通过脂质体将含有双自杀基因的逆转录病毒载体MMLV—CD＋TK导入包装细胞PA317，经G418筛选后大量培养产病毒的阳性克隆PA317／CD＋TK细胞株，收集病毒上清液，浓缩后转染胰腺癌BxPG3细胞系，再次经G418筛选，获得稳定表达双自杀基因的BxPC-3／CD＋TK细胞株。用RT—PCR检测双自杀基因的表达。给予前体药物5-氟胞嘧啶（5-flourocytosine，5-FC）和（或）无环鸟苷（Ganciciovir，GCV）后，MTT法测定转基因组及未转基因组胰腺癌BxPC-3系细胞的存活率。结果双自杀基因在胰腺癌BxPC-3系细胞中可稳定表达，联合使用5-FC和GCV对细胞增殖的杀伤作用及旁杀伤效应效果明显。结论逆转录病毒介导自杀基因可有效杀死胰腺癌Bx-PC-3系细胞，双自杀基因具有更强的抗肿瘤作用。     

单纯疱疹病毒胸苷激酶基因对肺腺癌细胞杀伤作用探讨

目的：探讨单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-tk)基因转染联合抗病毒药物更昔洛韦（GCV）对人肺腺癌细胞系的杀伤作用。方法：应用基因工程技术构建了携带单纯疮疹病毒胸苷激酶（HSV-tk）基因的逆转录病毒重组体pLXSN-tk，通过脂质体法转染PA317细胞，G418筛选出产重组病毒颗粒的生产细胞PA317-tk细胞。采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测HSV-tk/GCV系统对人肺腺部细胞系GLC-82的生长抑制率。结果：重组逆转录病毒载体能有效地将HSV-tk基因导入GLC-82细胞系内并使其获得对GCV的敏感性。结论：肺腺癌细胞转染HSV-tk基因后，能有效地被GCV杀死。     

单纯疱疹病毒TK基因介导GCV治疗人RB肿瘤的实验研究

为探讨ＨＳＶ－ＴＫ基因介导的ＧＣＶ系统对人视网膜母细胞瘤（ＲＢ）基因治疗的有效性,利用电穿孔技术把重组逆转录病毒载体ｐＬＸＳＮ－ＴＫ导入包装细胞ＰＡ３１７,筛选出逆转录病毒产生细胞ＰＡ３１７／ＴＫ,收获病毒。体外实验：用逆转录病毒感染ＲＢ细胞,筛选出含ＴＫ基因的ＲＢ细胞（ＲＢ／ＴＫ）,用ＧＣＶ分别处理ＲＢ,ＲＢ／ＴＫ及不同比例的混合细胞。体内实验：建立人ＲＢ裸鼠原位异种移植模型,瘤内注射病毒液后再     

HSV-tk基因特异性杀伤大肠癌细胞的实验研究

目的：探讨单纯疮疹病毒胸苷激酶（ＨＳＶ－tk)ad基因在大肠癌组织细胞中特异地表达, 以达到靶向基因治疗的作用。方法：构建以ＣＥＡ基因顺式转录调控序列（ＴＲＳ）驱动tk基因的组织特异性重组逆转录病毒载体Ｇ１ＣＥＡtkＮa,然后以重组逆转录病毒上清染法将重组组织特异性载体及非组织特异性载体分别转导入高分泌ＣＥＡ的大肠癌ＬoＶo细胞中,以Ｇ４１８筛选阳性克隆扩增后给予前药更昔洛韦（ＧＣＶ）进行敏感试验。结果：转导     

HyTK基因转导联合丙氧鸟苷对鼠膀胱癌细胞的体外杀伤作用

目的　探索HyTK基因转导丙氧鸟苷 (ganciclovir,GCV)对鼠膀胱癌细胞的影响。方法　脂质体介导法将PL(HyTK)SN质粒转染PA3 17细胞 ,潮霉素B筛选 ,直到出现抗性克隆 ,扩增培养 ,NIH3T3细胞测定病毒滴度 ,用逆转录病毒上清液感染T73 9细胞 ,潮霉素B筛选 ,直到出现抗性克隆 ,扩增培养 ,命名为T73 9 TK。RT PCR对T73 9 TK细胞进行鉴定。然后观察其在体外膀胱癌细胞的杀伤作用。结果　RT PCR证实HyTK基因已插入T73 9细胞并有其mRNA的表达 ,经不同浓度GCV处理后的T73 9 TK细胞均表现出有杀伤作用 ,而T73 9细胞在各个剂量的GCV作用下生长均良好。结论　GCV对转导了HyTK基因的T73 9细胞有显著杀伤作用     

含HSVtk基因重组逆转录病毒包装细胞PA317/TK的建立

目的 :研究肿瘤的自杀基因疗法 ,建立含单纯疱疹病毒胸苷激酶 (HSVtk)基因重组逆转录病毒包装细胞PA317/TK。　方法 :应用脂质体转移方法将逆转录病毒载体GINaTK导入PA317,经G4 18筛选阳性克隆细胞后分别用PCR和扫描电镜检测HSVtk基因整合和病毒颗粒分泌情况。　结果 :逆转录病毒载体GINaTK导入PA317,G4 18后筛选得到阳性克隆细胞 ,命名为PA317/TK。PCR检测PA317/TK细胞出现一特异性 4 0 4bp阳性条带 ,而PA317细胞没有扩增出相应条带。PA317/TK细胞经扫描电镜检测见其表面有颗粒状突起 ,其周围有许多呈团状的病毒颗粒。证实含HSVtk基因重组逆转录病毒存在于包装细胞中。　结论 :成功建立含HSVtk基因重组逆转录病毒包装细胞     

HRE增强hTERT启动子-tk/GCV基因系统对缺氧环境肿瘤细胞的杀伤作用

目的：探讨缺氧反应元件(HRE)增强hTERT启动子-tk/GCV逆转录病毒基因系统对缺氧环境肿瘤细胞的体外杀伤作用。 方法：构建由HRE缺氧反应元件修饰的hTERT杂合启动子和hTERT单一启动子引导单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-tk)基因表达的重组逆转录病毒载体,在脂质体介导下分别转染PA317包装细胞,G418筛选,直至出现抗性克隆。将重组病毒感染人肺癌细胞SPC-A1和人肝癌细胞Bel-7402,G418筛选出抗性克隆肿瘤细胞。实验分为对照组、SPC-A1/tk组和Bel-7402/tk组。在缺氧处理条件下,MTT法检测前体药物丙氧鸟苷(GCV)对SPC-A1/tk和Bel-7402/tk细胞的杀伤效应,流式细胞仪检测其细胞凋亡率和细胞周期的变化。 结果:与对照组比较,缺氧环境培养的SPC-A1/tk和Bel-7402/tk细胞对GCV的敏感性明显增强,其中细胞凋亡率明显升高（P<0.001）,细胞周期各期细胞数有所减少（P<0.05）。与hTERT启动子引导的tk基因系统组细胞比较,［HRE］hTERT杂合启动子引导的tk基因系统组肿瘤细胞存活率更低（P<0.01）,诱导肿瘤细胞凋亡率明显升高（P<0.01）,G₁期和^G0期细胞数有所增高（P<0.05）,S期细胞数减少（P<0.05）。结论：HRE能增强hTERT启动子-tk/GCV自杀基因系统对缺氧环境中肿瘤细胞的体外杀伤作用。     

逆转录病毒介导的HSV-TK基因对人骨肉瘤细胞的杀伤作用

目的 探讨骨肉瘤基因治疗的可行性。方法 采用逆转录病毒介导的HSV-TK基因转移和GCV治疗的方法进行研究。结果 成功构建含HyTK基因的重组逆转录病毒载体DORHyTK;采用DOTAP将其转入PA317细胞中进行包装,筛选,并进行病毒滴度测定。收获病毒上清体外感染骨肉瘤细胞株OS732和SAOS-2。分别用PCR和RNA斑点杂交的方法证明假病毒中不含有复制活性病毒,HSV-TK基因已整合到宿主细胞基因组中,并获得表达,MTT比色法测定结果显示GCV对OS732TK和SAOS-2TK细胞均有明显的杀伤作用。且前者强于后者,旁观者效应在高细胞密度接种条件下强于低细胞密度,在SAOS-2细胞中的作用强于OS732。结论 HSV-TK/GCV基因治疗系统可为骨肉瘤的治疗提供新途径。