慢病毒介导的双自杀基因对大肠肿瘤细胞的靶向杀伤作用

目的 研究慢病毒介导的KDR启动子驱动CD/TK双自杀基因系统对大肠肿瘤细胞选择性杀伤作用.方法 构建的重组FGW-KDRP-CD/TK慢病毒载体在293T细胞包装扩增后,获得病毒颗粒,体外感染表达KDR的LOVO细胞株和不表达KDR的LS174T细胞株,以RT-PCR方法检测转基因细胞CDglyTK的表达,然后给予不同浓度的前药5-FC及GCV处理,观察该体系对不同细胞株的杀伤效应.结果 重组体对各细胞株的感染率相似,RT-PCR方法检测发现:除LS174T细胞外,LOVO细胞有目的基因CDglyTK的表达.LOVO与LS174T细胞株对前药敏感性有显著性差异(P＜0.001),双自杀基因的疗效优于任一单自杀基因的疗效(P＜0.001).结论 KDR启动子可调控双自杀基因系统选择性杀伤表达KDR的大肠肿瘤细胞.     

HSV-tk/GCV系统对人宫颈癌细胞株ME180旁观者效应的研究

目的：研究以逆转录病毒载体介导的HSV－tk/GCV系统对宫颈癌ME180细胞株的旁观者效应。方法：应用脂质体及ploybrene转染技术，将重组逆转录病毒载体PLXSN－HSV－tk，导入PA317包装细胞，以其分泌的逆转录病毒感染宫颈癌ME180细胞（ME），建立ME／TK转化细胞株。观察GCV对ME、ME／TK细胞的存活率及旁观者效应。结果：从病毒滴度、电镜及PCR检查，证实tk基因随病毒的感染已成功地导入PA317及ME180细胞。ME／TK细胞对GCV的敏感性显著高于亲代ME细胞。ME／TK及ME＋ME／TK混合细胞还随GCV浓度的增加受到明显的抑制。ME＋ME／TK混合细胞的存活率，随ME／TK细胞比例的增加而降低，说明TK／GCV系统不但能杀伤tk^ 细胞，也能杀伤未导入tk的细胞，存在明显的旁观者效应。结论：HSV－tk/GCV系统对宫颈癌ME180细胞具有明显的杀伤及旁观者效应。     

自杀基因CD、TK的共表达对人肺腺细胞的杀伤作用

目的 观察双自杀基因的共表达与单自杀基因单独表达对癌细胞的杀伤作用。方法 分别构建了以CMV为启动子,含单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSV－TK）和／或大肠杆菌嘧啶脱氨酶（Ecoli.CD)单、双自杀基因的真核表达载体。在脂质体介导下将基因导入细胞,经G418筛选出稳定表达的克隆。用PCR、半定量RT－PCR检测各组基因的整合及表达。给予前本药物5－氟胞嘧啶（5－flurocytosine,5-Fc)和／或无环岛苷（Ganciclovir,GCV)后,用MTT法测定各围基因组细胞的存活率。结果 单、双自杀基因均在GLC－82细胞中稳定表达,双基因转染组对细胞增殖的杀伤及旁杀伤效应高于单基因组。结论 TK＋CD／5－Fc GCV的双基因共表达体系较CD／6－Fc或TK／GCV单 基因体系对细胞具有更强的杀伤作用。     

腺病毒介导融合双自杀基因治疗膀胱癌

目的 探讨腺病毒介导胞嘧啶脱氨酶（CD）和胸苷激酶（TK）融合双自杀基因系统对膀胱癌治疗作用并与单基因系统作比较。方法 利用含有CD-TK双自杀融合基因及绿色荧光蛋白（GFP）基因的复制缺陷腺病毒作载体，PCR检测CD、TK及E1基因。建立C57BL／6同系膀胱癌Mb49皮下移植瘤模型，观察肿瘤注射腺病毒联合丙氧鸟苷（GCV）或／和5-氟胞嘧啶（5-FC）治疗后肿瘤体积及组织学变化。结果 PCR可检测到腺病毒DNA中含CD及TK基因、无E1基因。腺病毒注射联合GCV、5-FC、GCV＋5-FC治疗后，肿瘤体积与对照组相比明显缩小（P=0.00），腺病毒注射联合GCV＋5-FC有协同作用（P=0．04），优于腺病毒注射联合GCV以及腺病毒注射5-FC。基因治疗后肿瘤细胞大片坏死．对照组细胞形态无变化。结论 腺病毒介导CD-TK融合双自杀基因联合GCV或／和5-FC能有效治疗膀胱癌，融合双自杀基因CD-TK／（GCV＋5-FC）系统对膀胱癌治疗有协同作用，其效果优于CD-TK／GCV或CD-TK／5-FC系统。     

胞嘧啶脱氨酶和胸苷激酶融合双自杀基因系统对膀胱癌细胞体外杀伤作用

目的探讨胞嘧啶脱氨酶(CD)和胸苷激酶(TK)融合双自杀基因系统对膀胱癌细胞的杀伤作用。方法利用含有CD-TK双自杀融合基因及绿色荧光蛋白(GFP)基因的复制缺陷腺病毒感染膀胱癌细胞株Mb49细胞,RT-PCR检测CD及TK表达,MTT法测定感染病毒Mb49细胞对GCV和/或5-FC敏感性及旁观者效应。结果RT-PCR可检测到腺病毒感染的Mb49细胞中CD及TK表达,腺病毒感染的Mb49细胞对GCV和/或5-FC敏感性增强,且细胞存活率随前药浓度增加而明显降低,联合应用杀伤效果更强。在混合培养细胞中转染细胞为10%时,GCV组、5-FC组、GCV 5-FC组细胞存活率分别为(79.55±0.88)%、(77.17±3.38)%、(49.21±1.78)%,有较强的旁观者效应。结论腺病毒载体能有效转导CD-TK融合双自杀基因在膀胱癌细胞中表达,CD-TK融合双基因系统对膀胱癌细胞有更强杀伤效果和更明显的旁观者效应,优于单基因系统,值得进一步研究。     

转TK基因的人肺腺癌细胞对三种原药敏感性的研究

构建了含有单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSV－TK）基因的重组逆转录病毒载体LTKSN，经PA317细胞包装后，感染人肺腺癌细胞株A549。用G418筛选到稳定表达HSV－TK基因的细胞克隆A549／TK，A549／TK与野生型A549细胞相比，生长曲线无明显差异，细胞形态亦无改变。细胞毒试验证明．HSV－TK对GCV的敏感性很高，半杀伤浓度IC50为0．5μmol／L，比野生型细胞提高了1000倍。三种不同的原药GCV、ACV和BVDU对A549／TK具有效果不等的杀伤作用。旁杀伤效果十分明显，低浓度GCV就可以将含33％A549／TK的混合细胞中的大部分肿瘤细胞杀死。     

融合自杀基因CDglyTK治疗喉癌的体外实验研究

目的 研究融合自杀基因CDglyTK治疗喉癌。方法 PCR扩增、酶切、连接、转化等构建质粒表达栽体pcDNA3．1（-）CMVCDglyTK，XhoⅠ／HindⅢ酶切鉴定，测序分析CDglyTK基因序列。建立稳定表达CDglyTK基因的Hep-2细胞株，RT—PcR及Western-blotting鉴定CDglyTK基因的表达。MTT法观察5-FC、GCV、5-FC＋GCV对表达CDglyTK基因的Hep-2细胞生长的抑制作用。结果 酶切和基因测序分析证明重组质粒含完整的CD及TK基因，RT—PCR从转染细胞总RNA中扩出707bp的预期片段。West—era-blotting检测到该基因表达的59kDa的蛋白。表达CDglyTK基因的Hep-2细胞在5一FC、GCV、5-FC＋GCV干预下生长受到抑制，5-FC与GCV联合有更强的杀伤效应。结论 CDglyTK融合自杀基因可以成为基因治疗喉癌的有效方法。     

胞嘧啶脱氨酶和单纯疱疹病毒胸苷激酶基因治疗肝门部胆管癌的体内外实验研究

目的:观察逆转录病毒介导的胞嘧啶脱氨酶(E.coli-cytosinedeaminase,CD)基因、单纯疱疹病毒胸苷激酶(herpessimplexvirus-thymidinekinase,HSV-tk)基因转染肝门部胆管癌的作用。方法:在脂质体lipofectamine的介导下将含有双自杀基因的逆转录病毒载体PWZLneoCDglytk导入包装细胞PA317,收集其病毒上清,转染FRH细胞,用RT-PCR检测双自杀基因的表达。给予前体药物5-氟胞嘧啶(5-flourocytosine,5-Fc)和(或)无环鸟苷(ganciciovir,GCV)后,用四甲基偶氮唑蓝比色(MTT)法测定转基因组及未转基因组FRH细胞存活率。在0.8cm裸鼠肝门部胆管癌模型转染入双自杀基因后,给予5-Fc500mg/kg体重,GCV100mg/kg体重,1次/d,共10d,观察肿瘤生长情况。结果:双自杀基因在FRH细胞中可稳定表达,联合使用5-Fc和GCV对靶细胞增殖的杀伤作用及旁杀伤效应高于单独使用5-Fc或GCV。在裸鼠实验性肝门部胆管癌,实验组肿瘤的生长明显受到抑制(P<0.05);双自杀基因与单自杀基因的作用有显著差异(P<0.05)。结论:逆转录病毒介导自杀基因可有效地杀死肝门部胆管癌细胞,明显抑制裸鼠肝门部胆管癌生长,双自杀基因共表达较单一自杀基因有更强的抗肿瘤作用。     

慢病毒介导的双自杀基因对乳腺癌细胞的杀伤作用

目的 探讨慢病毒介导的CDglyTK融合基因体系对人乳腺癌细胞株（MCF-7）的杀伤作用。方法 构建的重组质粒pLenti6／V5-D-CDglyTK及阳性对照质粒pLenti6／V5-D-GFP在lipofectamine2000介导下转染293FT细胞，包装、扩增后获得病毒颗粒，体外感染MCF-7细胞株，荧光显微镜下观察阳性对照质粒的感染效率并以RT-PCR方法检测转基因细胞CDglyTK的表达，然后给予前药5-FC，GCV及5-FC＋GCW处理，观察该体系对细胞株的杀伤效应。结果 重组体对细胞株的感染率随慢病毒滴度的增高而递增。RT-PCR方法检测发现MCF-7有目的基因CDglyTK的表达。双自杀基因的疗效优于任一单自杀基因的疗效（P〈0．001）。结论 慢病毒为载体有较高的转染效率，MCF-7细胞对前药的具有较高的敏感性，双自杀基因疗效优于任一单自杀基因。     

单纯疱疹病毒胸苷激酶丙氧鸟苷自杀基因系统对宫颈癌Hela细胞系体外杀伤作用的研究

目的：观察单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)丙氧鸟苷(GCV)自杀基因系统对人宫颈癌Hela细胞系体外杀伤作用及其旁观效应。方法：采用脂质体转染法将GINaTK载体转入包装细胞PA317。取病毒上清液感染Hela细胞,得到带有HSV-TK基因的Hela／TK细胞,并将其用于体外实验。结果：载体HSV-TK导入了PA317细胞。体外实验结果显示,当Hela／TK细胞数占混合细胞10％时,低浓度(10mg／L)的GCV就可将50％左右的肿瘤细胞杀死。GCV作用后的实验组Hela／TK细胞基因组经琼脂糖凝胶电泳后可观察到典型的DNA梯状条带。结论：逆转录病毒可介导HSV-TK基因转入人宫颈癌Hela细胞并获稳定表达,HSV-TK／GCV自杀基因系统在体外对宫颈癌细胞有杀伤作用,且存在明显的旁观效应。     

Killing effect of coexpressing cytosine deaminase and thymidine kinase on rat vascular smooth muscle cells

Background Vascular smooth muscle cell (VSMC) proliferation following arterial injury plays a critical role in a variety of vascular proliferative disorders, such as atherosclerosis and restenosis after balloon angioplasty. Herpes simplex virus-thymidine kinase (HSV-TK)/ganciclovir (GCV) and E.coli cytosine deaminase (CD)/5-fluorocytosine (5-Fc) suicide gene systems have been successfully employed in cardiovascular gene therapy, respectively. We reasoned that coexpression of both HSV-TK with CD suicide genes would lead to increased cell killing. To test this imagine, the adenoviral vectors expressing TK and/or CD genes were developed and tested on vascular smooth muscle cells. Methods Adenoviral vectors, including Ad-EF1α-CD-cytomegolovirus (CMV)-TK coexpressing both CD and TK double suicide genes, Ad-EF1α-CD and Ad-CMV-TK expressing CD and TK respectively, and control vector Ad-CMV-LacZ, were constructed and prepared with homologous recombination in RecA+E.coli cells. Integration and expression of CD and/or TK gene were identified by PCR and Western blot. Primary cultured VSMCs were infected at a multiplicity of infection (MOI) of 20 with exposure to their matching prodrugs 5-Fc and GCV. Cell mortality was measured by methyl thiazolyl tetrazolium (MTT) assays. Flow cytometry analysis was used to detect cell death. Apoptotic cells were analyzed using Hoechst 33342 fluorescence dye as a DNA probe. Genomic DNA cleavage of apoptotic VSMCs was tested by agarose gel electrophoresis. Results Recombinant adenovirus expressing CD and/or TK suicide genes were successfully constructed. Both single and double suicide genes could be integrated into adenoviral genome and expressed. Cytotoxic effects of Ad-EF1α-CD-CMV-TK double suicide genes combined with 5-Fc and GCV were higher than those of Ad-CMV-TK and Ad-EF1α-CD single gene groups. The rate of cell survival was only (9±3)% in the Ad-EF1α-CD-CMV-TK group, but (37±3)% in the Ad-CMV-TK and (46±4)% in the Ad-EF1α-CD groups (P&lt;0.05). Flow cytometry analysis indicated that the killing mechanisms of the groups were different. Necrosis and apoptosis were involved in the mechanism of the double gene group. Based on the DNA stainability with Hoechst 33342, the apoptotic rates of VSMCs in the Ad-EF1α-CD-CMV-TK ［(11.0±2.1)%］ and Ad-CMV-TK ［(12.0±2.2)%］ groups were higher than those in Ad-CMV-LacZ ［(1.2±0.11)%］ and Ad-EF1α-CD ［(5.0±1.8)%］ groups (P&lt;0.05, respctively). DNA smear could be observed in both Ad-CMV-TK and Ad-EF1α-CD-CMV-TK groups after administration of prodrugs. Conclusions The killing effect on rat VSMCs mediated by adenoviral CD/TK double suicide genes is superior to that of single suicide gene. The killing mechanism of recombinant adenovirus coexpressing CD/TK double suicide genes is mainly through cytotoxic effect and apoptosis.     

Effects of apigenin on cell proliferation of human pancreatic carcinoma cell line BxPC-3 in vitro

Objective： To observe the effects of apigenin on cell proliferation of human pancreatic carcinoma cell line BxPC-3 in vitro. Methods：The inhibitive effects of apigenin at different concentrations （0 μmol/L, 100 μmol/L, 200 μmoL/L, and 400 μmol/L） on human pancreatic carcinoma cell line BxPC-3 were detected by MTT assays, transmission electron microscope, agarose gel electrophoresis and flow cytometry. The immunohistochemistry was used to detect the expression of Bcl-2 and Bax gene. Results： Apigenin at different concentrations could inhibit the proliferation of human pancreatic carcinoma cell lines BxPC-3, and the inhibitive effect was dose-dependent. The cell cycle of pancreatic carcinoma cells was arrested at G2/M phase. The results of immunohistochemistry showed that the density of apigenin increased, and the expression of Bcl-2 gene was reduced gradually, At the same time the expression of Bax gene was enhanced. Conclusion ：Apigenin could inhibit the proliferation of human pancreatic carcinoma cell lines BxPC-3 in vitro. The effect of apoptosis was accompanied with the expression of Bcl-2 decrease and Bax increase.     

三氧化二砷联合小白菊内酯的抗胰腺癌作用

目的 研究三氧化二砷和小白菊内酯联合用药对人胰腺癌细胞的抗癌作用及其机制.方法 胎盘蓝拒染法检测细胞活力;利用AnnexinV和PI双染法检测细胞是否发生凋亡,利用DAPI染色法检测细胞核碎片化情况;应用流式细胞仪检测胰腺癌细胞PANC-1和BxPC-3的活性氧水平;应用Western blot技术检测血红素加氧酶...     

Tet-On调控自杀基因治疗系统对乳腺癌细胞的DNA损伤效应

目的:研究重组腺相关性病毒( rAAV)介导的含有Tet-On调控元件的HSV-TK/GCV自杀基因调控治疗系统对人类乳腺癌细胞株MCF-7 DNA损伤的影响及损伤应答的分子机制.方法:彗星实验检测HSV-TK/G CV自杀基因治疗系统对MCF-7 DNA损伤的影响,并对主要的DNA损伤应答的相关活性基因和表达蛋白进行...     

大肠癌细胞的双自杀基因治疗

目的探讨腺病毒介导的双自杀基因对大肠癌细胞的杀伤作用及其放射增敏作用。方法用重组的腺病毒载体感染大肠癌细胞株SW480,用RT-PCR方法检测CD(cytosine deaminase)-TK(thymidine kinase)融合基因的表达,单独或联合给予前体药物GCV和5-FC后,用MTT法测定双自杀基因对大肠癌细胞的体外杀伤效应,用克隆形成实验分析感染有自杀基因的大肠癌细胞的放射增敏作用。结果感染有自杀基因的大肠癌细胞,在给予前体药物后,细胞的存活率明显下降,联合给予GCV和5-FC细胞的存活率较单独给GCV或5-FC存活率明显降低(χ2=30.371,P<0.01);联合使用5-FC和GCV时,CD-TK自杀基因的旁观者效应最明显(P<0.01);使用GCV和(或)5-FC能增加感染有自杀基因的大肠癌细胞对照射的敏感性,在联合使用前体药物时更为明显(P<0.01)。结论CD-TK双自杀基因体系对大肠癌细胞具有显著的杀伤作用和放射增敏作用,证明双自杀基因系统具有临床应用价值。     

慢病毒shRNA靶向干扰RegⅣ基因胰腺癌细胞株的构建

 目的  构建并鉴定再生基因4 (regenerating islet-derived family member 4,RegⅣ)短发夹干扰RNA (short hairpin RNA,shRNA)慢病毒载体,继而建立稳定干扰RegⅣ基因表达的胰腺癌细胞株PANC-1。方法  使用聚合酶链式反应 (polymerase chain reaction,PCR)检测RegⅣ基因在胰腺癌细胞株中的表达情况。构建重组靶向干扰RegⅣ基因的shRNA 慢病毒表达质粒pGC-shRNA-RegⅣ,用脂质体转染的方法将载体导入胰腺癌细胞,建立稳定表达shRNA的细胞株。使用荧光定量PCR检测干扰效率。RegⅣ基因过表达载体的构建方法为:将获取的目的基因与pEGFP-RegⅣ-3FLAG过表达质粒载体分别进行双酶切,利用电泳回收双酶切产物,转化感受态细胞并进行测序验证,验证成功后,使用Western blot检测其在293T细胞中的表达强度。结果  PCR结果显示RegⅣ在PANC-1中表达最高,在BxPC-3中表达最低。测序验证pGC-shRNA-RegⅣ重组质粒构建成功。将重组质粒稳定转染入胰腺癌细胞株PANC-1后能明显抑制RegⅣ mRNA 表达水平。过表达载体pEGFP-N1-3FLAG-RegⅣ合成成功后进行Western blot鉴定,验证pEGFP-N1-3FLAG-RegⅣ过表达载体构建成功。过表达RegⅣ基因转染BxPC-3后,与空质粒组相比,RegⅣ表达量明显提高。结论  成功建立了靶向稳定干扰RegⅣ基因表达的shRNA胰腺癌细胞株PANC-1。     

小干扰RNA阻断MBD1基因对胰腺癌抑癌基因表达的影响

目的 观察阻断MBD1基因对胰腺癌抑癌基因表达的影响,探讨MBD1基因在胰腺癌发生发展中的作用.方法 设计并合成2条MBD1小干扰RNA(siRNA)序列,克隆进入pGCsi-U6/Neo/绿色荧光蛋白(GFP)构建重组质粒.重组质粒和空质粒转染人胰腺癌细胞系BxPC-3,将3组细胞(转染MBD1-siRNA重组质粒组、转染空质粒组和未转染组)接种于裸鼠,8周后取移植瘤行逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测MBD1基因和甲基化相关抑癌基因的表达情况.结果 成功构建MBD1-siRNA重组质粒并稳定转染胰腺癌细胞系BxPC-3,转染组中MBD1基因表达明显低于空质粒组和未转染组,而CDH1、RASSF1A、TIMP3、P14ARF、Rb等甲基化相关抑癌基因的mRNA水平转染组(179.7±8.1、155.6 4±10.0、256.7 ±15.7、199.0±7.9、210.1 q±9.4)要高于空质粒组(21.0±6.8、22.0±2.7、99.4±10.3、86.0±5.4、15.0 ±4.9)和未转染组(11.4±6.0、15.3±1.9、110.7±14.1、74.3±4.8、17.4±7.8,均P<0.05).结论 通过RNA干扰技术,可降低MBD1在胰腺癌中的表达,上调抑癌基因的转录,MBD1介导的转录抑制作用可能在胰腺癌的发生发展中起重要作用.     

逆转录病毒介导的HSV-TK基因系统对人胃癌细胞的转染及杀伤作用逆转录病毒介导的HSV-TK基因系统对人胃癌细胞的转染及杀伤作用

目的：探讨逆转录病毒介导的单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSV-TK）基因系统对人胃癌细胞的转染及杀伤作用。方法 应用PA317细胞包装的逆转录病毒介导的HSV-TK基因系统,在体外以逆转录病毒上清感染法将TK基因导入MKN28人胃癌细胞,并初步观察更昔洛韦（GCV）对转染TK基因的MKN28胃癌细胞的杀伤作用。结果：TK基因可成功转导入MKN28细胞,且对细胞的生长状态无明显影响。但对GCV的敏感性却显增加;同时还观察到显的“旁观效应”。结论：逆转录病毒介导的HSV-TK系统对人胃癌细胞有较高的转染效率,GCV对转染阳性的胃癌细胞有显的杀伤作用。