靶向Trop-2 CAR-T细胞的制备及其体外对卵巢癌细胞杀伤作用的研究

目的：制备靶向人滋养层细胞表面抗原2（human trophoblast cell surface antigen 2 , Trop-2)的嵌合抗原受体T细胞(chimeric antigen receptor T cell , CAR-T）,观察Trop-2 CAR-T细胞在体外对卵巢癌细胞增殖的影响。方法：运用分子克隆及基因重组技术构建Trop-2 CAR;采用Western blot检测Trop-2 CAR在293T细胞中的表达;CCK-8法检测Trop-2 CAR-T细胞对卵巢癌细胞增殖的影响;ELISA检测细胞因子分泌的变化。结果：酶切鉴定及测序分析结果表明,Trop-2 CAR各基因片段连接正确;Western blot检测结果显示,该质粒能够在293T细胞中有效表达;CCK-8结果显示,制备的Trop-2 CAR-T细胞在体外能明显抑制表达Trop-2的卵巢癌细胞的增殖（P＜0.05）;ELISA检测结果表明Trop-2 CAR-T细胞与表达Trop-2的卵巢癌细胞共培养后,干扰素（interferon-γ,IFN-γ)、白介素（interleukin-2,IL-2)细胞因子分泌增加（P＜0.01）。结论：该研究成功制备了Trop-2 CAR-T细胞,可有效抑制Trop-2表达阳性的卵巢癌细胞的增殖。     

表达靶向癌胚抗原的嵌合受体的慢病毒载体构建及初步应用

目的构建表达靶向癌胚抗原(carcinoembryonic antigen,CEA)的嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor,CAR)的慢病毒载体LV-EF1 α-CEA-2A-GFP-WPRE,研究该载体感染T淋巴细胞后嵌合抗原受体的表达以及对CEA阳性肿瘤细胞系的杀伤作用.方法 利用常规分子克隆技术从含靶向CEA的单链化抗体的载体上得到抗CEA抗体的编码序列,通过测序鉴定,采用酶切将基因片段插入慢病毒载体中.慢病毒载体感染T淋巴细胞后,通过非变性非还原Western blot、流式细胞术检测CEA-CAR在T淋巴细胞中的表达,体外杀伤实验检测对CEA阳性肿瘤细胞系的杀伤效果.结果 测序结果显示CEA-CAR的序列正确,酶切结果显示慢病毒载体LV-EF1α-CEA-2A-GFP-WPRE构建正确;感染T淋巴细胞后CEA-CAR阳性表达率为62.8％;可有效杀伤CEA阳性肿瘤细胞系(P＜0.01).结论成功构建了表达靶向CEA的嵌合抗原受体LV-EF1 α-CEA-2A-GFP-WPRE的慢病毒载体,该嵌合抗原受体可在T细胞中正确表达,并有效杀伤CEA阳性肿瘤细胞.     

间皮素与肿瘤诊治的相关研究进展

间皮素是一种细胞表面糖蛋白, 正常组织中很少表达, 但卵巢癌、胰腺癌和恶性间皮瘤等肿瘤组织及血液中高表达.因此, 间皮素有助于间皮瘤、卵巢癌、胰腺癌等肿瘤的早期诊断, 与肿瘤的分期和预后有关.使用抗毒素、抗间皮素嵌合抗体、抗体-药物结合物、嵌合抗原受体T细胞、间皮素肿瘤疫苗等治疗高表达间皮素的肿瘤的方法正在逐步走向成熟.旨在对间皮素在卵巢癌、胰腺癌、恶性间皮瘤诊断与治疗中的作用作一综述.     

嵌合抗原受体G250-CD8-28BBZ的构建及表达

目的 构建嵌合抗原受体G250-CD8-28BBZ的慢病毒表达质粒,并研究该嵌合抗原受体在T细胞中的表达.方法 利用常规分子克隆技术将编码Igκ信号肽、抗G250单链抗体及信号结构CD8-28BBZ的编码序列拼接起来,并将得到的融合基因片段插入慢病毒表达载体pLVX-IRES-ZsGreen中,采用酶切及测序鉴定.慢病毒感染T细胞后,通过荧光显微镜、Western blot、流式细胞术检测G250-CD8-28BBZ在T细胞中的表达.结果 双酶切及测序结果显示重组质粒pLVX-G250-CD8-28BBZ构建正确;慢病毒感染后的T细胞能发出绿色荧光;T细胞表达的G250-CD8-28BBZ分子大小正确;慢病毒感染2周后,G250-CD8-28BBZ在T细胞中的阳性表达率为45.2%.结论 成功构建了嵌合抗原受体G250-CD8-28BBZ的慢病毒表达质粒,该嵌合抗原受体能够在T细胞内高效稳定表达.     

羟基红花黄色素A通过 Wnt/β-catenin 信号通路抑制卵巢癌生长

目的 研究羟基红花黄色素A(hydroxysafflor yellow A, HSYA)对卵巢癌的抑制作用及其机制。方法 HSYA作用卵巢癌细胞株HO-8910PM 24h后,CCK-8法检测细胞增殖;流式细胞术检测细胞凋亡;Western blot法检测卵巢癌细胞中Nuclear β-catenin、menin、MMP7、Survivin蛋白的表达;建立起裸鼠卵巢癌皮下移植瘤模型,免疫组织化学法检测肿瘤组织中menin、MMP7、Survivin阳性表达。结果 与对照组比较,HSYA可明显抑制体外卵巢癌细胞生长,并诱导细胞凋亡;HSYA可抑制卵巢癌细胞Nuclear β-catenin、MMP7、Survivin蛋白表达,而促进细胞内menin蛋白表达;体内实验中HSYA可显著抑制裸鼠卵巢癌皮下移植瘤生长,亦降低卵巢癌组织中MMP7、Survivin的阳性表达,但促进癌组织中menin阳性表达。结论 HSYA可能通过促进menin表达,导致β-catenin降解,减少下游的癌基因MMP-7、Survivin表达,进而抑制卵巢癌细胞的生长,促进其凋亡。     

嵌合锚定T细胞致癌胚抗原阳性胃癌细胞的凋亡效应

目的探讨CEA靶向性嵌合锚定T细胞的制备方法,并检测其活化功能及诱导CEA阳性胃癌细胞的杀伤活性。方法分离外周血单个核细胞（PBMC）,然后用免疫磁珠分离得到CD8^＋T细胞。将重组真核表达载体抗-CEA-scFv-CD3 zeta-pcDNA3．0采用脂质体转染上述T细胞以制备CEA靶向性的嵌合锚定T细胞;用流式细胞仪检测其CD69的表达,以检测嵌合锚定T细胞活化功能;将嵌合锚定T细胞与胃癌细胞HGC-27、SGC-7901共培养,检测后者膜联蛋白V的表达,分析嵌合锚定T细胞致胃癌细胞的凋亡效应。结果将已制备的CEA靶向性嵌合锚定T细胞培养12h、24h后,检测T细胞的活化信号CD69表达率分别为40．5％±3．4％、48．3％±2．8％,证明嵌合锚定T细胞具备活化功能。检测与嵌合锚定T细胞共培养的胃癌细胞HGC-27、SGC-7901,凋亡率分别为47．8％±4．2％、18．7％±2．8％,两者之间有统计学意义（P〈0．05）。结论CEA靶向性嵌合锚定T细胞可特异性识别CEA阳性胃癌细胞并促使后者凋亡,这种治疗策略将为胃癌的临床诊治提供一种有希单的涂释。     

蜂毒素与基因变构IL-2嵌合蛋白的体外生物活性研究

目的:IL-2具有多种与增强免疫功能相关的生物学活性,蜂毒素对多种肿瘤细胞有杀伤作用.文中研究蜂毒素与基因变构IL-2(melittin-88ArgIL-2)嵌合蛋白在体外的生物学活性. 方法:用甲基噻唑基四唑(MTT)法研究纯化制备的melittin-88ArgIL-2嵌合蛋白在体外对T细胞增殖和NK细胞杀伤活性的影响及对人卵巢癌细胞SKOV3生长抑制的作用. 结果:melittin-88ArgIL-2嵌合蛋白在体外可促进T细胞的增值,增强NK细胞的杀伤活性,抑制人卵巢癌细胞SKOV3的生长增殖. 结论:melittin-88ArgIL-2嵌合蛋白在体外具有一定的增强免疫功能和抗肿瘤活性.值得进一步对其体内的生物学活性进行研究,为大规模制备的中试放大研究和临床前期研究提供了资料.     

Celebrex对体内外卵巢癌细胞生长的抑制效应

目的探讨选择性COX-2抑制剂Celebrex体外对人卵巢癌细胞株HO8910增殖及体内对裸鼠卵巢癌原位移植瘤模型生长的抑制效应。方法采用四甲基偶氮唑盐（MTT）法检测Celebrex对人卵巢癌细胞株HO8910生长的影响。建立人卵巢癌原位移植瘤模型,给予Celebrex8周,采用免疫组织化学法和RT-PCR法检测移植瘤组织中COX-2的表达。结果 （1）MTT检测结果显示,COX-2抑制剂与HO8910细胞增殖之间有剂量-效应和时间-效应依赖性;（2）Celebrex干预可抑制裸鼠卵巢癌原位移植瘤生长;（3）免疫组织化学染色和RT-PCR检测结果表明,Ce-lebrex干预组COX-2表达下调（P〈0.05）。结论 COX-2在裸鼠卵巢癌原位移植瘤中表达,COX-2抑制剂在体内体外对卵巢癌细胞生长均有抑制作用。     

腺病毒介导Ad-HSV-TK/GCV自杀基因对人卵巢癌细胞体内杀伤效应研究

目的观察以腺病毒为载体,人端粒酶逆转录酶(hTERT)为启动子的单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)基因重构体Ad-hTERT-HSV-tk联合更昔洛韦(GCV)对人卵巢癌细胞(Skov-3)的体内杀伤作用。方法建立人卵巢癌裸鼠移植瘤模型,Ad-hTERT-HSV-tk经尾静脉注射荷瘤小鼠后,腹腔注射GCV,观察肿瘤体积、质量、肿瘤抑制率、肿瘤体积-时间曲线以及生存期,流式细胞术(FCM)检测SKOV-3的凋亡,Western blot法检测各组肿瘤组织中EGFR蛋白表达。结果自杀基因Ad-hTERT-HSV-tk联合GCV系统对人卵巢癌裸鼠移植瘤生长具有明显抑制作用,对移植瘤的体积和瘤质量的抑制作用明显,并促进SKOV-3细胞凋亡,Ad-hTERT-HSV-tk组EGFR蛋白表达水平较其它三组降低(P<0.05)。结论 Ad-hTERT-HSV-tk联合GCV自杀基因系统在裸鼠体内对Skov-3肿瘤呈显著杀伤作用,其机制可能与下调EGFR蛋白表达相关。     

双氢青蒿素对卵巢癌生长的抑制作用及其机制的研究

目的研究双氢青蒿素对体内外卵巢癌生长的抑制作用及其机制。方法双氢青蒿素卵巢癌细胞株HO-8910PM 24h后,CCK-8法检测细胞增殖;ELISA法检测细胞凋亡;以DCFH-DA为荧光探针检测卵巢癌细胞内活性氧(reactiveoxygen species,ROS)水平;Western blotting检测卵巢癌细胞中keap1蛋白、胞核Nrf2蛋白的表达;建立起裸鼠卵巢癌皮下移植瘤模型,免疫组织化学法检测肿瘤组织中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxi-dase,GPX)的阳性表达。结果与对照组相比,双氢青蒿素可明显抑制体外卵巢癌细胞生长,并明显诱导细胞凋亡;双氢青蒿素可显著下调卵巢癌细胞胞核卵巢癌蛋白表达,而促进细胞内Keap1蛋白表达;化学显示法结果显示,双氢青蒿素使卵巢癌细胞SOD、GPX的活性明显降低;双氢青蒿素亦可明显降低卵巢癌肿瘤组织中SOD和GPX的阳性表达。结论双氢青蒿素可显著抑制卵巢癌细胞的生长,该作用可能通过Nrf2-Keap1信号通路来促进卵巢癌细胞内活性氧的产生,进一步促进细胞凋亡。     

靶向黏蛋白1嵌合抗原受体修饰的Jurkat T细胞特异杀伤肝癌细胞

目的探讨靶向黏蛋白1(mucin 1,MUC1)的嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor,CAR)修饰的T细胞株(CAR-T)对MUC1高表达肝癌细胞的特异杀伤能力。方法分别构建第1代与第3代靶向MUC1的CAR基因表达框(MUC1-CAR与G3MUC1-CAR),并将其装入慢病毒载体,利用获得的重组慢病毒感染Jurkat细胞,通过CCK-8法、ELISA法、乳酸脱氢酶释放实验,分别检测在MUC1抗原存在条件下,CAR-T细胞的增殖、IL-2分泌量、杀伤作用。结果成功构建2种靶向MUC1嵌合抗原受体表达框的重组慢病毒Jurkat CAR-T细胞株。两种Jurkat CAR-T细胞均能特异识别MUC1分子,杀伤MUC1高表达的肝癌细胞QGY-7701,而对MUC1低表达的正常肝细胞基本不杀伤;第3代CAR修饰的Jurkat T细胞接触MUC1分子后,其增殖速度、IL-2分泌量和杀伤效率均优于第1代MUC1修饰细胞(P<0.05或P<0.01)。结论靶向MUC1的Jurkat CAR-T细胞能特异杀伤MUC1高表达的肝癌细胞。     

靶向ROR1的嵌合抗原受体修饰T细胞的构建及对ROR1阳性肿瘤细胞的杀伤作用

目的探讨靶向Ⅰ型受体酪氨酸激酶样孤儿受体(ROR1)的嵌合抗原受体修饰的T细胞（chimeric antigen receptor T cell,CAR-T）治疗ROR1阳性肿瘤细胞的体外杀伤作用。方法设计并合成CAR基因,通过慢病毒载体质粒pWPXLd,构建靶向ROR1 的CAR-T核心质粒,采用BamHⅠ/EcoRⅠ双酶切鉴定,应用流式细胞术检测多种实体瘤癌细胞株表面ROR1的表达,并采用流式细胞术、乳酸脱氢酶(LDH)检测试验检测CAR-T对ROR1阳性肿瘤细胞的杀伤作用,ELISA检测试剂盒测定培养细胞上清中γ-干扰素(IFN-γ)含量。结果构建的CAR-T质粒双酶切鉴定有CAR基因插入,流式细胞术检测结果显示CAR-T感染效率约为47.23%。多种肿瘤细胞不同程度表达ROR1。流式细胞术、LDH检测试验结果提示CAR-T能特异性地杀伤ROR1阳性肿瘤细胞。CAR-T针对ROR1阳性靶细胞能释放更多的IFN-γ（P<0.05）。结论成功构建靶向ROR1的CAR-T,并能特异地杀伤ROR1阳性肿瘤细胞,释放大量IFN-γ,为临床应用提供了实验基础。     

miR-26a通过调节MTDH基因表达抑制CAOV3细胞系生长

目的 检测miR-26a在卵巢癌组织的表达改变,明确miR-26a调控卵巢癌细胞生长的分子机制.方法 运用qRT-PCR检测52例卵巢癌及相应癌旁组织中miR-26a的表达改变;将miR-26a mimics转染卵巢癌细胞CAOV3,以MTDHsiRNA为阳性对照,采用Western blot检测其对MTDH蛋白表达水平的影响;然后采用MTT法检测高表达miR-26a对CAOV3细胞生长增殖的影响. 结果 qRT-PCR检测结果显示,miR-26a在52例卵巢癌组织中表达下调;Western blot结果显示,过表达miR-26a或干扰MTDH可抑制MTDH蛋白的表达.MTT检测发现,过表达miR-26a或干扰MTDH可抑制人CAOV3细胞的生长（P＜0.05）. 结论 miR-26a通过调节MTDH基因的表达而抑制卵巢癌细胞的生长.     

钠碘转运体报告基因共表达对嵌合型受体T细胞体外增殖及杀伤能力的影响

目的 探讨钠碘转运体（NIS）报告基因的共表达对嵌合型受体T（CAR-T）细胞体外增殖和杀伤活性的影响。方法 慢病毒感染法制备CAR-T细胞（仅表达CD19 CAR的T细胞）、NIS-T细胞(仅表达NIS报告基因的T细胞)和NIS-CAR-T细胞（共表达NIS和CD19 CAR的T细胞）,然后按T细胞蛋白表达情况分为4组∶T细胞组（未转染的T细胞）、CAR-T组、NIS-T组、NIS-CART组。流式细胞术检测各组NIS和CAR转染率。各组细胞常规培养24、48、72 h,CCK-8法检测增殖能力。各组T细胞为效应细胞,Nalm6肿瘤细胞为靶细胞,按效靶比0.5∶1、1∶1、2∶1、4∶1共培养24、48、72 h,乳酸脱氢酶细胞毒性检测法（LDH）检测各组细胞对肿瘤细胞的杀伤率,酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测共培养上清液中各组细胞因子人干扰素-γ（IFN-γ）和人肿瘤坏死因子-β（TNF-β）释放水平。摄碘实验检测表达NIS蛋白各组细胞的NIS功能。结果 CAR-T细胞、NIS-CAR-T细胞的CAR转染率分别为91.91%、99.41%,NIS-T细胞、NIS-CAR-T细胞的NIS转染率分别为47.83%、50.24%。常规培养24、48、72 h CAR-T细胞与NIS-CAR-T细胞增殖率差异无统计学意义（P>0.05）。0.5∶1、1∶1、2∶1和4∶1效靶比作用24 h时CAR-T细胞杀伤率（%）均高于NIS-CAR-T细胞（P<0.05）,作用48 h和72 h时两组杀伤率差异均无统计学意义（P>0.05）。CAR-T细胞与NIS-CAR-T细胞均存在IFN-γ和TNF-β释放现象,释放水平均高于对照组（P<0.05）。NIS-T细胞与NIS-CAR-T细胞均具有特异性摄碘能力,二者间摄碘能力差异无统计学意义（P>0.05）,但均高于对照组T细胞（P<0.05）。结论 NIS报告基因的共表达不影响CAR-T细胞中CAR转染率,对细胞增殖和杀伤活性无抑制现象。     

miR-206/CDK4信号在卵巢癌生长和化疗增敏中的作用

探讨 miR-206/CDK4信号在卵巢癌生长和化疗增敏中的作用.方法 分别提取卵巢癌和癌旁组织总RNA并将它们逆转录成cDNA.实时荧光定量PCR检测miR-206在卵巢癌和癌旁组织中差异表达.在将miR-206 mimic和其特异抑制剂以及它们各自对照分别转染卵巢癌细胞后,MTT和流式细胞仪用于检测细胞增殖和细胞周期的改变.Western blot和荧光素酶报告基因活性分析鉴定miR-206的靶基因和其调控信号通路.miR-206诱导5-Fu对卵巢癌细胞化疗增敏作用被鉴定.结果 荧光定量PCR分析显示,miR-206在卵巢癌组织中表达明显下调.在转染miR-206 mimics后,细胞的增殖明显抑制,细胞周期也出现G/S转化障碍.机制分析显示,miR-206 mimic能明显抑制CDK4,c-Myc和CCNDl表达.与之相反,在使用miR-206特异抑制剂后,细胞的增殖能力明显恢复,而CDK4表达能明显增高.荧光素酶报告基因活性分析显示,miR-206能直接结合CDK43'UTR.药敏分析显示,miR-206能明显降低IC50值(P＜0.001),从而增加5-Fu对卵巢癌细胞的敏感性.结论 miR-206作为候选抑癌基因,直接靶击CDK4基因,从而抑制了卵巢癌细胞生长,并诱导了5-Fu对卵巢癌细胞的化疗敏感性.     

人孕酮受体膜组分1表达载体的构建及其重组蛋白对体外血管形成的诱导作用

目的: 构建含人孕酮受体膜组分（progesterone receptor membrane component,PGRMC）1的重组表达质粒,转染人卵巢癌细胞,研究其调控卵巢癌细胞血管生成的作用。方法: 以卵巢癌细胞为模板,采用PCR技术扩增PGRMC1基因编码序列,插入真核载体pSecTag-2B构建重组表达载体;然后,将重组载体pST PGRMC1分别转染人胚肾上皮细胞HEK293T和卵巢癌细胞SKOV-3,采用蛋白质印迹法检测PGRMC1蛋白的表达;实时荧光定量PCR检测卵巢癌细胞中VEGF mRNA的变化,用ELISA法检测上清液中VEGF的分泌情况。体外血管生成实验进一步观察PGRMC1促进体外血管生成的情况。结果： 重组表达载体pST PGRMC1构建成功,重组蛋白PGRMC1在HEK293T和SKOV-3细胞中都能够表达;PGRMC1过表达可促使卵巢癌细胞合成VEGF,并且促进体外血管的形成。结论： 重组蛋白PGRMC1在促进卵巢癌细胞体外血管形成中起着重要作用,可能促进卵巢癌细胞的远处转移。     

促卵泡激素通过活性氧途径调控卵巢癌细胞Nrf2蛋白的表达

目的 通过观察促卵泡激素(FSH)、活性氧(ROS)及其特异性抑制剂对卵巢癌细胞中红系衍生的核因子2相关因子2(nuclear factor-erythroid 2-related factor-2,Nrf2)表达的影响,探讨FSH是否通过ROS途径调控卵巢癌细胞Nrf2的表达.方法 (1)采用免疫组织化学方法检测Nrf2在卵巢癌良恶性组织中的表达.(2)用不同浓度的FSH刺激卵巢癌Hey细胞不同时间,采用蛋白质印迹法检测细胞内Nrf2蛋白的表达.(3)采用ROS检测试剂盒检测80 mIU/ml的FSH刺激后不同时间Hey细胞内ROS的生成情况.(4)Hey细胞经不同浓度的H2O2刺激48 h后,或经ROS特异性抑制剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)预处理后加入150 mmol/L的H2O2处理48 h,观察细胞内Nrf2的表达.(5)Hey细胞经不同浓度的NAC预处理1h,加入80 mIU/ml的FSH共孵育48 h,观察细胞内Nrf2表达的变化.结果 (1)10例良性卵巢囊肿组织中仅3例有Nrf2蛋白的弱阳性表达,而64例卵巢癌组织中42例(65.6％)有Nrf2蛋白的阳性表达,两组差异有统计学意义(P=0.042).(2)FSH可上调Hey细胞内Nrf2的表达,并呈一定的剂量、时间依赖效应.(3) FSH可促进Hey细胞ROS的产生.(4) H2O2可诱导Hey细胞Nrf2蛋白的表达,且其作用可被NAC阻断.(5)NAC可阻断FSH所诱导的Nrf2蛋白的表达.结论 FSH可促进卵巢癌Hey细胞中ROS产生,上调Nrf2蛋白表达,抑制ROS途径可阻断FSH诱导的Nrf2高表达.提示FSH可能通过ROS途径调控卵巢癌Nrf2的表达,进而促进肿瘤发生.     

葡萄糖调节蛋白78在卵巢癌侵袭转移中的作用

目的探讨葡萄糖调节蛋白78（GRP78）在卵巢癌侵袭转移中的作用。方法免疫组织化学法检测60例卵巢浆液性癌和40例卵巢浆液性囊腺瘤组织中GRP78的表达情况,Western blotting法检测GRP78的表达水平,分析GRP78的表达与卵巢浆液性癌临床病理指标之间的关系。采用Transwell小室法检测HO-8910细胞和HO-8910PM细胞侵袭、迁移能力;分别使用shRNA-GRP78干扰和pcDNA-GRP78过表达GRP78检测HO-8910PM细胞和HO-8910细胞侵袭、迁移能力的变化。结果免疫组织化学结果显示,GRP78在卵巢浆液性癌组织中的阳性表达率为90%,明显高于卵巢浆液性囊腺瘤的25%（P＜0.01）。GRP78在卵巢浆液性癌组织中表达水平高于卵巢浆液性囊腺瘤组织。GRP78表达水平高的卵巢浆液性癌病人,临床病理分级、分期更高,糖类抗原125水平更高,且发生淋巴结转移、盆腔转移、盆腔外转移的病人比例更高（P＜0.01）。体外研究结果显示,GRP78在高转移潜能的HO-8910PM细胞中的表达明显高于低转移潜能的HO-8910细胞（P＜0.01）。在HO-8910细胞中过表达GRP78可明显促进细胞的侵袭、迁移能力,而在HO-8910PM细胞中干扰GRP78的表达可明显降低细胞的侵袭、迁移潜能（P＜0.01）。结论卵巢癌组织中GRP78可促进卵巢癌细胞的侵袭、迁移能力。     

HSV-TK/GCV系统对卵巢癌细胞OVCAR3杀伤作用的研究

目的评价HSV—TK／GCV系统对卵巢癌细胞OVCAR3的杀伤作用及旁观者效应。方法用含HSV—TK重组腺病毒载体转染人卵巢上皮性癌细胞OVCAR3，用四甲基偶氮唑蓝（MTT）法计算细胞存活率以评价杀伤作用；转染的OVCAR3细胞（TK^＋）与未转染的OVCAR3细胞（TK^-）以不同比例混合，再加入GCV，MTT法计算细胞存活率以评价旁观者效应。结果HSV—TK／GCV系统可明显杀伤OVCAR3细胞，在感染复数（MOI）为100时，平均细胞存活率为26％；HSV—TK／GCV系统对该细胞的杀伤作用有明显的“旁观者效应”，当TK^＋细胞占10％、20％、30％、40％、50％时，细胞平均存活率分别为82％、52％、41％、35％、32％。免疫细胞化学检测OVCAR3细胞的细胞膜上有Cx43的表达。结论HSV—TK／GCV系统对人卵巢上皮性癌细胞OVCAR3有明确的杀伤作用及旁观者效应。     

曲美替尼在卵巢癌中对PAX8的表达作用

目的 探究MEK抑制剂—曲美替尼在卵巢癌中对PAX8表达的作用。 方法 应用基因富集分析(GSEA)检测卵巢癌细胞经曲美替尼处理后相关基因表达的差异,蛋白免疫印迹法、免疫荧光染色和实时荧光定量PCR检测曲美替尼对卵巢癌细胞PAX8蛋白表达和PAX8 mRNA的影响;结晶紫染色法检测曲美替尼对卵巢癌细胞增殖的影响;蛋白免疫印迹法、实时荧光定量PCR和CCK8实验检测干扰KRAS突变卵巢癌细胞ELK1基因后PAX8表达及细胞增殖的变化。 结果 GSEA结果显示,曲美替尼使卵巢癌细胞的KRAS基因和ELK1基因表达下调(P<0.01);实时荧光定量PCR结果显示,曲美替尼能抑制KRAS突变卵巢癌细胞中PAX8的转录(P<0.001);结晶紫染色法结果显示,曲美替尼处理后的KRAS突变卵巢癌细胞的增殖能力降低;蛋白免疫印迹法结果显示,曲美替尼能抑制KRAS突变卵巢癌细胞PAX8基因和ELK1基因表达(P<0.001),干扰KRAS突变卵巢癌细胞ELK1基因能抑制PAX8基因的表达(P<0.001);CCK8结果显示,干扰ELK1基因表达可抑制KRAS突变卵巢癌细胞增殖(P<0.05)。 结论 曲美替尼在KRAS突变的卵巢癌中通过ELK1抑制PAX8表达及细胞增殖。