问号赖型钩端螺旋体内鞭毛蛋白与外膜蛋白基因融合DNA疫苗载体的构建

目的 为增强问号赖型钩端螺旋体（钩体017株）DNA疫苗内鞭毛蛋白基因（flaB2)与外膜抗原基因（ompL1)的免疫保护作用，构建一种能表达flaB2与omPL1蛋白融合蛋白的DNA疫苗载体。方法 通过聚合酶链反应分别扩增017钩体flaB2与ompL1片段并进行融合，获得的嵌合基因ompL1-flaB2中含有10个氨基酸的中间接头序列，以维持其空间构象，结果 经酶切鉴定，证实有一1.8kb片段插入载体，其flaB2及ompL1DNA测序结果与文献报道的一致。结论 表达017株钩体flaB2与ompL1抗原融合蛋白的DNA疫苗载体构建成功。     

活体电穿孔导入法增强恶性疟原虫核酸疫苗免疫反应研究

目的 采用活体电穿孔免疫方法,研究恶性疟原虫DNA核酸疫苗不同免疫剂量对于动物免疫反应的影响,并对载体中CpG寡脱氧核苷酸基序的免疫刺激活性进行了初步探讨。方法 将恶性疟原虫多表位嵌合抗原M.RCAg-1基因克隆于真核表达载体VR1012中,使用电穿孔导入方法免疫小鼠,采用ELISA检测抗体效价、ELISPOT测定细胞因子分泌水平,探索基因疫苗最佳免疫剂量以及考察免疫反应类型。使用计算机分析恶性疟核酸疫苗中特殊CpG基序组成,实验验证基因疫苗中CpG基序的免疫刺激活性。结果 相同DNA免疫剂量下,电穿孔免疫法与单纯肌内注射免疫法相比较,小鼠血清IgG抗体效价提高118倍,且能显著诱导体内特异性Th1和Th2型细胞反应。电穿孔免疫小鼠血清可识别天然虫体抗原,抗体效价可达1：1200。恶性疟原虫核酸疫苗抗原DNA含有24个CpG免疫活性基序,可以有效的刺激人外周血单个核细胞（PBMCs）增殖与IL-6分泌。结论 活体电穿孔方法可以显著提高恶性疟原虫DNA疫苗体液免疫和细胞免疫水平。     

CpG基序在人食管癌Eca-109细胞疫苗中的佐剂效应

目的：探讨CpG基序在人食管癌Eca-109细胞疫苗中的佐剂效应。方法：培养Eca-109细胞,用酸洗法收集细胞膜表面小肽,再用去盐、浓缩、超滤法纯化这些小肽后,以此刺激人外周血树突状细胞（DC）作为人食管癌疫苗,不用小肽刺激的DC作为对照疫苗,并用这些疫苗加佐剂CpG基序激活纯化的T细胞。实验分组：①CpG基序加食管癌疫苗组（CpG—Ve）;②CpG基序加食管癌对照疫苗组（CpG—Vc）;③单纯食管癌疫苗组（Ve）;④单纯食管癌对照疫苗组（Vc）;⑤单纯CpG基序刺激组;⑥直接用纯化的T细胞加Eca-109细胞作效应对照组。用^3H渗入法对各组行T细胞增殖试验,用^51Cr释放试验测定各组细胞毒性T淋巴细胞（CTL）的活性。结果：CpG-Ve组的T细胞增殖活性和CTL对Eca-109细胞杀伤率均高于其余各组（P〈0．01）。结论：CpG基序可能是人食管癌疫苗研究中的有效佐剂。     

T淋巴瘤TCR β链独特型DNA疫苗诱发小鼠体液免疫反应

目的：研究T淋巴瘤TCRβ链独特型DNA疫苗诱发小鼠体液免疫反应。方法：大剂量提取质粒，将BALB／c小鼠随机分为pcNSA3．1组、pcDNA3．1／TCRVβ8组、pcDNA3．1／TCRVβ8＋IL－2组、pcDNA3．1／TCRVβ8＋CpG＋脂质体组和全硫代CpG组共5组（每组6），双侧股四头肌内注射疫苗免疫，于第0、2、4周各免疫1次，共3次。每次免疫前及免疫开始后至第8周，取鼠血，应用间接免疫荧光检测小鼠抗体生成情况。结果：pcDNA3．1／TCRVβ8组、pcDNA3．1／TCRVβ8＋CpG＋脂质体组、pcDNA3．1／TCRVβ＋IL－2组小鼠血清中均产生了特异性抗独特型抗体，抗体滴度在第4周开始增高，第6周时达到高峰。在同一取血时间，pcDNA3．1／TCRβV8＋CpG＋脂质体组和pcDNA3．1／TCRVβ8＋IL－2组小鼠抗体滴度均高于pcDNA3．1／TCRβ8组（P＜0．001。结论：DNA重组质粒pcDN3．1/TCRVβ8可诱导小鼠产生特异性抗体淋巴瘤细胞的独特型抗体；IL－2、CpG和脂质体增强了TCRVβ8基因疫苗诱导的体液免疫反应。     

一株输血传播病毒新变种的克隆和序列分析

目的：从1例不明原因转氨酶升高的病人血清中克隆输血传播病毒（TTV）DNA，并进行序列分析。方法：用巢式PCR扩增TTVDNA长片段，连接至pGEM-T载体上，挑选一个克隆（56－B）进行测序，将56－B与GenBank中五株TTV进行氨基酸和核苷酸序列的同源性分析，并用最大似然法进行分子进化分析。结果：56－B株与TA278等五株TTV序列的核苷酸同源性分别为42．4％，48．2％，47．9％，61．7％，氨基酸序列的同源性更低，但其5'，和3'两端非编码区的序列仍然很保守。结论：56－B株与其他TTV株之间的同源性很低，有很高的基因异质性，是TT的一个新变种，代表TTV的一个新的基因型。     

T淋巴瘤TCRβ链独特型DNA疫苗在小鼠骨骼肌中的基因蛋白表达

目的：检测T淋巴瘤TCRβ链独特型DNA疫苗的基因表达。方法：大剂量提取质粒，将BALB／c鼠随机分为pcDNA3．1组、pcDNA3．1／TCRVβ8组、pcDNA3．1／TCRβ8＋IL－2组、pcDNA3．1／TCRVβ8＋CpG＋脂质体组和全硫代CpG组共5组（每组6只），双侧股四头肌内注射疫苗免疫，于第0、2、4周各免疫1次，共3次。接种疫苗后5d，用RT－PCR法检测重组质粒mRNA表达。接种疫苗后7d应用免疫组化检测重组质粒蛋白表达。结果：pcDNA3．1／TCRVβ8组、pcDNA3．1／TCRVβ8＋IL－2组、pcDNA3．1／TCRβ8＋CpG＋脂质体组小鼠骨骼肌中均显示mRNA和蛋白表达，而pcDNA3．1组和全硫代CpG组未见mRNA和蛋白表达。结论：T淋巴瘤TCRβ链独特型DNA疫苗在小鼠骨骼肌中有效地表达了基因产物。     

猪白细胞介素4的基因克隆及其在囊尾蚴DNA疫苗中的应用

目的：克隆猪白细胞介素4（IL－4）cDNA，观察其在抗囊尾蚴免疫中的疫苗佐剂作用。方法：通过RT－PCR法获得带有5'AUG侧翼翻译优化突变序列的猪IL－4 cDNA，测序后重组入真核表达载体pcDNA，在体外瞬时表达的基础上与囊尾蚴保护性抗原DNA疫苗联合免疫仔猪。结果：获得的猪IL－4cDNA列与献报道的完全一致，在体外瞬时表达中获得了有生物学活性的猪IL－4。其与囊尾蚴保护性抗原DNA疫苗联合应用可有效提高个体体液免疫应答水平。结论：构建了一高效表达猪IL－4的真核表达质粒，初步实验证实了其在抗囊尾蚴DNA疫苗中的佐剂效应。     

人CpG-寡脱氧核苷酸对质粒DNA免疫刺激活性的影响

目的：研究人CpG寡脱氧核苷酸（CpG-ODN)对DNA疫苗质粒骨架免疫刺激活性的影响。方法：将多拷贝对人和小鼠均有免疫刺激活性的CpG2006序列导入质粒骨架,并在小鼠模型体内外评价重组质粒DNA的免疫刺激活性。结果：首先构建了质粒pMini,仅含有卡那抗性基因和pUC18复制起点,然后向pMini中导入了多拷贝对小鼠具有交叉免疫刺激活性的人CpG2006拷贝数的增加,质粒DNA在体外活化小鼠脾细胞分泌IgM的能力逐步增强,但诱生IFN－γ的能力却依次降低,用重组质粒DNA作为HBsAg疫苗佐剂,免疫BALB／c小鼠,pMini和pCpG11对特异性总抗体以及IgG1亚型抗体水平无明显影响（P＞0．05）,但pCpG26能够使两类抗体水平分别提高3倍（P＜0．001）和2倍（P＜0．02）,所有质粒DNA均能够使IgG2a亚型抗体水平提高5－10倍,但三者之间差异无显著意义（P＞0．05）,结论：向质粒骨架中导入一定数量的人CpG-ODN能够增强质粒DNA的免疫刺激活性。     

CpG-ODN调节小鼠免疫细胞对HBsAg体液免疫应答性的初步研究

目的：初步探寻能够刺激小鼠免疫系统产生针对HBsAg的体液免疫应答的最佳CpG-ODN序列。方法：应用正交设计法设计含有不同序列的10例CpG-ODN免疫小鼠，以研究影响CpG-ODN免疫活性的6个因素；免疫时间，CpG基序侧翼核苷酸、5‘‘‘‘‘‘‘‘-poly(A)、硫代修饰，回文结构和CpG-基序数量，筛选出量优组合的CpG-ODN。结果：10例CpG-ODN与HBsAg一起免疫小鼠均可不同程度地诱导小鼠抗HBsAg抗体水平的变化，显示出CpG-ODN较强的佐剂效应。结论：CpG-ODN与HBsAg一起免疫小鼠可诱导小鼠产生强烈的抗体应答，以六个因素均存在时CpG-ODN的免疫刺激活性较强，即10号序列5‘‘‘‘‘‘‘‘-AAAAAACGTTAACGTT-3’为本实验中刺激小鼠免疫系统产生针对HBsAg的体液免疫应答的最佳序列。     

肺癌组织中黑色素瘤抗原-3基因mRNA的表达

目的：检测肺癌组织中黑色素瘤抗原－3基因（MAGE－3）mRNA的表达，方法；用逆转录－套式聚合酶链反应（RT－PCR）对31例肺癌患者癌组织和相应癌旁组织MAGE－3 mRNA表达情况进行测定；PE－377DNA测序仪对5例10个RT－PCR扩增产物中的目的基因片段进行DNA序列测定。结果：31例肺癌患者癌组织中26例表达MAGE－3 mRNA，阳性率为83.9%；相应的癌旁组织均未表达。DNA序列测定证明PCR扩增产物中目的基因片段均为MAGE－3 cDNA序列，所测5例样本中4例样本有2个相同位置的碱基发生了点突变，导致一个氨基酸残基改变。结论：（1）MAGE－3 mRNA在肺癌中呈高比例表达，提示此抗原有可能作为肺癌患者免疫治疗的靶抗原；（2）我国肺癌患者中存在MAGE-3基因个别位点的变异。     

一种钩端螺旋体DNA疫苗的免疫原性和免疫保护性研究

为了研究赖型钩体内鞭毛蛋白基因在动物体内的表达及其免疫保护性,采用ＰＣＲ扩增内鞭毛蛋白编码基因,以表达质粒ＶＲ１０１２为载体,构建了含有钩体的内鞭毛基因的重组质粒。在新西兰大白兔四头肌内注射该重组质粒ＤＮＡ５００μｇ／只,重复３次,每次间隔３周,于每次注射前和末次注射后３周,检测血清抗赖型钩体抗体效价。结果显示：在第１次加强免疫注射后３周,试验组血清抗体效价显著增高。豚鼠免疫保护试验表明,该ＤＮＡ重组质粒有明显免疫保护作用,在无佐剂条件下试验组存活率为９０％（９／１０只）。本研究为钩体核酸疫苗研制奠定了基础。     

一种钩端螺旋体DNA疫苗的免疫原性和免疫保护性研究

为了研究赖型钩体内鞭毛蛋白基因在动物体内的表达及其免疫保护性。采用ＰＣＲ扩增内鞭毛蛋白编码基因,以表达质粒ＶＰ１０１２为载体,构建了合有钩体的内鞭毛基因的重组质粒,在新西兰大白兔四头肌内注射该重组质粒ＤＮＡ５００μｇ／只,重复３次,每次间隔３周,于每次注射前和末次注射后３周,检测血清抗赖型钩体抗体效价,结果显示,在第１次加强免疫注射后３周,试验组血清抗体效价显著增高,豚鼠免疫保护试验表明,该ＤＮＡ     

日本血吸虫复合DNA疫苗的组织表达及免疫保护效果研究

目的 :观察本课题组所构建日本血吸虫大陆株复合DNA疫苗VR10 12 SjGST和VR10 12 SjGST Sj32在小鼠肌肉组织中的表达 ,并进行免疫保护效果测定。方法 :用纯化质粒免疫昆明鼠 :4 8只小鼠分为 4组 ,两个对照组的小鼠分别于股四头肌注射生理盐水 10 0 μl或空质粒VR10 12 10 0 μg,两个实验组的小鼠则同法分别注射VR10 12 SjGST和VR10 12 SjGST Sj32各 10 0 μg。末次免疫后 ,每组解剖两只小鼠 ,以间接免疫荧光法观察SjGST、Sj32在肌肉组织中的表达。其余每只鼠经腹部感染 10条尾蚴 ,4 5d后剖杀计数各小鼠成虫数和肝卵数。结果 :小鼠肌肉组织表达出抗原特异性蛋白质抗原分子。与生理盐水组比较 ,两个实验组的减虫率分别为 33.9%和及 2 7.14 %(均为P <0 .0 5 ) ,减卵率分别为 6 1.86 %和 6 8.87% (均为P <0 .0 0 1)。与VR10 12 SjGST组相比 ,VR10 12 SjGST Sj32组的减卵率为 18.5 1% (P <0 .0 5 )。结论 :DNA疫苗VR10 12 SjGST和VR10 12 SjGST Sj32能在组织中正常表达 ,能诱导小鼠产生一定水平的抗日本血吸虫感染保护作用 ,复合疫苗的保护效果要大于单价疫苗     

硫代修饰的CpG基序及IL一2表达质粒对癌胚抗原DNA疫苗诱导抗体的影响

目的　探讨增强癌胚抗原DNA疫苗在BALB/c小鼠体内诱导的体液免疫应答的方法。方法　将合成的、经硫代修饰的CpG基序和IL - 2表达质粒分别作为免疫刺激剂与癌胚抗原 (CEA)DNA疫苗一起肌肉注射小鼠 ,ELISA法检测动物体内产生CEA和抗 -CEA的水平。结果　单独以CpG基序或IL - 2表达质粒做免疫刺激剂均不能增加CEA的表达 ,但都能促进抗 -CEA的产生 (P <0 .0 5 )。结论　CpG基序和IL - 2表达质粒对DNA疫苗产生抗体有促进作用     

钩端螺旋体DNA疫苗pcD-flaB的构建及其免疫机制的初步研究

观察钩端螺旋本ＤＮＡ疫苗的保护效果,并探讨疫苗的免疫机制。方法：应用定向克隆的方法构建ＤＮＡ疫苗ｐｃＤ－ｆｌａＢ,肌肉途径免疫豚鼠,观察豚鼠攻击感染钩体后保护率,以ＥＬＩＳＡ法检测特异性抗体ＩｇＧ工观察疫苗对豚鼠腹腔巨噬细胞分泌的ＴＮＦ活性的影响。结果该疫苗对同型钩体的保护率为１００％,特异性抗体水平在疫苗注射第６周达到高峰,ＴＮＦ的活性明显增高。结论：ＤＮＡ疫苗ｐｃＤ－ｆｌａＢ对同型钩体感染有较     

Enhancement of DNA vaccine-induced immune responses by a 72-bp element from SV40 enhancer

Background Although DNA vaccine is considered as the next generation of vaccine, most DNA vaccine candidates are still suffering from the relatively weak immunogenicity despite the increased dosage of plasmid DNA administered. In order to enhance the immune responses elicited by a codon-optimized HIV gag DNA vaccine, a modified plasmid vector pDRVI1.0 and a booster immunization with replicating Tiantan vaccinia （RTV） strain expressing the same gene were employed. Methods Vector pDRVI1.0 was constructed through inserting the 72-bp element from the SV40 enhancer, which was reported promoting nuclear transport of plasmid DNA, to the upstream of cytomegalovirus enhancer/promoter region of the plasmid vector pVR1012. Gene expression levels from expression plasmids based on pDRVI1.0 and pVR1012 were tested. Humoral and cellular immune responses induced by DNA vaccine alone or DNA prime-RTV boost regimen were determined in mice. Results It was shown that the 72-bp element significantly enhanced the gene expression level in non-dividing cells. gag-specific humoral and cellular immune responses induced by DNA vaccination were both significantly improved, while the Thl/Th2 balance was not obviously affected by the 72-bp element. RTV boosting further significantly enhanced DNA vaccine-palmed antibody and T cell responses in a Thl-biased manner. Conclusions The 72-bp SV40 enhancer element should be included in the DNA vaccine vector and RTV strain is a very efficient live vector for boosting immunization.     

问号赖型钩端螺旋体内鞭毛蛋白与外膜蛋白基因融合DNA疫苗载体的构建

目的　为增强问号赖型钩端螺旋体 (钩体 0 17株 ) DNA疫苗内鞭毛蛋白基因 (fla B2 )与外膜抗原基因 (omp L1 )的免疫保护作用 ,构建一种能表达 fla B2 与 om p L1 蛋白融合蛋白的 DNA疫苗载体。方法　通过聚合酶链反应分别扩增 0 17钩体 fla B2 与 omp L1 片段并进行融合 ,获得的嵌合基因 om p L1 - fla B2 中含有 10个氨其酸的中间接头序列 ,以维持其空间构象。结果　经酶切鉴定 ,证实有一 1.8kb片段插入载体 ,其 fla B2 及 om p L1 DNA测序结果与文献报道的一致。结论　表达 0 17株钩体 fla B2 与 om p L1 抗原融合蛋白的 DNA疫苗载体构建成功