反义端粒酶RNA与1,25-(OH)2D3抑制肝癌细胞增殖的协同作用

[目的]观察1,25-(OH)2D,对转染反义端粒酶RNA的肝癌细胞增殖的作用.[方法]经脂质体介导,将反义端粒酶RNA真核表达载体pBBS212-hTR导入维生素D,受体(VDR)阳性的肝癌细胞株SMMC7721细胞中培养.细胞克隆转移扩大培养,添加1,25-(OH)2D3分别作用于各实验组细胞后,采用四唑蓝比色实验...     

反义端粒酶RNA抑制肝癌细胞生长的机制

目的：观察反义端粒酶RNA对SMMC－7721肝癌细胞系的作用,探讨抗端粒端治疗在原发性肝癌治疗中的意义。方法：采用脂质体介导的方式将反义端粒酶RNA真核表达载体pBBS212/hTP转入SMMC7721细胞中,经潮霉素筛选,克隆细胞株扩增鉴定后,采用TRAP－PCR－ELISA,FCM及电镜检测反义端粒酶RNA对转染细胞端粒酶活性和细胞凋亡的影响;同时进行裸鼠荷瘤生长实验观察。结果：TRAP－PCR－ELISA法检测细胞端粒酶活性的结果为：实验组吸光度值为0．980,对照组吸光度值为2．861;FCM检测细胞凋亡结果为：实验组13．8％,对照组未见有凋亡峰形成,电镜观察发现转染细胞表现出典型的凋亡细胞形态。裸鼠移植瘤生长实验发现,转染细胞生长明显受到抑制作用,说明反义端粒酶RNA显抑制SMMC7721细胞的端粒酶活性,并且对其有显的促凋亡作用。结论：反义端粒酶RNA能有效地抑制肝癌细胞端粒酶活性,同时显促进癌细胞凋亡。     

反义端粒酶RNA对肺癌细胞A549抑制作用研究

目的 探讨反义人端粒酶RNA(human telomeric,RNA,hTR)对肺癌细胞A549端粒酶活性和细胞增殖的抑制作用，研究以端粒酶为靶的肺癌基因治疗的可能性。方法 将端粒酶hTR的cDNA反向插入到逆转录病毒载体pLXRN中，转染包装细胞PT67后获得反义hTR重组病毒，感染肺癌细胞A549。处理前后采用TRAP法检测端粒酶活性，光镜观察细胞形态，DNA电泳观察凋亡情况。结果 作用后端粒酶活性和细胞增殖受到明显抑制，并出现明显的细胞凋亡。结论 反义hTR 对肺癌细胞A549端粒酶活性具有明显的抑制作用，使肺癌细胞A549生长抑制，促进细胞凋亡。     

脂质体介导端粒酶反义RNA对人乳腺癌细胞MCF-7活性及增殖的影响

目的:探讨经脂质体介导转染端粒酶反义RNA对MCF-7细胞端粒酶活性及细胞增殖的影响。方法:用脂质体介导法将pBBS212-hTR(反义端粒酶RNA真核表达载体)导入人乳腺癌细胞MCF-7中,采用TRAP-PCR-ELISA法测定端粒酶活性,四唑盐比色(MTT)法检测MCF-7细胞的增殖,FCM分析等方法观察其对MCF-7细胞的增殖影响。结果:端粒酶反义RNA能显著抑制MCF-7细胞的端粒酶活性,抑制MCF-7细胞的增殖并诱导其凋亡。结论:脂质体转染反义端粒酶RNA在封闭细胞端粒酶活性表达的同时,可促进MCF-7细胞凋亡。     

降低端粒酶表达对人喉癌细胞系Hep-2生长的影晌

目的：用表达端粒酶反义RNA的方法研究端粒酶在喉癌细胞生长中的作用。方法：将端粒酶反义RNA真核表达载体，pBBS212-hTR转染入人喉癌Hep-2细胞系中，采用端粒重复扩增法测定端粒酶活性，用MTT法及流式细胞仪检测细胞周期，并用电镜观察细胞生长状况。结果：端粒酶反义RNA表达后能抑制Hep-2细胞的端粒酶活性，抑制细胞增殖并促进其凋亡.结论：以端粒酶反义RNA降低端粒酶的方法对人喉癌细胞系Hep-2的生长有明显抑制作用。     

反义hTERT在体外对HL-60细胞的抑制作用

[目的 ]探讨反义hTERT表达质粒是否能够抑制HL - 6 0细胞增殖能力及端粒酶活性。 [方法 ]通过脂质体法将反义hTERT表达质粒导入HL - 6 0细胞中 ;以G4 18进行筛选得到阳性克隆 ;以MTT法和体外集落形成实验检测反义hTERT表达质粒对HL - 6 0细胞增殖的抑制作用 ;以TRAP -PCRELISA法来研究反义hTERT对HL - 6 0细胞的端粒酶活性的抑制作用。 [结果 ]转染反义hTERT表达质粒组与空白对照及空质粒组相比 ,细胞增生速度明显较慢 ,克隆形成能力明显下降 (P <0 .0 1) ;反义hTERT对HL - 6 0细胞的端粒酶活性具有明显的抑制作用。 [结论 ]本研究构建的端粒酶反义hTERT表达质粒能够抑制HL - 6 0细胞的体外增殖能力及其端粒酶活性。     

端粒酶反义RNA对人髓性白血病细胞系HL-60的作用

目的 探讨抗端粒酶在急性白血病治疗中的意义。方法 用脂质体介导法将pBBS212-hTR(反义端粒酶RNA真核表达载体）导入人髓性白血病细胞系HL-60中,采用TRAP法测定端粒酶活性,细胞生长动力学检测,电镜,DNA片段分析等方法观察其对HL-60细胞的端粒酶活性、细胞增殖及细胞凋亡影响。结果 端粒酶反义RNA能显抑制HL-60细胞的端粒酶活性,抑制HL-60细胞的增殖并促进其凋亡。结论 以端粒酶反义RNA抑制端粒酶活性是治疗白血病的潜在途径。     

端粒酶反义寡核苷酸抑制端粒酶活性和诱导肺腺癌A549细胞凋亡的研究

目的 研究端粒酶反义寡核苷酸在肺腺癌A549细胞中抑制端粒酶活性和诱导细胞凋亡的能力.方法 用脂质体将荧光标记的端粒酶反义寡核苷酸转染入肺腺癌A549细胞后,TRAP-PCR-ELISA检测端粒酶活性变化,凋亡细胞用透射电镜(TEM)观察,TUNEL法检测各组细胞凋亡率.结果 转染72h后,端粒酶反义寡核苷酸进入A549细胞内,端粒酶活性显著降低.透射电镜下,端粒酶反义寡核苷酸转染组细胞凋亡增加,细胞凋亡率比其他组明显增高,差异有统计学意义(P＜0.01).结论 端粒酶反义寡核苷酸能靶向端粒酶,抑制其活性,并诱导肺腺癌A549细胞凋亡.     

核酶对肝癌SMMC-7721细胞端粒酶活性及凋亡的影响

目的:观察针对人端粒酶RNA模板区的核酶对肝癌细胞端粒酶活性和细胞凋亡的影响。方法:利用脂质体Lipofectamine介导,将已构建好的带有端粒酶核酶基因的重组质粒pBBS212Rz及空载质粒pBBS212转染肝癌SMMC-7721细胞,采用TRAP-ELISA法检测端粒酶活性,用倒置相差显微镜及流式细胞仪观察细胞生长和凋亡情况。结果:重组质粒pBBS212Rz转染的肝癌SMMC-7721细胞的端粒酶活性明显下降,细胞生长速度明显变慢,凋亡加速。结论:端粒酶核酶对肝癌细胞端粒酶活性和细胞生长有抑制作用,可望成为肝癌基因治疗的方法。     

人端粒酶RNA反义寡核苷酸诱导食管癌EC9706细胞凋亡观察

目的:观察人端粒酶RNA功能区的硫代修饰性反义寡核苷酸(ASODN)对食管癌EC9706细胞凋亡的诱导作用.方法:应用20 μmol/L ASODN 1次/d、连续7 d转染EC9706细胞,分别于转染前及转染后第1 d、3 d、5 d、7d采用端粒酶活性的定性及定量检测技术测定ASODN对EC9706细胞增殖及端粒酶活性的抑制作用,采用细胞DNA凋亡条带检测、TUNEL检测及吖啶橙荧光染色法观察细胞的凋亡情况.结果:与转染前比较,ASODN转染后各时点EC9706细胞端粒酶活性降低,凋亡细胞增多(P＜0.05或0.01).转染后第3 d开始出现DNA凋亡条带,第7 d出现从靠近加样孔处向远端延伸的相差180～200 bp的十几条DNA凋亡条带.结论:ASODN可通过抑制EC9706细胞端粒酶活性诱导肿瘤细胞凋亡,从而抑制食管癌细胞的增殖.     

bcl-2核酶对SMMC7721细胞端粒酶活性的影响作用

目的 观察bcl-2核酶对SMMC-7721细胞的作用,探讨bcl-2表达水平的改变对细胞端粒酶活性的影响。方法 经脂质体介导的方法将PMTr-neo（下向bcl-2核酶真核表达载体）导入SMMC7721细胞中,细胞克隆转移扩大培养后,采用TUNEL,TRAP-PCR-ELISA,免疫组化技术结合图像分析技术检测SMMC7721/PMTr-neo细胞凋亡=细胞端粒酶活性及P16,P12的改变。结果 较对照组SMMC7721/PMTr-neo细胞Bcl-2表达水平显著下降,伴有显著细胞凋亡现象;同时端粒酶活性下降,P16,P21表达水平显著增加。结论 bcl-2核酶可促进SMMC7721细胞发生凋亡,并降低细胞端粒酶活性,提示Bcl-2表达水平的改变对细胞端粒酶活性有一定的影响。     

人DNA MTase反义基因转染对诱导肝癌SMMC-7721细胞凋亡的影响

目的；观察人DNA MTase反义基因转染对肝癌细胞系SMMC－7721凋亡的影响。方法：采用脂质体法将构建的包含正，反义DNA MTase基因片段的真核表达载体转染入肝癌细胞系SMMC－7721；采用MTT法绘制生长曲线；流式细胞法和原位末端标记法检测细胞凋亡改变。结果：PCR法扩增外源性NeoR基因证实用脂质体法成功将重组载体转染入细胞；生长曲线显示转染反义DNA MTase基因片段的SMMC－7721细胞增殖速度减慢；流式细胞法测得其凋亡率由3．1％增加到13．5％，末端标记法也显示其调亡指数增加。结论：人DNA MTase反义基因转染可诱导肝癌细胞系SMMC－7721凋亡。凋亡基因功能被恢复可能主要原因之一。     

不同肿瘤细胞株人端粒酶逆转录酶及端粒酶活性的检测及其意义

目的：检测5种肿瘤细胞株人端粒酶逆转录酶（hTERT）表达及端粒酶活性状态，为端粒酶抑制剂在肿瘤治疗学方面的应用研究提供理论基础。方法：分别用免疫细胞化学S-P法和TRAP-ELISA方法检测人宫颈癌细胞株HeLa、人乳腺癌细胞株MCF-7、人肝癌细胞株SMMC7721、人前列腺癌细胞株PC-3m和人骨肉瘤细胞株U2OS hTERT表达及端粒酶活性状态。 结果：HeLa细胞hTERT表达阳性率最高，为 (93.75±3.10) %；而U2OS阳性表达率最低,仅为(2.75±0.96) %，近于不表达；其他3种细胞MCF-7、SMMC7721和PC-3m的hTERT表达阳性率分别为(92.50±2.65)%、(53.75%±2.22)%和(23.50±2.89)%。与hTERT表达阳性率相似，HeLa细胞端粒酶活性最强，为(94.58±3.49)%；而U2OS 端粒酶活性近于阴性，为(3.02±0.43)%；其他3种细胞MCF-7、SMMC7721和PC-3m的端粒酶活性分别为 (73.90±4.50) %、(66.67±3.35) %和(50.62±1.96) %。结论：5种细胞系中hTERT表达及端粒酶活性状态差别很大，提示端粒酶抑制剂可适用于多数但并非所有恶性肿瘤的治疗学研究。     

SiRNA稳定抑制肝癌细胞hTERT基因的表达

目的：利用RNA干扰稳定筛选-抑制技术,抑制人端粒酶逆转录酶（hTERT）基因表达,探讨靶向hTERT基因RNAi与抑制肝癌细胞增殖的时-效关系．方法：设计靶向hTERT基因的小干扰RNA,构建重组表达质粒pGenesil—shRNA—hTERT并导入肝癌SMMC-7721细胞株,经G418筛选,建立稳定表达siRNA—hTERT的细胞株．采用real—time RT—PCR、MTF和PCR—TRAP法同时检测pGenesil—shRNA-hTERT稳定抑制组和未处理SMMC-7721细胞组hTERT基因表达、端粒酶活性及细胞增殖变化．结果：在稳定表达pGenesil—shRNA—hTERT的SMMC-7721细胞株中,RNAi效力持续、稳定存在,hTERTmRNA表达、端粒酶活性明显降低,瘤细胞增殖被抑制．结论：RNA干扰能持续、稳定地抑制靶基因hTERT mRNA表达及肿瘤细胞增殖,是有潜力的基因治疗肿瘤新方法．     

甘氨脱氧胆酸钠对人肝癌细胞端粒酶活性及其hTERTmRNA表达的影响

目的探讨甘氨脱氧胆酸钠（glycodeoxycholic acid,GDCA）对肝癌SMMC7721细胞端粒酶活性以及hTERTmRNA表达影响。方法采用PCR-ELISA法检测端粒酶活性;应用RT-PCR检测hTERTmRNA的表达。结果GDCA作用肝癌SMMC7721细胞后,端粒酶活性与hTERTmRNA表达均降低,GDCA200、400μmol／L处理组与对照组端粒酶活性（A450nmOD值）分别为（0．140±0．04）、（0．077±0．01）、（0．2484-0．05）,差异有统计学意义（P〈0．05）,抑制率为43．5％和69．0％。hTERTmRNA表达明显降低,相对表达率分别为1．33、0．59、1．89。结论甘氨脱氧胆酸钠抑制肝癌SMMC7721细胞端粒酶活性,且下调hTERTmRNA的表达。     

B7基因转染联合LAK细胞治疗肝癌的体外研究

目的：探讨体外诱导的LAK细胞对B₇基因转染的肝癌细胞的杀伤作用。方法：构建含人B_7-1基因cDNA的真核表达载体pRCCMV-B_7-1,脂质体介导转染法将pRCCMV-B_7-1转入人肝癌细胞系SMMC7721,G418筛选转染肝癌细胞（B₇⁺SMMC7721）。RT-PCR、流式细胞仪鉴定目的基因表达。MTT比色试验体外检测LAK细胞对B_7-1转染肝癌细胞的杀伤活性。结果：B₇⁺SMMC7721细胞稳定表达B₇基因。LAK细胞对B₇⁺SMMC7721细胞的杀伤活性明显高于野生型SMMC7721者,结果有统计学意义。结论：B₇基因体外转染人肝癌细胞后可表达有活性的B₇分子,LAK细胞对表达B_7-1的肿瘤呈现增强的杀伤作用。     

端粒酶的义寡核苷酸抑制肺癌细胞端粒酶活性的研究

目的探讨端粒粒酶反义寡核苷酸对肺癌细胞端粒酶活性的抑制作用.方法脂质体介导的端粒酶反义寡核苷酸转染A549肺腺癌细胞株,采用TRAP-PCR-ELIsA法半定量检测转染后肺腺癌细胞端粒酶活性,观察它们的变化结果端粒酶反义寡核苷酸转染A549细胞72h后,A549细胞端粒酶活性明显下调.结论端粒酶反义寡核苷酸可以有效抑制肺腺癌细胞端粒酶活性.