真核表达载体pVAX1-mSLC的构建及在COS-7细胞中的表达

目的：构建小鼠次级淋巴组织趋化因子（mSLC）高效真核细胞表达载体pVAX1-mSLC。方法：用BamHⅠ和XbaⅠ双酶切重组克隆pMD-mSLC,胶回收约410bp的SLC基因片段,以亚克隆法构建于真核表达载体pVAX1的相应酶切位点。转化后进行菌落PCR分析和HinDⅢ酶切鉴定。阳性克隆提取质粒,体外电穿孔法转染COS-7细胞,用Western blot检测转染细胞中mSLC的瞬时表达。结果：菌落PCR和HindⅢ酶切鉴定证实,mSLC基因片段正确插入到真核表达载体pVAX1中。Western blot检测表明,以重组质粒pVAX1-mSLC转染的COS-7细胞能表达mSLC,表达产物的相对分子量同预期的结果相一致。结论：成功地构建小鼠SLC基因的真核表达质粒pVAX1-mSLC,用它转染COS-7细胞后,能瞬时表达mSLC,为下一步mSLC的肿瘤基因治疗研究奠定了基础。     

ha-syn蛋白核酸疫苗pVAX1-hαSH1-140的构建及其表达

目的构建含人α-突触核蛋白（human α-synuclein,hα-syn）编码基因的真核重组载体,并在COS-7细胞中表达,为帕金森病的核酸疫苗开发奠定基础。方法通过PCR方法扩增hα—syn基因的CDS全长片段,含酶切位点KpnⅠ、XbaⅠ和Kozak序列。扩增产物和真核表达载体pVAX1经双酶切、纯化、连接,转化感受态细胞E．coli TOP10,筛选含目的基因的重组载体pVAX1-hαS1-140,并在COS-7细胞中表达,用RT—PCR法和Western blot法检测其表达产物。结果经单、双酶切证实插入的基因片段大小一致,基因测序证实其序列和方向完全正确。用RT—PCR法和Western blot法检测表明,重组质粒pVAX1-hαS1-140在COS-7细胞中能表达目的蛋白,而且具有生物活性。结论成功构建了核酸疫苗pVAX1-hαS1-140,并在COS-7细胞中表达,为帕金森病的核酸疫苗治疗研究奠定了良好的基础。     

IL-27亚基基因真核表达质粒的构建与表达

目的 克隆人白细胞介素27(interleukin 27,IL-27)蛋白亚基EB病毒诱导的基因3(Epstein-Barr vi-rus-induced gene 3,EBI3)与p28基因的cDNA,分别构建其真核表达质粒并在COS-7细胞表达.方法 人外周血单核细胞诱导为成熟树突状细胞后提取细胞总RNA,经逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增EBl3与p28基因cDNA,酶切后插入pcDNA-3.1构建真核表达载体pcDNA-EBI3与pcDNA-p28.重组质粒转染COS-7细胞,RT-PCR检测目的 基因表达.结果 成功构建克隆人IL-27蛋白亚基真核表达质粒,重组质粒分别转染COS-7细胞后检测到相应基因表达.结论 人IL-27蛋白亚基基因克隆及真核表达质粒的成功构建,为构建表达有生物学活性的重组人单链IL-27蛋白奠定基础.     

hα-syn蛋白核酸疫苗pVAX1-hαS1-140的构建及其表达

目的 构建含人α-突触核蛋白(human α-synuclein,hα-syn)编码基因的真核重组载体,并在COS-7细胞中表达,为帕金森病的核酸疫苗开发奠定基础.方法 通过PCR方法扩增hα-syn基因的CDS全长片段,舍酶切位点KpnⅠ、XbaⅠ和Kozak序列.扩增产物和真核表达载体pVAX1经双酶切、纯化、连接,转化感受态细胞E.coli TOP10,筛选含目的基因的重组载体pVAX1-hαS1-140,并在COS-7细胞中表达,用RT-PCR法和western blot法检测其表达产物.结果 经单、双酶切证实插入的基因片段大小一致,基因测序证实其序列和方向完全正确.用RT-PCR法和Westem blot法检测表明,重组质粒pVAx1-hαS1-140在COS-7细胞中能表迭目的蛋白,而且具有生物活性.结论 成功构建了核酸疫苗pVAX1-hαS1-140,并在COS-7细胞中表达,为帕金森病的核酸疫苗治疗研究奠定了良好的基础.     

人CD81真核表达载体的构建及在COS-7细胞中的表达

目的：构建含人cD81基因的真核表达载体，探讨CD81在COS-7细胞的表达，为研究丙型肝炎病毒(1-ICV)与cD81相互作用奠定基础．方法：从我们构建的含人CD81全编码基因载体pMD18-T-CD81，应用双酶切回收基因片段，定向克隆入真核表达载体pVAX1；通过脂质体介导的基因转染技术将pVAX1-CD81和空载体转入COS-7细胞；应用抗CD81单克隆抗体通过间接免疫荧光法检测COS-7细胞的表达产物．结果：重组的含CD81基因的真核表达载体pVAX1-CD81经酶切和PCR鉴定分析正确，并证明在COS-7细胞表面有效地表达CD81蛋白．结论：成功构建含CD81全编码基因的真核表达载体pVAX1-CD81，并在COS-7细胞表面有效表达CD81分子，该转染细胞可作为研究CD81在HCV感染中的作用提供模型．     

NOV基因真核表达载体的构建及在COS-7细胞中的表达

目的获得NOV基因真核表达载体并检测其在细胞中的表达.方法利用逆转录-多聚酶链反应(RT-PCR)方法,从新鲜大鼠大脑组织的总cDNA中扩增出1 165 bp的NOV基因的cDNA编码区序列,然后用HindⅢ和BamHⅠ双酶切后定向克隆入真核表达载体pcDNA3.1/Myc-His( )/lacZ质粒中,用脂质体法将载体转染入COS-7细胞中,用Western blot和免疫细胞化学方法检测其表达情况.结果 NOV基因cDNA已经正确克隆到真核表达载体pcDNA3.1/Myc-His( )/lacZ质粒中;体外转染入COS-7细胞中后,可见转染细胞有NOV蛋白的表达.结论本实验所构建的重组质粒为NOV基因的作用研究提供了有利的分子工具.     

人碱性成纤维细胞生长因子真核表达载体的构建及表达

目的: 构建研究人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)真核表达载体,并在体外进行表达和检测.方法: 从骨髓基质干细胞中分离总RNA,进行RT-PCR 获得人bFGF cDNA.测序证实其结果正确后,构建真核表达载体.并经BamHⅠ/EcoRⅠ双酶切、PCR及测序鉴定.利用Blast程序,搜索NCBI GenBank中与重组质粒(pVAX1-bFGF)中编码bFGF基因同源的序列.通过脂质体将重组质粒转染入骨髓基质干细胞,使用间接免疫荧光法进行表达产物检测.结果: 经EcoRⅠ/Pst BamHⅠ/EcoRⅠ双酶切、PCR及测序鉴定证实,人bFGF基因成功地克隆到真核表达载体pVAX1中;pVAX1- bFGF中编码bFGF的序列与GenBank中所报道的bFGF编码序列完全一致;间接免疫荧光结果显示转染重组质粒的细胞表面有绿色荧光.结论: 成功地构建了人bFGF真核表达载体,其可以在体外进行表达.     

重组CD200基因在COS-7细胞中的瞬时表达

目的研究构建于重组真核表达载体pcDNA3-CD200上的CD200基因在COS-7细胞中的瞬时表达。方法体外扩增并酶切鉴定pcDNA3-CD200质粒；常规方法培养COS-7细胞；用电转染基因法将pcDNA3-CD200质粒转入COS-7细胞中，用流式细胞术（FCM）检测转染细胞CD200表达。结果转染COS-7细胞后72h，CD200基因表达阳性的细胞计数率为44．5％。结论成功的利用电转染基因法将重组真核表达载体pcDNA3-CD200转染到COS-7细胞中，并实现了在COS-7细胞中的瞬时表达，为进一步研究CD200的生物学活性以及信号传导奠定了基础。     

SARS冠状病毒核蛋白与mGM-CSF融合质粒的构建及表达

目的构建SARS冠状病毒(SARS—COV)核蛋白(N)与mGM—CSF的融合真核表达质粒,借助mGM—CSF的免疫佐剂作用,提高SARSDNA疫苗的免疫效果。方法采用PCR方法扩增N和mGM—CSF基因片段,用分子克隆和基因融合的方法将目的片段定向插入真核表达载体中,构建融合表达质粒pVAX 1／N—mGM—CSF,并以融合质粒转染细胞,用免疫细胞化学和Western Blot的方法鉴定融合质粒在体外的表达。结果经酶切鉴定及DNA序列测定证实融合质粒构建正确,细胞转染实验表明,融合质粒能在COS-7细胞中表达。结论成功构建SARS—COV核蛋白与mGM—CSF的融合表达质粒,重组质粒能在真核细胞内表达。     

E型沙眼衣原体MOMP基因重组质粒的构建与表达

目的：构建E型沙眼衣原体（Ct）主要外膜蛋白（MOMP）基因重组真核表达质粒pVAX1-MOMP,为探索安全的E型CtDNA疫苗奠定基础。方法：根据Genebank中E型Ct MOMP基因序列设计引物,用高保真PCR方法从E型Ct基因组DNA中扩增得到约1.1kb的MOMP片段,克隆至pcDNAⅡ载体,测序后亚克隆至表达载体pVAX1,构建卡那霉素抗性真核重组表达质粒pVAX1-MOMP,并以重组质粒转染COS-1细胞进行表达,用Western blotting方法鉴定表达产物。结果：从E型Ct基因组DNA中扩增出特异的MOMP基因片段,酶切鉴定及DNA序列测定证实pVAX1-MOMP重组质粒构建正确,能在COS-1细胞内表达,表达产物能与抗MOMP单克隆抗体特异性结合。结论：成功构建E型沙眼衣原体MOMP真核表达质粒pVAX1-MOMP,并在真核细胞内获得表达。     

人白细胞介素18和新城疫病毒HN基因嵌合表达载体的构建与表达

目的：构建人白细胞介素18（IL-18）与新城疫病毒（NDV）HN基因嵌合表达质粒。 方法：选用适当的限制性核酸内切酶将NDV的HN基因连接至真核表达质粒pVAX1 IL-18中IL-18基因的尾部,同时替换掉IL-18基因的终止子,构建表达IL-18 HN 嵌合基因的pVAX1 IL-18 HN质粒,经酶切鉴定正确后,通过脂质体介导转染HeLa细胞,应用Western blotting及血凝试验检测其表达情况。 结果：酶切鉴定证实正确地构建了pVAX1 IL-18 HN嵌合表达质粒,Western blotting和血凝试验检测结果表明,嵌合后的IL-18和HN基因均能够表达,且表达的HN蛋白具有较高的血凝活性。 结论：IL-18和HN基因嵌合后不影响二者的表达,而且表达的HN蛋白具有血凝活性。     

真核表达质粒pVAX1-Der p 1的构建及在真核细胞中的表达

目的:构建真核表达质粒pVAX1-Der p 1，检测质粒编码的重组蛋白在真核细胞293T中的表达，为进一步的动物实验打下基础。方法:分离屋尘螨总RNA，根据GenBank已公布的Der p 1核酸序列设计引物，PCR扩增Der p 1编码基因，以其全长为目的基因，定向克隆至真核表达载体pVAX1，将其转化大肠杆菌DH...     

婴儿利什曼原虫Pepck和Gp63优势表位的真核与原核重组载体的构建与表达

  目的  选取婴儿利什曼原虫的Pepck和Gp63的优势表位基因,构建Pepck-Gp63二联优势表位的原核与真核重组表达载体并表达蛋白。  方法  用计算机分析预测磷酸烯醇丙酮酸羧基酶（phosphoenolpyruvate carboxylase, PEPCK）的二级结构及HLA表位,筛选出优势表位。根据本实验室之前对表面蛋白酶63（glycoprotein of 63×103, GP63）用相同的方法分析而筛选的表位结果,把Pepck和Gp63的优势表位基因通过重叠PCR和酶切连接反应构建出重组原核表达质粒pET32a-Pepck-Gp63,并诱导其在大肠杆菌中表达;构建出重组真核表达质粒pVAX1-Pepck-Gp63,用脂质体转染法把真核质粒转染到NIH3T3细胞中表达。  结果  Pepck存在多个优势表位;测序结果表明二联优势表位基因Pepck-Gp63连接成功;PEPCK-GP63蛋白在大肠杆菌中以包涵体形式表达并在SDS-PAGE电泳-考马斯亮蓝染色的结果中呈现相对分子质量为74×103大小的条带;细胞免疫荧光中被pVAX1-Pepck-Gp63转染的NIH3T3细胞呈阳性。  结论  成功构建重组原核表达质粒pET32a-Pepck-Gp63和重组真核表达质粒pVAX1-Pepck-Gp63,并分别在大肠杆菌和NIH3T3细胞中验证重组质粒能表达相应目的蛋白,为后续的免疫策略研究提供初步实验基础。     

铜绿假单胞菌外膜蛋白F与HSV-1VP22融合DNA疫苗的构建与表达

目的:构建铜绿假单胞菌外膜蛋白F与Ⅰ型单纯疱疹病毒(herpes simplex virus 1,HSV-1) VP22融合表达的DNA疫苗,并研究其在真核细胞中的表达情况.方法: 构建重组质粒 pVAX1-OprF、 pVAX1-VP22、 pVAX1-VP22-OprF、 pVAX1-OprF-VP22.原核表达VP22 的碳端蛋白,以电洗脱的方法得到纯化蛋白,免疫BALB/c小鼠,制备VP22蛋白的抗血清,West-ern blot鉴定抗体特异性.最后,以脂质体法将重组质粒转染真核细胞,利用Western blot检测其在真核细胞中的表达情况.结果: 成功制备了抗VP22的抗血清,重组质粒在真核细胞中得到了表达.结论: 铜绿假单胞菌OprF与 HSV-1VP22融合表达的重组质粒能够在真核细胞中表达,这为进一步的动物实验打下了基础.     

结核杆菌保护性抗原-遍在蛋白质系统的建立

目的：将结核杆菌4种保护性抗原基因与小鼠遍在蛋白质（泛素）基因融合，建立抗原－遍在蛋白质系统。方法：通过RT－PCR技术从小鼠睾丸组织中克隆遍在蛋白质cDNA，同时培养结核杆菌并从基因组中克隆出4种保护性抗原编码区，然后通过柔性接头将遍在蛋白质与4种抗原的基因分别融合在一起，并插入到pVAX质粒中。结果：扩增出来的4种抗原基因大小分别为0.3,0.7,1.0,1.65kb，遍在蛋白质PCR产物约为0.2kb，均与GenBank中登录的相符；pVAX重组质粒酶切结果显示融合基因正确地插入到pVAX载体中，全自动测序显示抗原基因和遍在蛋白质基因均为所需基因，柔性接头序列也完全正确。结论：成功地构建了中国株结核杆菌的4种保护性抗原基因－遍在蛋白质融合系统，为结核病的防治打下了基础。     

新型基因佐剂SPreS2真核表达载体的构建及其瞬时表达

目的 构建重组真核表达载体pVAX1-SPreS2作为基因佐剂,用以增强或调节弓形虫DNA疫苗的体液及细胞免疫效果。方法 采用重叠延伸PCR技术,扩增乙肝病毒表面抗原S和PreS2基因,引入编码GSGSGS柔性多肽序列作为接头拼接S和PreS2基因,构建重组克隆载体pMD18T-SPreS2和重组真核表达载体pVAX1-SPreS2,分别进行PCR、酶切和测序鉴定;脂质体法将重组载体pVAX1 SPreS2转染人成纤维细胞,建立体外真核细胞瞬时表达系统,SDS-PAGE和Western blot检测重组载体转染HFF细胞瞬时表达状况及其表达产物的免疫活性。结果 PCR、酶切、测序结果表明,重组克隆载体pMD18T SPreS2和重组真核表达载体pVAX1 SPreS2正确构建,融合基因SPreS2在真核细胞中可以瞬时表达,其表达产物具有一定的免疫活性。结论 成功构建重组真核表达载体pVAX1-SPreS2,为增强或调节弓形虫DNA疫苗免疫效果提供一种新型基因佐剂。     

弓形虫致密颗粒蛋白GRA8真核重组表达质粒的体外表达分析

目的:分析弓形虫致密颗粒蛋白GRA8真核表达质粒的体外表达。方法:大量提取纯化重组真核表达质粒pVAX1-GRA8,瞬时转染培养的vero E-6细胞,RT-PCR和免疫印迹法检测GRA8在细胞中的表达。结果:从转染pVAX1-GRA8后的vero E-6细胞的RNA中扩增出GRA8的特异条带,转染细胞存在弓形虫感染血清识别的特异蛋白质条带。结论:真核表达质粒pVAX1-GRA8在vero E6细胞中获得表达。     

重组人HIF-1α真核表达质粒的构建和鉴定

目的： 构建重组人HIF-lα 真核表达质粒,为进行人HIF-lα基因的克隆与表达做准备。 方法： 从人外周血细胞中提取总RNA,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法反转录合成cDNA。分别以含有绿色荧光蛋白(EGFP)片段的质粒PIREGFP质粒和反转录合成的cDNA 为模板,加入所设计的3对引物［EGFP-linker、HIF-1α)上游(up)和下游(down)引物］所扩增目的基因片段分别与T载体连接后转化大肠杆菌DH5α,LB/Amp平板培养基筛选菌落,提取质粒。测序正确后经酶切先后克隆进入pVAX1载体。 结果：通过聚合酶链反应(PCR)分别获得约870、1 199和672 bp的特异性DNA片段,分别与T载体连接后测序,测序结果与GenBank所提供的基因序列相同。将以上3个片段依次连入pVAX1载体后,所得质粒经酶切鉴定后获得约1 800 bp　片段,与预想结果一致。结论：成功构建了重组人HIF-1α真核表达质粒pVAX1-EGFP-linker-HIF-1α。