IL-27亚基基因真核表达质粒的构建与表达

目的 克隆人白细胞介素27(interleukin 27,IL-27)蛋白亚基EB病毒诱导的基因3(Epstein-Barr vi-rus-induced gene 3,EBI3)与p28基因的cDNA,分别构建其真核表达质粒并在COS-7细胞表达.方法 人外周血单核细胞诱导为成熟树突状细胞后提取细胞总RNA,经逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增EBl3与p28基因cDNA,酶切后插入pcDNA-3.1构建真核表达载体pcDNA-EBI3与pcDNA-p28.重组质粒转染COS-7细胞,RT-PCR检测目的 基因表达.结果 成功构建克隆人IL-27蛋白亚基真核表达质粒,重组质粒分别转染COS-7细胞后检测到相应基因表达.结论 人IL-27蛋白亚基基因克隆及真核表达质粒的成功构建,为构建表达有生物学活性的重组人单链IL-27蛋白奠定基础.     

衰变加速因子及其所在膜微区在T淋巴细胞信号传递中的作用

低温抽提Jurkat细胞膜去污剂抗性的膜成分(DIG),检测Src家族酪氨酸激酶(PTK)及衰变加速因子(DAF)的分布情况。共聚焦扫描显微技术检测Jurkat细胞静息与交联状态下DAF分子对去污剂Triton-X100的抗溶性,以探讨其在Jur-kat细胞免疫识别中的作用,结果显示静息状态CD3对去污剂无抗溶性,而DAF与Lck有抗溶性。单抗交联后CD3对去污剂抗性有所增加。静息状态DAF与Src家族PTK特异分布于膜微区中,交联CD3可诱导CD3与膜微区特异性聚集,DAF所在的膜微区可能促进T细胞的免疫识别和信号传递作用。     

硅藻土、珍珠岩细菌内毒素限量检测

目的探寻硅藻土、珍珠岩细菌内毒素含量的简便检测方法。方法采用细菌内毒素限量检测法测定生产用主要原辅材料硅藻土、珍珠岩的细菌内毒素含量,同时分别考察样品的前处理、干扰试验,与定量检测结果也作相应比较。结果样品前处理采用60℃1h水浴或放置过夜相比较无差别;样品对方法无干扰;同时与定量法比较两种方法结果一致。结论样品前处理可采用60℃1h水浴代替放置过夜,限量法可作为硅藻土、珍珠岩细菌内毒素含量检测的常规方法。     

腺病毒介导重组人单链IL-27融合基因在肝癌细胞的表达及活性鉴定

目的:利用腺病毒表达系统在肝癌细胞表达有生物活性的单链重组人白细胞介素-27(rhscIL-27)并检测其生物学活性。方法:将rhscIL-27基因片段从pcDNA3.1载体克隆到腺病毒载体pAdTrack-CMV,然后在细菌内与pAdEasy同源重组构建AdIL-27腺病毒载体并转染293细胞包装、扩增腺病毒颗粒。将重组腺病毒感染肝癌细胞株HepG2,荧光显微镜、RT-PCR及ELISA等方法进行检测蛋白表达情况,IFN-γ诱生实验检测rhscIL-27的生物学活性。结果:成功构建AdIL-27腺病毒载体,经293细胞包装扩增后感染HepG2细胞观察到有GFP表达,RT-PCR及ELISA检测到细胞有rhscIL-27表达,IFN-γ诱生实验证实表达的rhscIL-27具有诱导产生IFN-γ的生物学活性。结论:利用腺病毒表达系统成功在肝癌细胞表达有生物活性的重组人单链IL-27(rhscIL-27),并具有诱导产生IFN-γ的生物学活性,为研究IL-27的生物学功能及其对肝癌的基因治疗奠定了基础。     

重组人单链IL-27融合基因的构建、表达及生物学活性鉴定

白细胞介素(IL)-27是近年发现的IL-12细胞因子超家族的新成员,是由IL-27 p2S和IL-27 EB病毒诱导的基因3蛋白(Epstein-Barr virus-induced gene 3,EBI3)亚单位构成的可溶性异源二聚体,实验发现IL-27具较强促进细胞免疫与诱导杀伤肿瘤细胞的生物学活性[1].     

小干涉RNA质粒抑制Fn14表达对肝癌细胞增殖的影响

目的观察成纤维细胞生长因子诱导的早期反应蛋白14（Fibroblast growth factor-inducible immediate-early response protein 14、Fn14）表达对肝癌细胞增殖的影响。方法构建PAVU6-Fn14 siRNA干涉质粒并将其转染肝癌细胞株QGY7703，MTT法检测抑制Fn14蛋白表达对肝癌细胞增殖的影响，在培养体系加入肿瘤坏死因子相关弱凋亡诱导因子（Tumor necrosis factor related weak inducer of apoptosls、TWEAK）蛋白后检测肝癌细胞增殖活性。结果成功构建PAVU6-Fn14 siRNA干涉质粒，转化肝癌细胞后肝癌细胞增殖受抑，培养体系加入TWEAK蛋白后肝癌细胞增殖活性仍受抑。结论Fn14蛋白表达降低可抑制肝癌细胞的增殖活性，应用RNA干涉技术抑制Fn14表达对肝癌细胞增殖具抑制作用。     

SiRNA沉默JAB1表达抑制肝癌细胞增殖

 目的 观察沉默Jab1基因表达对人肝癌细胞HepG-2增殖的影响。方法 利用RNA干扰技术构建PAVU6-JAB1 siRNA干扰质粒,将其转染HepG-2细胞,采用Real-time PCR、Western blot等方法对Jab1表达进行检测,WST-8、流式细胞分析对细胞增殖的影响。结果 成功构建PAVU6- JAB1 siRNA干扰质粒,转染HepG-2细胞后Jab1蛋白表达量较对照组明显降低,P27kip1蛋白表达量明显升高 (P<0.01)。转染96 h后能显著抑制细胞增殖活性,由空载体转染组的99.6%?1.4%降至70.8%?1.6%。结论 构建靶向Jab1基因的干扰质粒能下调Jab1基因的表达,上调P27kip1蛋白水平,并抑制HepG-2细胞在体外的增殖活性。