利用酵母双杂交系统筛选Pak4相互作用蛋白质

目的 利用酵母双杂交系统从人胎脑cDNA文库中筛选信号转导分子Pak4相互作用蛋白.方法 将Pak4激酶域序列克隆到酵母表达载体pGBKT7构建诱饵质粒.质粒转化到酵母感受态AH109和Y187中验证蛋白表达.将人胎脑cDNA文库转化酵母Y187,与已转化诱饵质粒的AH109酵母进行交配实验.交配子在SD/-Leu/-Trp/-His和SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade/X-α-gal平板上筛选,阳性克隆质粒酶切鉴定.结果 成功构建了pGBKT7-Pak4 KD诱饵质粒,Western blot证实其在酵母菌AH109和Y187中表达,筛选了多个与Pak4相互作用的阳性转化子.结论 利用酵母双杂交系统筛选出Pak4相互作用蛋白质.     

人早幼粒细胞cDNA文库的构建及其鉴定

目的：构建人早幼粒细胞HL60的cDNA文库,阐明文库内相关基因在急性早幼粒细胞白血病（APL）发生发展中的相关机制。方法：采用Trizol法提取HL60细胞总RNA,离心柱法分离纯化样本中的mRNA,逆转录PCR法合成cDNA第一链,酶促法直接合成cDNA第二链,胶回收目的长度的cDNA片段后将其与pPR3-N载体连接,通过同源重组方法在酵母Y187菌株中构建人早幼粒细胞cDNA文库。将培养的菌液涂布于LB平板进行库容量鉴定,PCR法鉴定插入片段大小及分布。结果：提取到的HL60细胞RNA条带清晰无降解且弥散度低,以纯化后的细胞mRNA为模板成功合成cDNA,经胶回收cDNA片段后顺利将其与pPR3-N载体连接。将重组载体转化至酵母菌株Y187,通过同源重组方法在菌株中成功构建人早幼粒细胞cDNA文库。在原始电转化菌稀释100倍后取10 μL涂板,共长约250个克隆子,库容量为2.5×10⁶ CFU·mL^-1,转化后原始菌液共计5 mL,总库容量为1.25×10⁷ CFU。文库的插入片段电泳检测,平均插入片段大于1200 bp,阳性率为100%。结论：成功构建人早幼粒细胞的cDNA文库,为白血病的发病机制及治疗机制的研究奠定了基础。     

应用抑制消减杂交技术构建哮喘病人嗜酸细胞差异表达基因消减cDNA文库

目的构建哮喘病人治疗前后嗜酸细胞差异表达基因的消减cDNA文库。方法采用新近建立的抑制消减杂交方法,哮喘治疗前后的嗜酸细胞为试验和对比材料,分离哮喘病人嗜酸细胞中差异表达基因的cDNA片段,将其与T载体进行T／A连接构建文库,将连接产物用氯化钙转化法转化大肠杆菌进行文库扩增和蓝白斑筛选,随机挑取100个白色克隆用菌落PCR进行鉴定。结果扩增消减cDNA文库获得3000余个白色阳性克隆,随机挑取100个白色克隆用PCR进行扩增,90％的克隆中均有200～600bp的插入片段,这些片段可能是哮喘嗜酸细胞差异表达基因的cDNA片段。结论用SSH法及T／A克隆技术成功构建了哮喘病人治疗前后嗜酸细胞差异表达基因消减cDNA文库,该消减cDNA文库的建立为进一步筛选、克隆哮喘病人嗜酸细胞差异表达的新基因奠定了基础。     

慢性髓细胞性白血病K562细胞适体的筛选与鉴定

目的：筛选并鉴定出慢性髓细胞性白血病（CML）K562细胞的寡核苷酸适体.方法：体外合成长度为88个碱基的随机单链DNA（ssDNA）文库,采用生物素-链霉亲和素磁珠法制备次级文库,以正常人血液中提取的中性粒细胞为反筛细胞,利用指数富集的配基系统进化（SELEX）技术筛选出与CMLK562细胞特异结合的适体.将筛选得到的适体回收纯化后连接pGEM-T质粒载体,经蓝白筛选后,随机挑选24个克隆子进行序列测定.采用荧光标记引物法检测ssDNA文库与K562细胞的亲和力,并用Clustal 2.05和DNA sis V2.5软件对适体序列进行一级结构同源性分析和二级结构预测.结果：经过13轮循环筛选,CML K562细胞适体的A值从0.12上升到1.25,至第13轮A值无明显增高.一级结构分析无同源序列,但可分为6个家族,其中5个家族各自具有保守序列,家族6无保守序列.二级结构分析表明,适体形成的茎环、凸环结构可能是与K562细胞特异性结合的结构基础.结论：利用SELEX技术成功筛选出高亲和性的CML K562细胞适体.     

酵母双杂交筛选TEB4相互作用蛋白

目的 酵母双杂交筛选与TEB4(MARCH-VI)有相互作用的蛋白,构建该蛋白基因序列的重组栽体.方法 以人TEB4为诱饵质粒,利用酵母双杂交技术筛选人淋巴瘤cDNA文库.在SD/-4培养基上共获得150多个阳性克隆,将酵母菌扩增后抽提质粒,转化大肠杆菌,进行序列分析,并经过回复杂交验证,发现了一个与TEB4相互作用的蛋白:ATP synthase F0 subunit 6(ATP-C6).PCR法扩增ATP-C6,亚克隆到质粒pCMV-HA中,获得重组质粒pCMV-HA-ATP-C6,酶切和测序进行鉴定.结果 从人淋巴瘤cDNA文库筛选到一个与TEB4有相互作用的蛋白ATP-C6,并成功构建重组质粒pCMV-HA-ATP-C6. 结论应用酵母双杂交系统从人淋巴瘤cDNA文库中筛选并初步验证了与TEB4有相互作用的蛋白,为TEB4蛋白功能的进一步研究奠定了基础.     

人胚胎干细胞培养及其cDNA文库的构建

目的 构建人胚胎干细胞cDNA文库,为筛查疾病抗原基因奠定基础.方法 培养和收集人胚胎干细胞克隆,提取胚胎干细胞总RNA,分离纯化mRNA,利用mRNA作模板反转录合成双链cDNA,双链DNA经pfu-DNA聚合酶将链末端补平,与EcoRⅠ接头连接,XhoⅠ酶切消化产生粘端.用Sepharose CL2B柱分离纯化及除去小分子cDNA片段,与Uni-ZAP XR噬菌体连接,体外转化XL1-blue MRF菌,建成cDNA文库并计算重组效率.对cDNA文库进行扩增,测定扩增文库的滴度.阳性重组子用EcoRⅠ+XhoⅠ双酶切鉴定插入片段的大小.结果 构建成含1.2×106重组子的人胚胎干细胞cDNA文库,重组子插入外源DNA片段长度不小于1000 kb.结论 已成功构建人胚胎干细胞cDNA文库,适合用于筛选目的基因克隆.     

分化抑制因子1相互作用蛋白AGGF1的筛选

目的 利用酵母双杂交方法,筛选成人肺组织文库中与分化抑制因子1(Id1)相互作用的蛋白.方法 PCR方法扩增Id1的编码序列并定向克隆入诱饵质粒pHybLex/Zeo,构建重组诱饵质粒pHybLex/Zeo-Id1,酶切鉴定后转化人酵母株EGY48/pSH18-34,检测重组诱饵质粒有无非特异激活报告基因Leu2、LacZ作用;扩增并提取成人肺组织文库质粒,将文库质粒及重组诱饵质粒转化入酵母细胞,依次筛选Leu2 ,Leu2 LacZ 克隆;设置阴性及阳性对照,重复筛选Leu2 LacZ 克隆并排除假阳性克隆,获取真阳性文库质粒,进行测序和同源性比对.结果 酶切证实,重组诱饵质粒构建成功.重组诱饵质粒转化入酵母细胞后.经检测无非特异激活报告基因作用.扩增并筛选成人肺组织文库.获得198个Leu2 及19个Leu2 LacZ 克隆.经排除假阳性克隆,最终获得1个Leu2 LacZ 真阳性克隆,经测序和同源性比较证实该克隆与蛋白AGGF1高度同源(556/559,99.5%),Westem blotting证实其在酵母细胞中有表达.结论 利用酵母双杂交方法,通过筛选成人肺组织文库,发现Id1与AGGF1存在相互作用.     

牦牛肾脏cDNA文库的构建

目的 :构建牦牛肾脏的cDNA文库 ,为进一步筛选、克隆和表达有益基因做准备。方法 :从牦牛肾脏中提取总mRNA ,经逆转录合成cDNA后 ,以pSPORT1质粒为载体构建cDNA文库。结果 :牦牛肾脏cDNA文库库容量为1×106转化子/μgcDNA ,经E.coliDH5α菌株平板测定 ,重组率为93 %。结论 :经平板鉴定和PCR鉴定表明 ,所构建cDNA文库达到建库要求 ,能够用于目的基因筛选和克隆表达     

顺序转化法进行酵母双杂交筛选相互作用蛋白质

目的：利用顺序转化法进行酵母双杂交从人胎脑cDNA文库中筛选PAK4新的相互作用蛋白。方法：将PAK4激酶域序列克隆到酵母表达载体pGBKT7构建诱饵质粒。提取质粒并转化酵母菌AH109,验证蛋白表达。用顺序转化法将质粒和人胎脑cDNA文库转化酵母菌AH109,在SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade和SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade/x-α-gal平板上筛选,对阳性克隆质粒进行酶切鉴定。结果：利用顺序转化酵母双杂交方法筛选出了多个与PAK4蛋白质相互作用的Ade＋/His＋/LacZ＋阳性转化子。结论：利用顺序转化酵母双杂交方法成功筛选了与PAK4相互作用的蛋白质。     

干细胞与肿瘤干细胞

目的了解干细胞、肿瘤干细胞和恶性肿瘤关系的研究进展。方法复习国内外相关文献,综述肿瘤干细胞与干细胞的关系、肿瘤干细胞与恶性肿瘤发生发展的关系、研究现状、前景及存在的问题。结果正常干细胞和肿瘤干细胞之间存在很强的相似性,其中淋巴造血系统恶性肿瘤和少数实体瘤干细胞分离鉴定的成功有力支持了肿瘤干细胞理论。结论肿瘤干细胞理论可解释很多恶性肿瘤的生物学行为,但目前仍迫切需要相关分离、纯化、鉴定实体瘤干细胞的思路和方法。     

间充质干细胞与调节性T细胞的研究进展

间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）无免疫原性,且具有免疫调节的功能。调节性T细胞（regulatory T cell,Treg）是一类具有负性免疫调节作用的T细胞亚群,MSCs和Treg通过复杂的作用机制维持免疫耐受,限制效应细胞的应答程度,从而纠正和防止过度免疫反应。同时大量研究表明MSCs在体外和体内都能上调Treg水平,并以此来发挥免疫抑制作用,治疗移植物抗宿主病（GVHD）、系统性红斑狼疮（SLE）、类风湿关节炎（RA）、1型糖尿病（T1DM）等自身免疫性疾病。     

肝星状细胞和胰腺星状细胞的比较

肝星状细胞和胰腺星状细胞在各自纤维化疾病中都发挥着重要作用,两者在诸多方面存在相似之处。文章就两者的生物学特性、凋亡、信号转导通路方面进行总结和比较,以探讨它们之间的关系。     

肝星状细胞和胰腺星状细胞的比较

肝星状细胞和胰腺星状细胞在各自纤维化疾病中都发挥着重要作用,两者在诸多方面存在相似之处.文章就两者的生物学特性、凋亡、信号转导通路方面进行总结和比较,以探讨它们之间的关系.     

回转器模拟失重对SGC-7901、HFE-145细胞增殖和周期的影响

目的探讨模拟失重对胃癌SGC-7901细胞和胃黏膜上皮HFE-145细胞增殖和周期的影响。方法采用回转器模拟失重,两种细胞各分为两组,回转组和1G对照组,实验时间共72h。采用免疫组化法观察两种细胞增殖核抗原（proliferating cell nuclear antigen,PCNA）表达的变化,应用流式细胞仪测定细胞周期。结果与对照组相比,回转组SGC-7901细胞48h及72hPCNA抗体阳性率明显减少（P〈0.05及P〈0.01）,G0＋G1期细胞显著增多（P〈0.01及P〈0.05）;12h、24h及36h PCNA抗体阳性细胞的比率无显著性差异。与对照组相比,回转组HFE-145细胞12hPCNA抗体阳性率明显减少（P〈0.05）,G0＋G1期细胞显著增多（P〈0.05）。结论回转器模拟失重使胃癌SGC-7901细胞48h及72h时出现细胞周期阻滞、增殖抑制。胃黏膜上皮HFE-145细胞在12h时出现上述变化。     

透明细胞性肾细胞癌和肾嫌色细胞癌的临床病理及免疫表型比较

目的 探讨透明细胞性肾细胞癌和肾嫌色细胞癌的临床病理学特征、诊断和鉴别诊断.方法 对手术切除的57例肾透明细胞癌和22例肾嫌色细胞癌进行临床特点、肉眼观、光镜和免疫组织化学染色.结果 透明细胞性肾细胞癌多有血尿或肾区疼痛临床症状,巨检切面呈多彩状多伴出血、坏死及囊变;嫌色细胞癌临床上大多无症状,巨检切面呈淡棕色,出血、坏死罕见.镜下透明细胞性肾细胞癌胞浆透明或嗜酸性;嫌色细胞癌胞膜厚似植物状、部分胞质嗜酸性可见明显核周空晕.免疫组化染色57例透明细胞性肾细胞癌E-cadherin全阴性表达,Vimentin全阳性表达,而22例嫌色细胞癌两者的表达正好相反,有显著性差异(P<0.01).结论 透明细胞性肾细胞癌与嫌色细胞癌虽在形态上有一定的交叉,但结合临床病理特征及联合检测E-cadherin和Vimentin的表达可做出正确诊断与鉴别诊断.     

香叶木素诱导人肝癌HepG2细胞凋亡及周期阻滞的机制研究

目的 研究香叶木素对人肝癌HepG2细胞的增殖、凋亡及周期阻滞的影响并揭示其分子机制.方法 MTT方法检测不同浓度香叶木素对肝癌HepG2的细胞活力的影响;流式细胞术检测不同浓度香叶木素处理对HepG2细胞周期阻滞及细胞凋亡的作用;Western blot检测香叶木素处理对细胞p53、Bcl-2、Bax、Cleaved-cas-pase3、Cleaved-caspase8、Cleaved-PARP、Bak、cdc2、cyclinB1、p21等细胞周期调节或细胞凋亡相关蛋白表达的调节.结果 香叶木素能显著抑制人肝癌HepG2细胞的增殖并且诱导细胞凋亡(P<0.05);流式细胞术对细胞周期检测示:香叶木素处理HepG2细胞,使G0/G1期细胞比例显著降低,而G2/M期细胞比例显著升高(P<0.05).香叶木素可下调HepG2细胞中抗凋亡蛋白Bcl-2、cdc2、cyclinB1的蛋白表达,上调p53、p21、Bax、Bak,Cleaved-caspase3、Cleaved-caspase8、Cleaved-PARP等促凋亡蛋白.结论 香叶木素在体外实验能通过激活p53/Bcl-2细胞凋亡通路抑制人肝癌HepG2细胞的增殖及促进细胞凋亡,同时通过上调p53、p21下调cdc2、cyclinB1诱导细胞G2/M周期阻滞.     

乳腺癌干细胞耐放射性与细胞周期的关系

肿瘤的放射疗法是一种建立在细胞周期基础上的治疗方法,乳腺癌干细胞在放疗过程中出现的G2/M期阻滞、衰老途径下调、APE1水平升高及细胞周期调控相关基因p21和p53活性等改变直接或间接导致细胞周期紊乱,均与乳腺癌干细胞的耐放射性密切相关,是分子遗传学和肿瘤生物学研究的热点.