Survivin-ASODN对肝癌SMMC-7721细胞凋亡的促进作用及其机制

目的：应用反义寡核苷酸（ASODN）技术靶向抑制生存素（survivin）基因,研究其对肝癌 SMMC-7721细胞凋亡的影响,阐明survivin反义寡核苷酸（survivin-ASODN）促进SMMC-7721细胞凋亡的作用机制。方法：设计合成survivin-ASODN序列（FAM荧光素标记）。利用脂质体介导法分别用浓度为100、200、300、400和600 nmol?L-1 survivin-ASODN转染SMMC-7721细胞(ASODN转染组),并设空白对照组、空脂质体对照组 和正义寡核苷酸（SODN）对照组。应用流式细胞术(FCM)检测不同浓度survivin-ASODN体外转染SMMC-7721细胞24、48和72 h后SMMC-7721细胞凋亡率及细胞周期;Western blotting法检测survivin蛋白表达水平。结果：与各对照组比较,荧光素标记的ASODN转染SMMC-7721细胞24 h后,细胞生长开始受到抑制,细胞凋亡率增加,呈现剂量-时间依赖性（P<0.05）;作用48 h后,ASODN转染组细胞在G1期前出现明显的亚二倍体凋亡峰,G0/G1期细胞明显减少（P<0.05）,G2/M期细胞显著增加（P<0.05）,细胞被阻滞于G2/M期。与各对照组比较,不同浓度ASODN转染组SMMC-7721细胞survivin蛋白表达水平下降（P<0.05）,且随作用时间的延长而降低（P< 0.05）。结论：survivin-ASODN通过抑制survivin蛋白表达、改变细胞周期进程等机制促进SMMC-7721细胞凋亡,并且呈现时间-剂量依赖性。     

survivin反义寡核苷酸诱导人肝癌细胞凋亡的相关信号转导途径

目的 利用人肝癌细胞株SMMC-7721细胞,探讨survivin基因诱导肝癌细胞凋亡的相关信号转导途径。方法 采用脂质体介导survivin反义寡核苷酸转染人肝癌细胞株SMMC-7721细胞。采用Western印迹及原位杂交检测细胞内survivin蛋白及mRNA的表达。采用流式细胞仪及TUNEL染色检测细胞凋亡的变化。采用western印迹,免疫沉淀,逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）及激酶活性检测方法测定细胞内丝裂原活化蛋白激酶p38(p38MAPK)及半胱氨蛋白水解酶3表达及活性的变化,观察p38MAPK与半胱氨蛋白水解酶3活性变化之间的关系。结果 脂质体介导转染survivin反义寡核苷酸后,SMMC-7721肝癌细胞内survivin蛋白及mRNA表达可分别被下调84.6%及69.7%。凋亡细胞比率由转染前的0.70%增加至31.51%。转染后细胞内p38MAPK及半胱氨蛋白水解酶3表达无明显变化。但其活性显著升高,其中p38MAPK活性升高发生于半胱氨蛋白水解酶3活性升高之前。结论 转染survivin反义寡核苷酸可以有效诱导肝癌细胞发生凋亡,其诱导肝癌细胞凋亡的信号通过顺序激活p38MAPK-半胱氨蛋白水解酶3信号途径传导。     

靶向survivin的RNA干扰下调肺耐药相关蛋白逆转肝癌细胞耐药性的研究

背景 survivin和肺耐药相关蛋白（LRP）都与肝癌耐药有关,但二者之间的关系尚不十分明确。本研究的目的是观察在体外和体内survivin表达下调后,对LRP表达的影响以及逆转肝癌耐药的效果。 方法 应用RT-PCR和Western-blotting检测SMMC-7721细胞和SMMC-7721/ADM细胞中survivin的表达。应用MTT检测两种细胞对ADM的敏感程度。靶向survivin的siRNA转染SMMC-7721/ADM细胞,检测survivin的表达变化、SMMC-7721/ADM细胞对ADM的敏感程度的变化以及LRP的表达变化。建立裸鼠肝癌皮下移植瘤模型。分别应用靶向survivin的siRNA、不同浓度的ADM以及二者联合对裸鼠肝癌皮下移植瘤进行处理,观察抑瘤效果,并观察全身毒性反应。检测瘤体内LRP的表达变化。两样本均数的比较采用t检验。 结果 SMMC-7721/ADM细胞中survivin的表达强于SMMC-7721细胞（P﹤0.05）。转染靶向survivin的siRNA后,survivin的表达与对照组相比显著下调（P﹤0.05）,肝癌耐药细胞对ADM的敏感程度明显增加,LRP的表达与对照组相比显著下调（P﹤0.05）。裸鼠皮下移植瘤转染靶向survivin的siRNA后,肿瘤体积从第8天起,与对照组相比显著减小（P﹤0.05）。联合治疗组中的裸鼠肿瘤体积与其它各组相比显著抑制（P﹤0.05）。siRNA组和联合治疗组中的裸鼠无明显毒性反应。瘤体内LRP的表达与对照组相比显著抑制（P﹤0.05）。 结论 通过RNA干扰下调survivin的表达,在体外及体内都能够增加肝癌的化疗敏感性,通过抑制LRP的表达使肝癌耐药性发生逆转。     

凋亡抑制因子反义寡核苷酸对肝癌细胞生物学作用

目的: 探讨survivin反义寡核苷酸对人肝癌细胞凋亡、增殖、化疗药物敏感性的影响. 方法: 设计合成特异性survivin的反义寡核苷酸(ASODN). 以高表达survivin基因的人肝癌细胞系(SMMC-7721)为靶细胞、ASODN为阻断剂,Western blot法检测细胞survivin表达情况, 通过MTT试验观察ASODN对该细胞系的生长抑制作用, 倒置显微镜观察细胞形态变化, 流式细胞仪分析细胞增殖周期, MTT法检测survivin表达抑制前后细胞对紫杉醇敏感性影响. 结果: ASODN明显抑制了SMMC-7721肝癌细胞的生长, 细胞分裂阻滞在分裂期的中期,并诱导细胞发生凋亡, 而各对照组细胞生长良好; 各ASODN药物组细胞凋亡指数明显高于各对照组(P<0.05)且细胞增殖指数明显低于各对照组(P<0.05); 紫杉醇药物组细胞IC50低于对照组(16.2±2.2) μg/L vs (35.5±4.3) μg/L, P<0.01. 结论: survivin ASODN能下调其蛋白表达, 诱导人肝癌细胞凋亡, 抑制细胞增殖,增加肝癌细胞对化疗药物的敏感性.     

生存素反义寡核苷酸在胃癌化疗中对表阿霉素的增敏性及其信号转导途径研究

目的:通过构建survivin反义寡核苷酸,研究其在胃癌化疗中对表阿霉素(Epirubicin,EPI)的增敏作用及作用机制.方法:构建survivin反义寡核苷酸链(Antiscnse RNA,ASODN)及正义寡核苷酸对照链(SODN),脂质体法转染胃癌SGC-7901细胞,MTT法检测转染组细胞抑制率并筛选出适宜浓度,不同浓度表阿霉素处理胃癌SGC-7901细胞,MTT法检查表阿霉素对其生长抑制作用并筛选出4组浓度做为待测浓度,将2种因素联合作用于SGC-7901细胞,Western-blot法检查survivin蛋白表达情况,MTT法检查表阿霉素对其抑制率,流式细胞仪检查细胞周期,Annexin V-FITC法榆查细胞凋亡情况,RT-PCR法检查bcl-2、SMac mRNA表达情况.结果:经200 nmol/L survivin反义寡核苷酸处理后的SGC-7901细胞对表阿霉素的敏感性明显增加:MTT法示转染后细胞经表阿霉素作用24 h后,抑制率较单独使用表阿霉素的未转染组明显提高(P＜0.05,q＞1.15),流式细胞仪检查示联合作用组使细胞G2/M期细胞数较单独使用表阿霉素组明显增多:Western-blot检查示转染后survivin蛋白表达水平显著降低,Annexin V-FITC检查示转染组细胞凋亡明显增加,RT-PCR检查示:SMac mRNA在联合作用组较空白对照组表达上调.结论:Survivin反义寡核苷酸能够增强SGC-7901细胞对表阿霉素的敏感性,其作用可能是通过上调SMac的表达实现的.     

反义硫代寡核苷酸对786-O细胞survivin基因的表达及生长抑制作用

目的研究survivin反义寡核苷酸对肾透明细胞癌786O细胞表达survivin蛋白、细胞凋亡、增殖的影响。方法设计并合成特异性靶向survivin的反义寡核苷酸(ASODN)。肾透明细胞癌细胞株786O分为6组:空白对照组、脂质体转染对照组、正义链转染对照组、200、400和600nmol/LASODN转染组。作用24h后收获各组细胞。倒置显微镜及透射电子显微镜观察细胞形态变化,免疫组化法检测各组细胞survivin表达情况和流式细胞术检测各组细胞周期变化和凋亡指数,MTT法检测survivin反义寡核苷酸对各组细胞的生长抑制率。结果电镜下可以见到典型凋亡样改变,而各对照组细胞生长良好;各ASODN转染组细胞survivin表达有不同程度减弱;各ASODN转染组细胞凋亡指数明显高于各对照组(P<0.05),以600nmol/LASODN转染组最为明显(P<0.05),而各对照组间差异无显著性(P>0.05)。结论不同浓度survivinASODN转染后能下调survivin蛋白表达,诱导肾透明细胞癌786O细胞凋亡,抑制786O细胞增殖。     

miR-143调控DNMT3B表达对肝细胞癌耐阿霉素敏感性的影响

目的:构建耐药细胞株SMMC-7721/ADM,探讨miR-143在调控肝细胞癌耐阿霉素中的作用机制。方法:采用逐步递增阿霉素浓度法构建耐阿霉素细胞株SMMC-7721/ADM,评估其IC₅₀值;采用荧光定量PCR技术检测miR-143、DNA甲基转移酶3B （DNMT3B）、多耐药基因1（MDR1）变化、Bax和Bcl-2 mRNA表达水平;Western blotting检测DNMT3B蛋白表达;通过转染miR-143 mimics上调耐药细胞株SMMC-7721/ADM中miR-143表达水平后,检测耐药细胞IC₅₀、侵袭能力、细胞凋亡、DNMT3B、MDR1变化。应用脂质体-2000瞬时转染miR-143 mimics于耐药细胞株,观察上述指标变化。结果:成功构建耐药细胞株SMMC-7721/ADM,IC₅₀值升高78.97倍（P<0.01）,miR-143表达量降低,DNMT3B、MDR1、Bax、Bcl-2表达量升高（P<0.05~P<0.01）。转染miR-143 mimics后耐药细胞株IC₅₀值降低57%,侵袭能力下降,细胞凋亡增加,DNMT3B表达减少,MDR1 mRNA表达减少（P<0.01）。结论:miR-143可能通过降低DNMT3B表达提高肝细胞癌对阿霉素的敏感性。     

生存素反义寡核苷酸对肝细胞癌细胞中生存素基因表达的影响

目的检测生存素(survivin)反义寡核苷酸对肝细胞癌细胞中生存素基因及蛋白表达的影响。方法将生存素反义寡核苷酸(ASODN)分为150、500和1000nmol/L3个不同浓度的亚组对SMMC-7721细胞进行转染,并设正义寡核苷酸(SODN)组、空脂质体组及空白组作为对照组。采用逆转录—聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测各组中生存素mRNA的表达,采用流式细胞术(FCM)检测各组中生存素蛋白的表达。结果各ASODN亚组生存素mRNA及生存素蛋白的表达量均低于各对照组(P<0.05或P<0.01)。各ASODN亚组间比较,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01),并呈现剂量依赖性。SODN组、空脂质体组及空白组组间比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。结论利用生存素反义寡核苷酸转染SMMC-7721细胞,可以下调生存素mRNA及其蛋白的表达。     

生存素反义寡核苷酸对人子宫内膜癌细胞增殖的抑制作用

 目的 探讨生存素（survivin）反义寡核苷酸（antisense oligonucleotide,ASODN）对人子宫内膜癌细胞HEC-1B增殖的抑制作用。方法 实验分空白对照组（control组）、单纯脂质体对照组（Lip组）、正义链转染对照组（SODN组）、ASODN转染组（ASODN组）4组。人工合成正、反义寡核苷酸,经脂质体将survivin正、反义寡核苷酸转染入子宫内膜癌细胞48 h后收集各组细胞。免疫印迹（Western blot）法检测各组细胞生存素表达情况,流式细胞仪检测各组细胞凋亡率,四甲基偶氮唑蓝试验（MTT）法检测细胞生长抑制情况。结果 脂质体介导生存素反义寡核苷酸转染后的子宫内膜癌细胞出现生存素蛋白表达明显下降;ASODN转染组细胞凋亡率和增殖抑制率均明显高于各对照组（P<0.05）,而各对照组间差异无统计学意义（P>0.05）。结论 生存素反义寡核苷酸转染子宫内膜癌细胞能下调生存素蛋白表达,诱导子宫内膜癌细胞凋亡,抑制细胞增殖,对子宫内膜癌是一种有效的基因疗法。     

survivin反义寡核苷酸诱导胃癌细胞凋亡及对多西他赛的增敏作用

目的探讨生存素（survivin）反义寡核苷酸（antisense oligonucleotide,ASODN）对人胃癌细胞株SGC7901的凋亡诱导、对多西他赛的化疗增敏作用。方法设计合成特异性靶向survivin ASODN。将胃癌细胞株分为空白对照组（Sham组）、单纯脂质体对照组（Lip组）、正义寡核苷酸转染对照组（Lip-SODN组）、ASODN转染组（Lip-ASODN组）。转染48 h后,Western blot法检测各组细胞survivin表达情况,流式细胞仪检测各组细胞凋亡率,MTT法检测转染细胞对多西他赛的敏感性。结果脂质体介导survivin ASODN转染后的胃癌细胞survivin蛋白表达明显下降,细胞凋亡率明显高于各对照组（P〈0.05）,对多西他赛的IC50值明显低于各对照组（P〈0.05）,细胞生长抑制率明显高于各对照组（P〈0.05）。结论survivin ASODN转染胃癌细胞能下调survivin蛋白表达,诱导胃癌细胞凋亡,抑制细胞增殖,增强多西他赛化疗敏感性。     

Down-regulation of lung resistance related protein by RNA interference targeting survivin induces the reversal of chemoresistances in hepatocellular carcinoma

Background Both survivin and lung resistance related protein （LRP） are hepatocellular carcinoma （HCC）. But the relationship between survivin and LRP is investigate the effects of down-regulation of survivin on LRP expressions and the both in vitro and in vivo. related to the chemoresistances in ndefinite. The aim of this study was to reversal of chemoresistances in HCC Methods The expressions of survivin were detected by RT-PCR and Western blotting in HCC cell line SMMC-7721 and SMMC-7721/ADM. The sensitivities of these two cell lines to ADM were evaluated by MTT assays. SiRNA which targeted survivin was transfected into SMMC-7721/ADM cells, then the sensitivity of SMMC-7721/ADM cells to ADM and the expressions of survivin and LRP were detected respectively. SMMC-7721/ADM cells were transplanted subcutaneously into nude mice to establish xenograft tumors. Antitumor activities of RNA interference （RNAi） targeting survivin, various doses of ADM and combination therapies were observed respectively. Possible toxicities were evaluated. LRP expression changes were tested. Student＇s ttest was used for evaluating statistical significance. Results The expressions of survivin in SMMC-7721/ADM cell line showed significant elevation compared to those in SMMC-7721 cell line （P 〈0.05）. Positive siRNA down-regulated the expressions of survivin significantly （P 〈0.05）. SiRNA targeting survivin could sensitize SMMC-7721/ADM cells to ADM and down-regulate the expressions of LRP significantly （P 〈0.05）. Growths of the tumors were significantly inhibited in positive siRNA group as compared with those in the control group from the 8th day （P 〈0.05）. Combination therapies caused significant tumor inhibitions compared with tumors of nude mice in the other three groups respectively （P 〈0.05）. No toxicities were found in nude mice treated by siRNA and combination therapies. The expressions of LRP were markedly reduced in tumors treated with siRNA targeting survivin （P 〈0.05）. Conclusions Down regulation of survivin gene by RNAi can increase chemosensitivity of HCC both in vitro and in vivo. The reversal of drug resistance may be reduced through the inhibitions of LRP.     

Effects of HSP70 antisense oligonucleotide on the proliferation and apoptosis of human hepatocellular carcinoma cells

The study investigated the effects of heat shock protein 70(HSP70) antisense oligonucleotide(ASODN) on the proliferation and apoptosis of a human hepatocellular carcinoma cell line(SMMC-7721 cells) in vitro.HSP70 oligonucleotide was transfected into SMMC-7721 cells by the mediation of SofastTM transfection reagent.Inhibition rate of SMMC-7721 cells was determined by using MTT method.Apoptosis rate and cell cycle distribution were measured by flow cytometry.Immunocytochemistry staining was used to observe th...     

生存素反义寡核苷酸对人胃癌细胞增殖的抑制作用

目的 探讨生存素（survivin）反义寡核苷酸（ASODN）对人胃癌细胞SGC7901增殖的抑制作用。方法 设计合成特异性靶向生存素的反义寡核苷酸。胃癌细胞株SGC7901分为4组：空白对照组、单纯脂质体对照组、正义链转染对照组、ASODN转染组。作用48h后收获各组细胞。Westernblot法检测各组细胞生存素表达情况，流式细胞仪检测各组细胞凋亡率，MTT法检测各组细胞的生长抑制率。结果 脂质体介导生存素反义寡核苷酸转染后的胃癌细胞出现生存素蛋白表达明显下降；ASODN转染组细胞凋亡率明显高于各对照组（P〈0．05），而各对照组问差异无显著性（P〉0．05）；ASODN转染组细胞的抑制率明显高于各对照组（P〈0．05），而各对照组问差异无显著性（P〉0．05）。结论 生存素反义寡核苷酸转染胃癌细胞能下凋生存素蛋白表达，诱导胃癌细胞凋亡，抑制细胞增殖，具有明显的抗癌作用。     

重组人内皮抑素对人肝癌细胞SMMC-7721增殖及凋亡的影响

目的 初步研究Wnt通路在重组人血管内皮抑素(rh-Endostatin,ES)诱导人肝癌细胞SMMC-7721增殖、凋亡过程中的作用及可能机制.方法 分别以50、100、200、400 μg/ml ES体外处理人肝癌细胞株SMMC-7721,利用MTT比色法检测不同浓度、时间ES作用下的细胞增殖状态;利用流式细胞仪检...     

Survivin反义寡核苷酸对肝癌细胞株SMMC-7721增殖的影响

目的:应用反义寡核苷酸技术研究凋亡抑制蛋白Survivin反义寡核苷酸对肿瘤细胞增殖的影响。方法:根据Survivin序列合成其反义寡核苷酸序列(Survivin-ASODN)。培养肝癌细胞株SMMC-7721,用荧光素标记的Survivin-ASODN转染,并设立空白对照、空脂质体对照及正义寡核苷酸(SODN)对照组;用PCR方法检测Survivin基因表达水平;通过MTT方法分析Survivin-ASODN转染对肝癌细胞增殖的影响。结果:荧光素标记的Survivin-ASODN在SMMC-7721细胞中的转染率达到60%以上。SMMC-7721细胞分别用100、200、300、400和600nmol·L1ASODN转染后,Survivin基因表达水平下降,细胞增殖抑制率24h时分别为(3.87±1.67)%、(9.21±2.21)%、(15.21±3.18)%、(21.32±3.43)%和(32.62±3.74)%,而300nmol·L1ASODN组48h时细胞生长抑制率为(29.21±4.12)%,72h时抑制率为(44.21±3.32)%;ASODN转染组细胞增殖抑制率与空白对照组、空脂质体组及SODN组比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论:Survivin-ASODN对细胞增殖有抑制作用,且呈现剂量依赖性;并且随着作用时间的延长,其抑制效果增强。