乙醛及其刺激的Kupffer细胞对肝星状细胞活化的影响

目的 探讨乙醛及其刺激的Kupffer细胞对大鼠肝星状细胞(HSCs)活化的影响.方法 用链酶蛋白酶和胶原酶原位灌流,Nycodenz密度梯度法离心分离大鼠肝脏HSCs和Kupffer细胞,制备乙醛刺激的Kupffer细胞培养上清液(KCCM),并以MTT法观察乙醛及乙醛与Kupffer共同培养的KCCM对HSCs的增殖效应,以放射免疫法检测HSCs培养上清液中Ⅳ型胶原的含量.结果 乙醛直接作用于HSCs后HSCs明显增殖,并能合成分泌Ⅳ型胶原;未用乙醛处理和经乙醛处理后的KCCM均能使HSCs增殖并生成Ⅳ型胶原,两组之间差异无统计学意义(P＞0.05).结论 乙醛可促进HSCs活化,与酒精性肝病时肝纤维化的发生有关.乙醛不能直接作用于Kupffer细胞引起HSCs活化.     

SD大鼠肝细胞、Kupffer分离与培养/共同培养的实验研究

目的 建立稳定高效分离SD大鼠肝细胞与Kupffer细胞的实验流程,研究SD大鼠Kupffer细胞与肝实质细胞共同培养Kupffer细胞对肝实质细胞生长、形态功能的影响,为体外原代培养肝细胞的应用及进行相关研究提供参考数据.方法 (1)原位2步Ⅳ型胶原灌注法消化SD大鼠的肝脏;(2)低速离心法分离肝实质细胞;(3)Percoll液密度梯度离心法分离肝Kupffer细胞;(4)单独培养肝实质细胞;以61比例贴壁共培养肝实质细胞与Kupffer细胞;(5)光镜分别观察单独培养与共同培养情况下肝实质细胞的生存和形态;(6)全自动生化仪检测单独与共同培养情况下培养上清白蛋白和糖水平并进行比较.结果 每只大鼠可分离的肝细胞产量平均为(2.03±0.26)×108,细胞活力为88%～95%,平均(91.7±2.11)%.Kupffer细胞产量平均为(3.19±0.20)×107,纯度为85%～92%.平均(88.5±1.83)%.192 h原代贴壁培养观察,单独培养组肝细胞的生长、增殖迅速,并向正常肝细胞的形态演变.2周后细胞开始死亡,培养至21 d时细胞全部死亡.结论 (1)通过本实验研究成功地建立了以肝下腔静脉为流人道的Ⅳ型胶原酶二步灌流法分离肝实质细胞以及联合Pereoll液密度梯度离心法分离Kupffer细胞的实验室操作程序.该操作程序稳定高效实用.(2)按61的比例在体外进行肝实质细胞与Kupffer细胞192 h贴壁共同培养实验,实验结果提示,肝实质细胞和Kuffer细胞在适宜的培养条件下可进行共培养;这两种细胞简单的同步贴壁共同培养,肝细胞的生长、白蛋白合成功能和糖代谢会受到影响,提示在共培养体系中,要实现肝实质细胞租Kupffer细胞良好生长和两者功能的协调发挥,尚需进一步建立更适宜的共同培养系统.     

氟烷性肝炎免疫应答中Kupffer细胞的抗原递呈作用和MHC限制

目的：探讨豚鼠氟烷性肝炎免疫应答中Kupffer细胞的抗原递呈作用。方法：雄性Hartley豚鼠16只，随机分为2组，每组8只，实验组：每隔42d在40％O2下吸入1％氟烷4h,共3次，对照组，每隔42d吸入40％O24h，共3次，两组在最后一次吸入后21d分离淋巴细胞和肝Kupffer细胞，两组细胞按一定比例混合培养3d，终止培养前18h加入氚标记胸腺嘧啶核苷（3H－TdR)，通过淋巴细胞转化试验（LTT）分析机体吸入氟烷后诱导免疫应答过程中Kuppffer细胞的抗原递呈作用,结果：氟烷诱导豚鼠Kupffer细胞对自体淋巴细胞有显著的促增殖作用（P＜0．01），对同种异体淋巴细胞无促增殖作用，而未吸氟烷豚鼠Kupffer细胞对自体／同种异体淋巴细胞均无促增殖作用，Kupffer细胞数目与淋巴细胞增殖有显著相关性（r=0.9950），用TFA抗原致敏的Kupffer细胞对淋巴细胞的促增殖能力作用更强，脾脏巨噬细胞不能增加TFA－GSA抗原促进自体淋巴细胞增殖的作用。结论：Kupffer细胞是氟烷性肝炎免疫机制中重要的抗原递呈作用。能明显促进机体免疫应答，其抗原递呈作用受MHC限制。     

大鼠肝细胞与Kupffer细胞共同培养对两者功能和形态影响

目的观察大鼠肝实质细胞与Kupffer细胞体外共同培养时对两者生长、形态及功能的影响。方法采用原位二步Ⅳ型胶原灌注法、Percoll液密度梯度离心法分离Wistar大鼠肝实质细胞与Kupffer细胞;体外将肝实质细胞与Kupffer细胞按6∶1比例共同培养。观察不同情况下肝细胞生存时间和形态,每隔24 h检测培养上清液中清蛋白和谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)的水平,并在培养36 h用放免法检测上清液中白细胞介素1(IL-1)、白细胞介素6(IL-6)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)含量。结果单独培养组肝细胞的生长、增殖迅速,并向正常肝细胞的形态演变,肝细胞可培养存活至15 d;共同培养组肝细胞生长增殖缓慢,细胞可培养存活至10 d。共同培养组上清液中清蛋白水平在24、36、48、60 h比单独培养组低(t=2.551~3.139,P<0.05);ALT、AST水平在24、36、48、60 h比单独培养组高(t=2.446~3.108,P<0.05);共同培养组Kupffer细胞保持IL-1I、L-6、TNF-α分泌功能,而单独培养组未检测到IL-1I、L-6、TNF-α。结论大鼠Kupffer细胞和肝实质细胞在适宜的培养条件下可进行共同培养,二者可以保持良好的分泌功能,可用于实验研究。     

大鼠肝细胞、Kupffer细胞体外共同培养的初步研究

目的研究SD大鼠Kupffer细胞与肝实质细胞体外共同培养时肝实质细胞生长、形态及功能状况.方法原位二步IV型胶原灌注法联合Percoll液密度梯度离心法分离肝实质细胞与Kupffer细胞;体外进行两种细胞单独培养、肝细胞与Kupffer细胞按6∶1比例共同培养,观察不同情况下肝细胞生存时间和形态,检测培养上清中白蛋白和糖的水平.结果单独培养组肝细胞的生长、增殖迅速,并向正常肝细胞的形态演变,肝细胞可培养存活至21 d;共同培养组肝细胞于48 h即开始出现少量的死亡细胞,细胞生长增值缓慢,细胞可培养存活至10 d.单独培养组上清白蛋白水平在48、96、120、144、168 h比混合培养组高(P<0.05);单独培养组上清糖水平在96、144、168 h高于混合培养组(P<0.05).结论肝实质细胞和Kupffer细胞在适宜的培养条件下可进行共培养;但共培养时肝细胞的生长、白蛋白合成功能和糖代谢会受到影响,肝细胞存活时间缩短,提示在共培养体系要实现肝实质细胞和Kupffer细胞两者良好生长和功能的协调,体外共培养条件需进一步优化.     

肝纤维化的细胞和分子机制

肝纤维化（hapotic fibrosis）是与慢性肝脏损伤相关的肝脏瘢痕修复反应,是多种慢性肝病进展至肝硬化的中间过程,其机制是持续性的肝实质细胞的损伤和（或）炎症,其特征是富含Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白的细胞外基质（extracellular matrix , ECM ）合成与降解失衡［1］。持续性的肝实质细胞损伤和（或）炎症最终导致部分患者肝硬化（hapotic cirrhosis）。在欧洲,酒精性肝硬化最多见,约占全部肝硬化的50％～90％,在中国约80％的肝硬化与乙肝病毒感染有关［2］。肝脏成肌纤维细胞（hepatic myofibroblasts）参与了肝纤维化的病理过程,其主要来源于肝星状细胞（hepatic stellate cells ,HSC ）和门静脉成纤维细胞（portal fibroblasts）。肝纤维化形成过程受复杂的信号分子网络调控。近年来,研究发现自噬与表观调控也参与了肝纤维化过程。通过清除肝成肌纤维细胞,终止纤维形成过程中的信号通路,可以控制慢性肝脏损伤,从而实现对肝纤维化的逆转。     

SD大鼠肝细胞、Kupffer分离与培养/共同培养的实验研究(摘要)

目的 建立稳定高效分离SD大鼠肝细胞与Kupffer细胞的实验流程,研究SD大鼠Kupffer细胞与肝实质细胞共同培养Kupffer细胞对肝实质细胞生长、形态功能的影响,为体外原代培养肝细胞的应用及进行相关研究提供参考数据.方法 (1)原位2步Ⅳ型胶原灌注法消化SD大鼠的肝脏;(2)低速离心法分离肝实质细胞;(3)Percoll液密度梯度离心法分离肝Kupffer细胞;(4)单独培养肝实质细胞;以6:1比例贴壁共培养肝实质细胞与Kupffer细胞;(5)光镜分别观察单独培养与共同培养情况下肝实质细胞的生存和形态;(6)全自动生化仪检测单独与共同培养情况下培养上清白蛋白和糖水平并进行比较.结果 每只大鼠可分离的肝细胞产量平均为(2.03±0.26)×108,细胞活力为88%～95%,平均(91.7±2.11)%.Kupffer细胞产量平均为(3.19±0.20)×107,纯度为85%～92%.平均(88.5±1.83)%.192 h原代贴壁培养观察,单独培养组肝细胞的生长、增殖迅速,并向正常肝细胞的形态演变.2周后细胞开始死亡,培养至21 d时细胞全部死亡.结论 (1)通过本实验研究成功地建立了以肝下腔静脉为流人道的Ⅳ型胶原酶二步灌流法分离肝实质细胞以及联合Pereoll液密度梯度离心法分离Kupffer细胞的实验室操作程序.该操作程序稳定高效实用.(2)按6:1的比例在体外进行肝实质细胞与Kupffer细胞192 h贴壁共同培养实验,实验结果提示,肝实质细胞和Kuffer细胞在适宜的培养条件下可进行共培养;这两种细胞简单的同步贴壁共同培养,肝细胞的生长、白蛋白合成功能和糖代谢会受到影响,提示在共培养体系中,要实现肝实质细胞租Kupffer细胞良好生长和两者功能的协调发挥,尚需进一步建立更适宜的共同培养系统.     

非编码RNA与肝纤维化的研究进展

肝纤维化是一个病理生理过程,其中细胞外基质在肝组织中的过度沉积和结缔组织的异常增殖是由各种致病因子长期刺激引起的,肝纤维化的本质是一种炎症增生修复反应。许多非编码RNA(ncRNA)与肝纤维化的发生、发展关系密切,其在肝脏细胞的增殖、活化、凋亡、分解及信号通路调节等方面发挥重要作用,探索其在肝纤维化过程中的调控机制,不仅可以进一步熟悉和理解肝纤维化的病理生理过程,还可以寻找合适的分子靶点,为肝纤维化的诊断、治疗和预后提供新思路。     

Ito细胞在四氯化碳诱发大鼠肝硬化过程中演变的动态研究

通过免疫组化、组化、电镜及图象分析对四氯化碳诱发大鼠肝硬化过程中结强白(desmin,DM)阳性细胞、溶菌酶(lysozyme,LZ)阳性细胞和纤维联接蛋白(fibronectin,FN)及胶原纤维、网状纤维的演变作了动态观察,发现实验早期DM阳性细胞增加明显,DM表达增强;中期形成以DM阳性细胞为主的细胞纤维间隔;晚期纤维间隔中DM阳性细胞仅存在于间隔边缘部。FN除峰值前移外,与DM阳性细胞的演变基本平行。LZ阳性细胞经历由递增到递减的变化过程。结果提示DM免疫组化染色为Ito细胞及其过渡型的良好标志;Ito细胞、肌纤维母细胞、纤维母细胞可能属于同一细胞系统的不同阶段形式,它们肝硬化的组织发生中起着重要作用,并可能受FN及Kupffer细胞的影响。     

肝切除后大鼠Ito细胞肝细胞生长因子mRNA表达的变化

目的：探讨Ito细胞在大鼠肝再生中的作用一方法：分离大鼠2／3肝切除术后不同时间(6h、12h、24h)以及未切除肝的Ito细胞，提取其总RNA，采用半定量RT-PCR方法检测其肝细胞生长因子(HGF)mRNA的表达。结果：分离的Ito细胞纯度达91％．肝2／3切除术后大鼠6h、12h和24h分离的Ito细胞HGF mRNA的表达较未切除组分别升高了14．6倍、21．1倍和11倍结论：Ito细胞在肝大部分切除大鼠早期表达HGF mRNA升高，表明其在肝再生启动过程中具有重要作用。     

来氟米特对肝星状细胞增殖和胶原合成的影响

目的:研究来氟米特活性代谢物A771726对肝星状细胞(HSC)增殖和胶原合成的影响.方法:用链蛋白酶和胶原酶原位肝灌注、Nycodenz密度离心法分离大鼠HSC和Kupffer细胞,制备Kupffer培养上清液(KCCM),并以不同浓度、不同培养时间的CCl4损伤的KCCM作为刺激因素观察了A771726对HSC增殖(3H-TdR掺入法)和胶原合成(3H-Pro掺入法)的影响.ELISA法测定KCCM内TGF-β、TNF-α和IL-1含量.结果:HSC和Kupffer细胞得到较好的分离.CCl4损伤的KCCM显著增加HSC增殖和胶原合成,并且稀释度为1:2的KCCM在培养7 d时,对HSC增殖和胶原合成的刺激作用明显.A771726(0.001～10 μmol/L)对CCl4损伤的KCCM刺激HSC增殖和胶原合成有不同程度的抑制作用,并且A771726(0.001～10 μmol/L)明显抑制CCl4损伤KCCM内升高的TGF-β、TNF-α和IL-1水平.结论:CCl4损伤的KCCM可明显刺激HSC增殖和胶原合成,而A771726对此有明显的抑制作用,并且与其抑制致HSC激活的因子如TGF-β、TNF-α和IL-1分泌有关.     

Serum pharmacological effects of Fuzheng Huayu Decoction on Ito cell proliferation and collagen synthesis in rats) on Ito cell proliferation and collagen synthesis in rats

Objective: To explore mechanism of the effect of Fuzheng Huayu Decoction on Ito cell proliferation and collagen synthesis.Methods: Biological effects of the drug serum taken from rats fed with Fuzheng Huayu decoction (FZHYD) on cell proliferation and collagen synthesis of Ito cell line were observed. Serum collected from rats at various times (1, 2 or 3 hours) after animals were fed with FZHYD once (It) or twice (2t, 2nd time repeated with the same dose), was incubated with Ito cell.Results: The lt-2h serum in 0. 46 g/kg FZHYD group, it seems to prevent cell proliferation, but had no significant difference. While all 2t drug serum could inhibit cell proliferation. The 2t-lh drug serum had no obvious effects on Ito cell morphology, but could improve cell viability, its effect on cell proliferation was dose and serum concentration dependent. Also the 2t-lh drug serum in all doses could inhibit Ito cells both intracellular and extracellular collagen production, the drug serum of 0.46 g/kg group had inhibitory effect in serum concentration dependent manner and similar effect as colchicine.Conclusion: Inhibition of Ito cells proliferation and collagen synthesis is perhaps one of main mechanism of FZHYD in antifibrotic action.     

超声波评分系统评估病毒性肝炎相关性肝纤维化

目的 了解肝、胆、脾超声波检查指标与肝脏纤维化程度的相关性,探讨代偿性肝炎后肝硬化超声波筛检诊断组合。方法 统计248例慢性肝炎病人超声波检查资料及肝组织病理学诊断。进行回顾性统计学分析。结果肝组织纤维化状态与肝包膜光滑度、门静脉内径无相关性;不同肝组织纤维化状态的肝实质回声均匀度、血管走行、胆囊壁状态及脾大程度有统计学差别：上述4个指标正常时．其肝硬化阴性预告值高达96．3％,评分≥5可筛检出90％代偿性肝硬化,7诊断代偿性肝硬化的准确率85．9％、特异性度高达95．2％。但灵敏度低至37．5％。结论 代偿性肝硬化超声波肝实质回声、血管走行、胆囊壁状态及脾大等指标与其他肝纤维化状态有显著差别,其评分系统可作为慢性肝炎病人筛检代偿性肝硬化的灵敏诊断系统。     

茅台酒对肝脏的作用及其影响的实验研究

目的：探讨饮用贵州茅台酒（下称茅台酒）对肝纤维化发生的影响及其可能的作用机制。方法：（1）雄性SD大鼠用茅台酒灌胃连续56天后,处死并剖腹取肝,测肝组织金属硫蛋白和丙二醛含量;2）分离鼠肝星状细胞及人肝星状细胞株做体外试验,观察茅台酒对肝星状细胞增殖和胶原生成的影响;（3）SD大鼠茅台酒灌胃,连续14周,取肝右叶进行病理组织学检查。结果：（1）茅台酒诱导大鼠肝脏金属硫蛋白含量比正常对照组增加22倍,经茅台酒诱导处理的大鼠用CC14中毒损伤,肝脂质过氧化产物丙二醛的形成较对照组明显减少（P＜0．05）;（2）茅台酒呈浓度依赖性抑制肝星状细胞增殖,对胶原基因的表达与蛋白质分泌均有一定的抑制作用;（3）茅台酒诱导高脂低蛋白饮食大鼠肝内有脂滴沉积,并有脂肪变性,肝间质仅有轻度纤维化,乙醇对照组大鼠肝脏呈典型肝硬化改变。结论：茅台酒诱导肝脏金属硫蛋白含量增加,从多环节抑制星状细胞的活化及其胶原蛋白生成可能是干预肝纤维化形成的重要机制。     

维生素E抑制同型半胱氨酸介导的血管平滑肌细胞增殖

目的 探讨在同型半胱氨酸诱导的血管平滑肌细胞(VSMC)增殖中,活性氧(ROS)的作用和维生素E的影响.方法 [3H]-胸腺嘧啶脱氧核苷掺人法测定细胞DNA合成率,锥虫蓝染色计数细胞数量,DCF-DA荧光探针测定细胞内ROS.结果 (1)同型半胱氨酸诱导VSMC的DNA合成增加,促进细胞增殖和ROS水平升高;尽管半胱氨酸诱导VSMC内ROS水平升高,但是对细胞DNA合成和增殖无影响.(2)过氧化氢酶抑制同型半胱氨酸介导的VSMC内ROS升高,而对VSMC增殖无影响.(3)α-生育酚、β-生育酚均可抑制同型半胱氨酸诱导VSNC内ROS水平升高,但是只有α-生育酚显著抑制VSMC增殖.结论 ROS升高不是同型半胱氨酸诱导的VSMC增殖的原因之一.维生素E降低同型半胱氨酸诱导的VSMC增殖可能与抑制蛋白激酶C活性有关,而与它的抗氧化性无关.     

维生素E影响肿瘤坏死因子-α对贮脂细胞增殖及胶原合成的作用

目的：研究维生素Ｅ（ＶｉｔＥ）对大鼠贮脂细胞增殖及胶原合成的影响。方法：以链酶蛋白酶和胶原酶液原位循环灌注法分离大鼠贮脂细胞,以肿瘤坏死因子－α作为刺激因素,采用３Ｈ－胸腺嘧啶核苷（３Ｈ－ＴｄＲ）和３Ｈ－脯氨酸（３Ｈ－ｐｒｏｌｉｎｅ）掺入法分别测定ＶｉｔＥ对贮脂细胞增殖和胶原合成的影响,并在倒置显微镜下观察贮脂细胞的形态。结果：（１）肿瘤坏死因子－α能明显促进贮脂细胞增殖,并能明显抑制其胶原合成;（２）ＶｉｔＥ能显著抑制肿瘤坏死因子－α引起的贮脂细胞增殖,并能增强肿瘤坏死因子－α对贮脂细胞胶原合成的抑制作用。结论：ＶｉｔＥ对贮脂细胞增殖及胶原合成具有抑制作用,这可能是ＶｉｔＥ抗肝纤维化作用的重要机制之一。     

十全大补汤抗小鼠黑色素瘤作用及与顺铂联合用药的研究

目的 探讨十全大补汤（SQDB）对小鼠黑色素瘤的抑制作用及机制,阐明其与顺铂（DDP）联合用药的作用效果及给药方式。方法 流式细胞术考察SQDB对小鼠黑色素瘤细胞B16F10细胞周期及凋亡的影响;分离小鼠脾细胞,MTS法考察SQDB对刀豆蛋白A（Con A）及脂多糖（LPS）促进小鼠脾细胞向T、B淋巴细胞转化的影响;构建小鼠黑色素瘤皮下移植瘤模型,通过 HE染色、免疫组化、TUNEL染色等方法考察SQDB的抑瘤作用;构建小鼠黑色素瘤转移瘤模型,探讨SQDB抗肿瘤转移作用及潜在机制。结果 10 mg/mL的SQDB能诱导B16F10黑色素瘤细胞凋亡;2.5、5、10 mg/mL SQDB减少了G₀/G₁期细胞数;10 mg/mL SQDB增加了S期细胞数;2.5 mg/mL SQDB增加了G₂/M期细胞数。5%和10%含药血清能够促进Con A所致B淋巴细胞增殖;5%、10%和15%含药血清对于LPS所致T淋巴细胞增殖亦有一定促进作用。同时,SQDB与DDP联用能够显著抑制肿瘤细胞增殖,促进肿瘤细胞凋亡;在小鼠黑色素瘤转移模型中,DDP与SQDB同时合用,或者先用DDP再用SQDB均能显著抑制黑色素瘤肺转移;两者同时给予能够显著提高小鼠胸腺指数,而先给SQDB再给DDP则显著逆转小鼠脾指数下降的现象,单用SQDB能够降低肿瘤组织局部IL-1β水平,促进IL-4分泌,从而抑制肿瘤转移。结论 SQDB能够抑制黑色素瘤B16F10增殖,促进其凋亡及小鼠脾淋巴细胞增殖;与DDP同时或贯序使用能够增强对小鼠移植瘤及转移瘤模型的抑制作用。      

脂肪和肥胖相关基因通过TLR2/p38信号通路促进异位子宫内膜间质细胞纤维化

目的：探讨脂肪和肥胖相关基因（FTO）对异位子宫内膜间质细胞（eESCs）纤维化的影响及其机制。方法：采用实时定量聚合酶链反应（qRT-PCR）检测子宫内膜异位症（EMs）患者病变组织中m6A相关基因的表达；通过慢病毒载体过表达FTO，在eESCs中检测纤维化相关基因的表达；通过m6A2 Target数据库和MeRIP-qPCR预测和验证eESCs中FTO与Toll样受体2（TLR2）的关系；Western blot法检测p38的蛋白表达变化。结果：FTO在EMs中表达下调（P ＜0.05）；FTO过表达促进eESCs纤维化并抑制其增殖（P ＜0.05）；在eESCs中，FTO通过TLR2 的m6A修饰途径上调其蛋白水平（P ＜0.05）；FTO在eESCs中经TLR2/p38 信号通路促进细胞纤维化（P ＜0.05）。结论：FTO在EMs中低表达，上调FTO可能通过TLR2/p38信号通路促进eESCs纤维化。     

蒿鳖养阴软坚方对TGF-β1诱导的肝纤维化的作用

目的:研究蒿鳖养阴软坚方在体外对LX-2细胞的影响,从而探讨蒿鳖养阴软坚方对TGF-β1诱导的肝纤维化的作用。方法:体外培养人肝星状细胞LX-2,实验分为正常对照组、TGF-β1刺激组和蒿鳖养阴软坚方低、中、高浓度给药组。MTT法检测LX-2细胞增殖情况;比色法检测细胞培养液中乳酸脱氢酶（LDH）的活性;酶消化法检测细胞上清羟脯氨酸（Hyp）的含量;Western blot法检测collagen Ι以及α-SMA蛋白表达量。结果:TGF-β1作用于LX-2能够明显促进细胞的增殖,collagen I、α-SMA的表达量显著升高。蒿鳖养阴软坚方能抑制LX-2细胞增殖并且能够降低collagen Ι和α-SMA的表达。结论:蒿鳖养阴软坚方能够显著抑制LX-2增殖,下调collagen Ι和α-SMA的表达,降低Hyp生成,从而发挥抗肝纤维化的作用。