大鼠胚胎发育后期胰腺中Mesothelin的表达

目的: 探讨大鼠胰腺胚胎发育后期胰岛形成及β细胞功能完善相关的基因表达调控. 方法:采用高密度寡核苷酸芯片(Affymetrix芯片)对孕15.5(E15.5)和E18.5胰腺进行基因转录水平分析并用RT-PCR验证基因在大鼠胰腺E12.5,E15.5,E18.5,初生和成年这五个不同发育时期的表达情况. 结果:在差异或特异表达的基因中与胰腺细胞分化相关的转录因子和信号分子表达均下调,而与胰岛结构形成及β细胞代谢功能完善相关的基因表达上调,其中细胞黏附分子Mesothelin是在E18.5特异表达的基因,RT-PCR亦显示Mesothelin在大鼠胰腺胚胎发育后期特异性高表达. 结论: Mesothelin可能对胰岛结构的形成和功能的完善及维持有重要作用.     

大鼠胰腺发育过程中胰岛素释放功能完善的研究

目的: 明确大鼠胰腺发育不同时期胰岛素合成及释放相关基因的表达差异,探讨胰岛素分泌功能完善的过程? 方法:分离并提取SD大鼠胚胎发育12.5天(E12.5)?E15.5?E18.5?新生?出生后21天及成年大鼠胰腺组织,利用Affymetrix公司的高密度寡核苷酸芯片检测大鼠发育各阶段胰腺组织基因表达谱并分析胰岛素合成及释放相关基因的特异及差异表达情况?分别进行正常新生鼠?成年鼠血糖水平及正常新生第1?3?7?10?12天大鼠腹腔葡萄糖耐量试验(IPGTT)?采用ELISA法测定新生鼠和成年鼠血中胰岛素浓度?新生大鼠胰岛细胞原代培养观察新生鼠胰岛细胞的形态?结果:在胰岛素合成及释放相关基因中,胰岛素基因及其特异性转录因子如PDX-1在大鼠E12.5~E15.5时即开始有表达,以后胰岛素基因持续存在且表达增多;胰岛素胞吐过程中的关键基因Syntaxin-1a?Vamp-2?Rab-3a?Munc13-1等从E15.5开始出现,以后表达量亦增多;而葡萄糖刺激的胰岛素分泌(GSIS)相关基因中,葡萄糖转运体-2(Glut2)在胚胎早期开始表达,葡萄糖激酶(GCK)在胚胎中晚期才表达?自E18.5即检测到大鼠血中胰岛素的存在,随着胚胎的发育,血胰岛素浓度逐渐升高?新生大鼠对葡萄糖负荷不能耐受,出现IPGTT异常,出生1周以后IPGTT才逐渐趋于正常?新生鼠的胰岛形态与成年鼠相似,但体积相对较小,透亮度稍差?结论:大鼠胚胎胰腺发育早中期即已具备胰岛素合成及分泌的能力,但新生鼠刚出生时,其胰岛功能仍尚未完善,出生以后才逐渐对葡萄糖负荷有良好的反应性?     

大鼠胰腺发育不同阶段肝细胞生长因子受体编码基因的表达

目的研究肝细胞生长因子受体编码基因c-met在大鼠胰腺发育不同阶段的表达。方法采用高密度寡核苷酸芯片对孕12.5 d（E12.5）、孕15.5 d和孕18.5 d、新生、成年胰腺进行基因转录水平分析,并用RT-PCR技术验证基因在大鼠胰腺不同发育时期的表达。结果c-met基因在E15.5、E18.5较成年特异性高表达。经RT-PCR验证,c-met基因表达趋势与芯片结果相符;与芯片c-met探针所用引物不同RT-PCR,结果却在各发育阶段呈现与芯片不同的表达趋势。结论提示c-met可能在胰腺发育过程中起到调控作用,参与胚胎胰腺发育中晚期细胞功能完善的信号传导过程。并且c-met在胰腺发育中发挥作用有可能存在不同转录本。     

大鼠胰腺发育过程中Munc13-1对胰岛素释放功能的影响

目的:研究大鼠胰腺发育不同阶段Munc13-1基因及蛋白表达的变化及Munc13-1在胰岛素释放过程中的作用. 方法:应用显微分离及提取技术获得大鼠胚胎发育12.5d(E12.5),E15.5,E18.5,新生大鼠,出生后21 d(P21)及成年大鼠胰腺组织;另外,从大鼠胚胎发育15 d开始给予孕鼠半量饮食,造成宫内发育迟缓动物模型,提取其新生大鼠胰腺组织. 采用RT-PCR, Real-time PCR和Western blot技术确定Munc13-1的表达情况,并测定不同发育时期血中胰岛素浓度. 结果:胰岛素基因从E12.5开始出现,Munc13-1基因从E15.5开始表达,随着胎龄的增长,二者表达量皆增多. E15.5和E18.5时munc13-1蛋白表达量较少,以后明显增多. 自E18.5即检测到血中胰岛素的存在,随着胚胎的发育,血胰岛素浓度逐渐升高. 宫内发育迟缓新生大鼠比正常新生大鼠血胰岛素浓度低,同时Munc13-1基因及蛋白表达量亦比正常对照组明显减少. 结论:Munc13-1在胰岛素释放过程中的作用,随着胚胎发育期胰岛素分泌的增多表达也增加,宫内发育迟缓新生大鼠胰岛素分泌减少时,Munc13-1的表达亦减少.     

大鼠胰腺发育中肝细胞因子受体编码基因的表达及蛋白定位

目的 研究肝细胞因子受体编码基因c-met在大鼠胰腺发育不同阶段的表达及其编码蛋白的细胞定位.方法 采用RT-PCR技术检测c-met基因在大鼠胰腺不同发育时期:孕15.5 d(E15.5)和孕18.5 d(E18.5)、生后14 d(P14)、生后21 d(P21)、新生及成年胰腺的表达;并用免疫组化技术检测该基因编码的蛋白c-MET在胰腺发育不同阶段的细胞定位.结果 c-met基因在E15.5、E18.5 d较成年特异性高表达,免疫组化结果显示该基因编码的蛋白c-MET在新生后的胰腺大量定位于胰岛细胞.结论 c-met可能在胰腺发育过程中起到调控作用,参与胰腺发育中新生后胰岛结构重塑过程.     

钾通道KCNQ1在大鼠胰腺发育过程中的表达

目的分析钾通道KCNQ1在不同发育阶段大鼠胰腺以及成年大鼠胰岛中的表达情况,为探悉其在胰腺B细胞发育及功能中可能的作用提供实验依据。方法采用高密度寡核苷酸芯片对胚胎第12.5天(E12.5)、E15.5、E18.5、新生和成年大鼠胰腺进行基因转录水平分析,并用RT-PCR对KCNQ1通道亚基在上述5个时期大鼠胰腺以及成年大鼠胰岛中的表达进行验证和分析。结果与胰腺内分泌细胞分化、成熟有关的转录因子分别于E15.5、E18.5达到表达高峰;E18.5胰腺中B细胞功能成熟标志基因的表达显著增加,而KCNQ1钾离子通道的编码基因KCNQ1及KCNE1此时才出现表达。成年胰腺及胰岛中均具有多种KCNQ1通道亚基的表达。结论 KCNQ1通道的表达出现于胰腺发育后期内分泌细胞功能逐渐成熟阶段,在成年胰岛中亦具有较高表达水平,提示KCNQ1通道可能表达于成熟B细胞并参与其内分泌功能。     

大鼠胰腺发育功能相关基因表达谱的分析

目的研究大鼠胰腺胚胎发育不同阶段的基因表达谱,对比其功能相关基因随大鼠胰腺发育的变化。方法采用显微分离及提取技术获得胚胎发育不同阶段胰腺组织并提取RNA,采用高密度寡核苷酸芯片(Affemetrix芯片)对胚胎发育至第12.5天、15.5天、18.5天胚胎胰腺和成年胰腺进行基因转录水平分析,用生物信息学方法分析具体基因的表达情况。结果胰腺的生物学功能尤其β细胞功能相关基因insulin RNA、amylopsin RNA、GLUT-2RNA等在胚胎第15.5及18.5天显著高表达。结论胚胎第15.5～18.5天直至出生是胰腺功能完善和成熟的阶段,这个时期以细胞功能成熟为主。     

AFP在不同发育时期大鼠胰腺的表达

目的:探讨甲胎蛋白(AFP)在大鼠胰腺发育不同阶段的表达情况.方法:采用免疫印迹和免疫组织化学方法检测AFP在不同发育时期大鼠胰腺中的表达.结果:免疫印迹结果显示在不同发育时期大鼠胰腺组织总蛋白中共检测到M,分别为72 000,60 000,48 000和37 000的4种AFP亚型,肘,72 000亚型是胚胎15.5d(E15.5)至新生(P0)各时期表达丰度最高者,其次是Mr 60 000亚型.在E15.5胰腺出现有3种大分子AFP亚型,E18.5胰腺4种亚型的丰度各自达到最高,出生后各有降低或消失,成年胰腺中只有Mr 60 000亚型的痕量表达.免疫组织化学检测结果显示可分泌蛋白AFP于E18.5至P0特异定位于胰腺间充质细胞.结论:AFP显著高表达于胰腺结构与功能趋于完善的关键发育时期,并特异表达于对胰腺发育具有重要调控作用的胰腺间充质细胞,提示AFP表达与胰腺发育可能具有内在联系.     

nesprin-1基因在小鼠心脏发育过程中的表达

目的检测小鼠心脏发育过程中nesprin-1基因mRNA和蛋白的表达及亚细胞定位。方法取小鼠胚胎12.5 d(embryo 12.5day,E12.5)、E14.5、E16.5、E18.5以及新生鼠、成年小鼠心脏,应用RT-PCR、Western blot、免疫荧光技术检测胚胎各时间点、新生鼠、成年鼠心脏nesprin-1基因mRNA和蛋白表达及细胞定位。结果在小鼠胚胎E12.5、E14.5、E16.5、E18.5以及新生鼠、成年小鼠心脏组织中,nesprin-1基因mRNA及蛋白均有表达,其表达量随着心脏的发育而逐渐增加,E16.5和E18.5表达最高,成年鼠表达最低。免疫荧光显示,nesprin-1的分布在各个时期均位于核被膜及核周间隙中。结论nesprin-1在小鼠心脏发育过程中表达呈动态变化,在心脏传导系统和心肌细胞发育成熟时期呈高表达,因此推测nesprin-1可能在心脏传导系统和心肌细胞的发育中有重要作用。     

大鼠胰腺不同发育时期胰岛素分泌相关基因的表达

目的探讨与胰岛素分泌相关基因在大鼠发育不同阶段的表达趋势。方法采用高密度寡核苷酸芯片和RT—PCR技术对孕12．5d（E12．5）、E15．5d（E15．5）、E18．5d（E18．5）初生和成年大鼠胰腺进行基因转录水平分析。结果在大鼠发育不同阶段胰岛素mRNA持续表达；调控胰岛素基因表达的相关转录因子多在E12．5或E15．5开始表达（分别占60％和20％）；与胰岛素分泌相关的基因多在胚胎发育中后期开始表达（占66．7％），其中基因Rim1在胰腺发育不同时期呈现差异表达，于初生期达到表达高峰。结论胚胎发育中后期是胰腺内分泌部发育的关键阶段。     

巢蛋白在大鼠胚胎、新生及成年胰腺中的表达变化

目的：探讨巢蛋白(nestin)在胚胎后期、新生期、成年三阶段的核酸、蛋白水平表达的变化．方法：取三个发育时期的胰腺,应用RT—PCR、免疫组化的方法进行半定量、定位分析．结果：在胚胎后期、新生期、成年三阶段nestin在核酸、蛋白水平均有表达,阳性细胞主要分布在胰岛,在腺泡周围的外分泌中有少量分布．结论：随大鼠胰腺的生长发育,核酸、蛋白表达下调．胰岛内nestin阳性细胞数也呈下降趋势．     

巢蛋白和胰岛素在大鼠胰腺不同发育阶段的表达

目的：探讨巢蛋白(nestin)在胚胎后期、新生期、成年3阶段的mRNA、蛋白水平表达的变化。方法：应用RT-PCR、免疫组化的方法进行半定量、定位分析。结果：在胚胎后期、新生期、成年3阶段Nestin在mRNA、蛋白水平均有表达，Nestin阳性细胞主要分布在胰岛中．腺泡周围的外分泌组织中有少量分布。结论：Nestin随大鼠胰腺的生长发育，核酸、蛋白表达下调，胰岛内Nestin阳性细胞百分数表达也下调。     

Expression of GDF-5 during Limb Skeletal Development of Mice and the effect of GDF-5 on bone marrow mesenchymal stem cells in vitro

Objective： To investigate the expression of growth differentiation factor 5（GDF-5） during limb skeletal development of mice and the effect of GDF-5 on bone marrow mesenchymal stem cells in vitro. Methods ： The expression of GDF- 5 mRNA and protein in mouse fetal limb buds were detected in embryonic day 11.5-15.5 （E11.5-15.5） by RT-PCR and Western blotting respectively. Type Ⅱ collagen protein was examined with immunocytochemistry and the sulfate glycosaminoglycan was measured by Alcian blue. Results： During early stage of developmental skeletogenesis, the expression of GDF-5mRNA was constant and began with embryos E11.5, highlighted at embryos E12.5 and E13.5, subsequently dropped at embryos E14.5 and E15.5. There was very significant difference （P 〈 0.01） in average light density ratio of GDF-5/β-actin between E12.5-13.5 and the other three days. The expression of GDF-5 protein had a similar change with mRNA during limb skeletogenesis. Immunocytochemistry showed that GDF-5 could promote expression of Type Ⅱ collagen protein and histological staining of proteoglycan with Alcian blue revealed the deposition of typical cartilage extracellular matrix components. Conclusion： GDF-5 can enhance chondrogenic differentiation of mouse bone marrow mesenchymal stem cells in vitro, which plays an important role in limb skeletal development and joint formation.     

低氧诱导因子-1α在小鼠椎体发育中的表达及其意义

目的探讨低氧诱导因子（HIF）-1α在小鼠胚胎椎体发育过程中的表达规律及其调节作用。方法在解剖显微镜及光学显微镜下观察小鼠胚胎椎体骨发育的演变过程;应用逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）和免疫组化方法,检测小鼠胚胎椎体在发育不同时段HIF—-1α表达状况,及与血管内皮生长因子（VEGF）、软骨和骨标记基因的表达关系。结果胚胎第13．5天（E13．5）时,软骨性脊柱形成;E15．5时,椎体内形成小的骨化核,之后初级骨化中心逐渐增大,并向头尾两端延伸。E13．5时。可检测到HIF—-1α的mRNA表达,E14．5时,HIF—-1α的表达水平达高峰（组间比较P〈0．05）。其后逐渐降低,至出生前只有很少量表达;VEGF mRNA表达时相同HIF—-1α表达一致;软骨和骨标记基因的表达与形态学演变相符。E14．5时,免疫组化检测到HIF—-1α蛋白在椎体中心表达,延续表达时间较mRNA长。结论椎体发育表现为软骨内成骨过程,存在低氧环境,伴随有HIF—-1α mRNA及蛋白量的增加及其下游基因VEGF的表达,这可能与HIF—-1α激活下游基因启动椎体软骨内骨化过程有关。     

LMO3 mRNA在小鼠脑发育过程中的表达

目的:研究不同发育时期小鼠脑内LMO3的表达.方法:采用以SYBR Green I为荧光染料的定量RT-PCR及以地高辛标记的cRNA为探针的原位杂交组织化学法检测LMO3基因在小鼠脑发育过程中的表达.结果:FQ RT-PCR结果表明,LMO3在出生前高表达,P7d后表达水平急剧下降,至成年都维持在一个较低的水平. LMO3 mRNA在小鼠胚胎期E10.5d即有表达,但仅限于整个脑泡组织内,胚体其他区域均为阴性;E11.5d脑区信号逐渐加强,无核团及脑区的特异性,胚体其他部分仍为阴性;E15.5～P0d期LMO3阳性信号在几乎所有观察的脑区均有广泛而较强的着色;P7d LMO3阳性信号较出生前变弱,分布逐渐集中;P14～P60d LMO3 mRNA表达范围较P7d逐渐缩小,但仍有广泛表达,阳性信号主要集中于不同核团,表达有强弱之分.结论:LMO3基因可能与小鼠出生前脑的发育以及出生后特定脑区神经元的特化及特性维持有关.     

新生大鼠应用链脲霉素后胰岛重建和β细胞的再生

本文以小剂量 Sz 给予新生大鼠,观察用药后1、2、3和7天后的改变。发现胰岛β细胞有一定的变性,但未见大片完全性坏死。同时发现导管上皮细胞仍保持有分化为胰岛和腺泡细胞的能力,和腺泡细胞、导管上皮细胞和胰岛细胞包括β细胞的增生能力增加。结果说明新生大鼠 Sz 应用后,胰岛再建和β细胞再生的来源有导管上皮细胞的分化、腺泡细胞的转化和β细胞增生三个来源。实验中腺泡细胞增生能力最强和导管上皮细胞增生能力7天后恢复正常的事实,也支持了成年大鼠在应用 Sz 后,胰岛再建和β细胞再生的主要来源是腺泡细胞的观点。