人ICOS-Linker-Ig真核表达载体构建及二级结构分析

目的构建人重组ICOS-Linker-Ig真核表达载体并预测其二级结构及Linker的合理性。方法扩增人ICOS胞外域及IgG Fe段，设计一段柔性Linker将二者连接。经测序分析得到融合基因序列。应用核酸和蛋白质序列分析软件EditSeq^TM对融合基因及Linker部位翻译后二级结构水平的一些生物学特性，诸如柔性、抗原性、亲水性及表位等加以预测分析。结果ICOS-Linker-Ig融合基因的氨基酸序列经软件分析，并分别与ICOS和IgG单独分析结果比较，发现在二级结构水平未出现新的抗原性，同时Linker部位具有很低的抗原性，亲水性无改变，Linker部位呈中性且柔性良好，不影响两端蛋白质二级结构和融合蛋白空间构象。ICOS和Ig具有各自原来的表位特征，无新表位出现。结论本研究构建的ICOS-Linker-Ig能够保留ICOS和Ig各自生物活性和功能，计算机分析表明翻译后不影响蛋白质空间结构的形成，适合融合蛋白功能的发挥。     

人血清白蛋白与促红细胞生成素融合蛋白的构建及表达

目的 构建重组人血清白蛋白促红细胞生成素融合蛋白(HAS-EPO)表达载体,用CHO细胞表达该重组蛋白.方法 PCR扩增出人血清白蛋白基因(HAS)和促红细胞生成素基因(EPO);合成编码多肽GS (GGGGS)3的DNA片段作为接头(Linker),采用重叠PCR的方法将Linker与EPO基因拼接成LEPO基因.H...     

ScFv及重组TNF-α双功能抗体融合蛋白的表达及其软件预测

目的:利用生物信息学网络资源分析融合蛋白的二级结构及其理化性质,以及探讨分泌型抗成骨肉瘤单链双功能抗体基因的表达.方法:采用PCR方法将人工合成的抗体分泌信号肽序列加在抗成骨肉瘤ScFv基因5'端,其3'与人的肿瘤坏死因子TNF-α基因连接构成分泌型单链双功能抗体ScFv-TNF-α基因,将该基因克隆至逆转录病毒表达载体PLxSN,重组质粒pL(ScFv-TNF-α)SN在脂质体介导下转染PA317包装细胞,G418筛选,直至出现抗性克隆,扩大培养,用NIH3T3测定病毒滴度,将重组病毒感染人成骨肉瘤细胞命名为OSC/ScFv-TNF-α, 以PCR, RT-PCR以及Western Blot对ScFv-TNF-α基因修饰的OSC9901细胞进行鉴定. 在构建融合蛋白之后,运用DNA分析软件(DNAssist)和蛋白质分析软件(ANTHEPROT V5)分析融合蛋白的氨基酸序列、二级结构及其理化性质.结果:经酶切分析鉴定,成功地构建了融合基因表达载体pL(ScFv-TNF-α)SN,以及Western Blot分析证明ScFv-TNF-α基因融合蛋白的表达. 运用DNAssist核酸序列分析软件分析ScFv-TNF-αDNA序列翻译并获得了氨基酸序列,运用蛋白质分析软件(ANTHEPROT V5)分析融合蛋白的二级结构及其理化性质.结论:利用生物信息学网络资源进行分析预测融合蛋白的性质,为进一步探讨单链双功能抗体基因融合蛋白提供依据.     

HBVS-ecdCD40L融合基因构建及相应融合蛋白的二级结构预测

目的构建HBVS—ecdCD40L融合基因,并利用软件对其相应融合蛋白的二级结构进行预测。方法利用分子生物学技术将HBVS基因与人CD40L胞外段基因进行融合,构建融合基因及其真核表达载体,并利用蛋白质分析软件对相应融合蛋白二级结构水平的一些生物学特性进行预测。结果融合基因序列与设计一致,其相应氨基酸序列经软件分析,并与HBsAg和CD40L胞外段氨基酸序列分析结果比较,发现在二级结构上几乎无变化,亲水性和抗原性等生物学活性几乎未受影响。结论HBVS-ecdCD40L融合基因构建成功,软件分析表明融合过程未影响HBsAg和人CD40L胞外段的生物学活性,为进一步研究奠定基础。     

人幽门螺杆菌UreB与Omp11双价疫苗载体的构建与鉴定

目的:构建含人幽门螺杆菌(H.pylori,Hp)郑州分离株MEL HP27 ureB-omp11融合基因的重组表达载体.方法:利用分子克隆技术,扩增Hp UreB、Omp11编码基因及融合基因ureB-omp11,将融合基因ureB-omp11与载体pET30a( )进行酶切、连接,然后转化并筛选含有目的基因的重组载体.结果:酶切、测序分析表明,插入的基因片段为Hp ureB-omp11融合基因,由2 280 bp组成.与GenBank报道的相比,核苷酸序列同源性为99.39%,氨基酸序列同源性为99.47%.结论:成功构建了MEL Hp27融合蛋白UreB-Omp11的双价疫苗重组载体,为Hp蛋白质疫苗和核酸疫苗的研制奠定了良好的基础.     

基因治疗在脊柱外科的应用

自从 1990年美国国立卫生研究院 (ＮＩＨ)首次成功地进行腺苷脱胺酶缺乏症的基因治疗以来 ,基因治疗已成为当前生物医学中进展最快的领域之一 ,其基本原理是把编码目的基因的核酸序列 (ＲＮＡ或ＤＮＡ)通过基因转移的技术插入适当的受体细胞内 ,使被转移的细胞成为特定蛋白的加工厂 ,表达其蛋白质产物 ,改变该细胞本身的代谢并影响其邻近细胞 ,发挥生物学活性 ,从而纠正或补偿因基因缺陷或异常所引起的疾患。随着对人类基因结构及其功能研究的深入 ,基因治疗的研究也日益深入和广泛 ,基因治疗的含义已经不是严格的指用一个正常基因移植取代…     

幽门螺杆菌双价亚单位分子内佐剂疫苗的构建表达与纯化

目的 克隆表达幽门螺杆菌外膜蛋白烷基过氧化氢还原酶ahpC、ureB414功能片段基因,与大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位构建融合基因ahpC-ureB414-ltB(aul).方法 采用重叠延伸PCR的方法,以AhpC做为融合蛋白前端,与UreB414功能片段及黏膜佐剂ltB依次串联,在片段间引入5个氨基酸的柔性Linker GGGGS进行连接;将融合基因构建在原核表达载体pET-22b( )中,经酶切及测序鉴定后转化宿主菌E. coli BL21(DE3),IPTG诱导表达融合蛋白ahpC-UreB414.ltB(AUL).融合蛋白经AKTA-explore纯化仪纯化融合蛋白.结果 PCR扩增出1 350 bp的目的 基因片段aul,工程菌pET22b-aul/BL21经IPTG诱导后,SDS-PAGE显示有新生的蛋白表达条带,相对分子质量约为50×103,与预期值一致,目的 蛋白约占菌体总蛋白的28.7%,重组蛋白用Ni2 -NTA树脂提纯.纯化后的蛋白质经SDS-PAGE分析可见单一条带,图像软件分析表明纯度可达85%以上.Western blot显示重组蛋白质具有良好的免疫反应性.结论 成功构建、表达融合蛋白rAUL,纯化后的融合蛋白保持各亚单位组分及佐剂的独立免疫反应性.     

人EGF受体干扰序列-IL18融合基因构建及其表达产物结构预测

目的：构建带有EGF受体干扰序列的人IL-18融合基因并预测其表达产物的二级结构。方法：利用分子生物学技术，将人IL-18的成熟肤序列cDNA与EGF受体干扰序列cDNA融合，构建重组体EGF-IL18。应用蛋白质分析软件对融合基因翻译后在二级结构水平上的一些生物学特性加以预测。结果：测序表明融合基因序列与设计一致。其相应的氨基酸序列经软件分析，并与人IL-18的成熟肤单独的分析结果相比较，发现在二级结构水平几乎没有变化，融合过程未影响IL-18的活性。结论：该融合基因可进一步用于导向多肽EGF-IL18的基因工程。     

全长cDNA文库及构建方法与应用进展

互补DNA (complementary DNA,cDNA)文库是指生物不同生长发育时期,特定组织或器官所转录的全部mRNA经反转录形成的cDNA与载体连接后形成的克隆的集合,cDNA文库是在基因组水平上研究某一生物特定器官、组织和发育时期基因表达的前提和基础[1].全长cDNA文库是生物体内完整的mRNA分子反转录而获得的DNA分子群集,是mRNA分子群的一个完整的拷贝.全长cDNA文库不仅提供完整的mRNA信息,而且可以通过基因序列比对得到mRNA剪接信息,此外,还可以对蛋白质序列进行预测及进行体外表达和通过反向遗传学研究基因的功能等[2].全长cDNA文库的优点明显,克隆大部分是全长的,有效提高了基因测序和生物信息学分析的进程,利于后期蛋白质表达及功能分析.     

HBe (385-420) -ecdCD40L真核表达载体的构建及其融合蛋白生物活性预测

目的:构建HBe( 385-420) -ecdCD40L融合基因真核表达载体,探讨其所翻译的融合蛋白设计的合理性.方法:采用分子生物学技术将HBe( 385-420)基因与CD40L胞外段(ecd)基因进行融合,构建融合基因的真核表达载体;应用生物信息学初步分析融合蛋白的物理化学性质、柔性、抗原性、亲水性、表位以及二级结构等.结果:成功构建真核表达载体.通过分析,HBe (385-420)、ecdCD40L两个基因连接之后亲水性和疏水性未受影响,融合蛋白未出现新的抗原性及表位,连接链( Linker)不影响蛋白质的二级结构及融合蛋白的空间构象.结论从生物软件分析结果可知重组体设计较合理,融合蛋白保留了HBe( 385-420)和CD40L胞外段的生物学活性,为进一步研究该基因奠定了基础.     

人β-防御素3融合细菌膜穿透增加蛋白在毕赤酵母中的表达

目的:探讨采用酵母表达系统进行人β-防御素3(hBD3)与细菌膜穿透增加蛋白(BPI)融合表达的可行性.方法:将hBD3成熟肽基因通过Linker蛋白与BPI基因串联,克隆于酵母表达载体pPICZαB中,电转导入X-33毕赤酵母菌,经重组酵母基因组PCR和表型鉴定获得阳性克隆,对阳性克隆进行甲醇诱导表达,上清进行目的蛋白纯化和Western Blot鉴定.结果:重组载体经酶切和测序证实序列正确,重组X-33-pICZαB-hBD3-BPI克隆经甲醇诱导24 h后,上清SDS-PAGE电泳显示有目的蛋白表达,Western Blot分析表明重组蛋白抗人hBD3和BPI均阳性,该目的蛋白依次通过疏水色谱、离子交换色谱纯化,蛋白纯度达到89%.结论:采用毕赤酵母系统融合表达hBD3和BPI是可行的.     

蛋白质组学技术及其在食管癌中的研究进展

随着蛋白质组学相关技术的迅速发展,人类对疾病的研究已经发展到了分子水平.肿瘤是一种多基因参与的复杂疾病,其发生最终都必须通过蛋白质来实现.关于蛋白质组学(Proteomics)的研究已经成为当今生命科学的热点之一[1].其研究方法之一飞行时间质朴(SELDI)是2002年诺贝尔化学奖的主要应用技术,通过比较分析正常组织与异常组织细胞以及同一疾病在不同发展时期细胞内整体蛋白质的差异表达,对差异表达的蛋白进行鉴定、定量、表征,来寻找与疾病相关的新的标志物.     

重视疾病的分子病理诊断

在功能基因组和蛋白质组研究时代,发展分子病理学,从基因水平以及基因产物--蛋白质水平研究和诊断疾病,已成为当前医学生物学的前沿.通过免疫组织化学、分子杂交、PCR、DNA序列分析等手段,使病理诊断建立在常规病理学、超微病理学、免疫组织化学和分子病理学的基础上,对疾病的认识由表及里,采取表型和基因型分析相结合,必将使病理诊断冲出单纯形态学的局限,更好地为临床诊断、预后判断和治疗服务.同时将逐渐改变疾病的分类,使疾病的分类建立在分子病理学的基础上[1].     

s-lap/GFP融合蛋白在Hela细胞中的表达与定位

目的:观察s-lap/GFP融合蛋白在Hela细胞中的表达及定位。 方法：根据s-lap基因的编码区序列, 应用PCR技术突变其3′末端终止密码子, 并通过基因重组技术将其与GFP基因融合,构建s-lap/GFP重组质粒;采用脂质体转染法, 将s-lap/GFP融合基因转入Hela细胞中, 用荧光显微镜观察其表达。 结果:s-lap/GFP重组质粒序列测定的结果与预期设计完全一致。荧光显微镜显示, 在转染GFP基因的Hela细胞中,荧光呈网状均匀分布于细胞浆内,而细胞核内低表达;在转染s-lap/GFP融合基因的Hela细胞中,荧光均匀分布于整个细胞,尤其以细胞核内高表达。 结论：s-lap/GFP融合蛋白可在人Hela细胞中表达,并主要定位于细胞核。     

靶向泛素化降解蛋白质技术的应用

利用真核细胞内泛素-蛋白酶体途径特异性降解蛋白质原理发展而来的靶向泛素化降解蛋白质技术,可通过合成融合蛋白E3或Protacs小分子,特异性敲减某种选定的蛋白底物.有望成为基因或蛋白功能研究的一种新方法,与DNA/RNA水平的基因沉默技术共同在基础和临床医学研究中发挥重要作用.     

单顺反子表达人GM—CSF和B7．1融合基因自核表达载体的构建和鉴定

目的 构建单顺反子表达人GM-CSF和B7．1融合基因真核表达裁体。方法 应用巨引物PCR技术对hGM-CSF基因cDNA进行定点突变；应用PCR重叠延伸法，将hGM-CSF和hB7，1基因的cDNA编码序列通过一1inker序列拼接，构建hGM-CSF与hB7．1融合基因hGM-B7．1，将其插入pcDNA3真核表达裁体，测定核苷酸序列。结果 序列分析表明：(1)hGM-CSF突变体基因cDNA编码序列的178位核苷酸由C变为A，其余核苷酸序列均未发生变化；(2)hGM-CSF、1inker、hB7.1的连接顺序、方向及序列完全正确。结论 构建pcDNA3-hGM-B7.1融合基因真核表达载体成功。     

模拟PEG的聚多肽融合技术研究进展

多肽和蛋白质药物特异性高、生物活性高,但是稳定性差、血浆半衰期短,限制了其在临床上的应用。PEG修饰技术是蛋白质长效化的常用手段,但仍存在一定的缺点,因此近年来研究者开发了模拟PEG的聚多肽融合技术。聚多肽融合技术是通过DNA重组技术将蛋白质药物与特殊的氨基酸序列融合,增加药物的流体动力学体积或产生电荷效应,从而延缓肾小球滤过,增加融合蛋白的血浆半衰期。本文对已有的多种聚多肽及其在蛋白质长效化方面的研究进行综述。     

生物信息学在包虫基础研究中的应用前景

在1956年美国召开的首次"生物学中的信息理论研讨会"上人们提出了生物信息学的概念[1].近几年,随着人类基因组计划(HGP)的迅猛发展,各种数学软件以及生物分析软件的出现,将之前积累的大量不同生物基因序列、蛋白质氮基酸残基序列、不同生物种属之间基因序列、蛋白质以及结构序列的保守结构位点进行整合,并据此建立了庞大的数据库系统.而对于这些数据的分析,必须依靠计算机分析技术的不断发展,所以就形成了一门由生物科学、计算机科学、信息科学、应用数学、统计学等多门学科相互交叉的学科--生物信息学技术[2-4].     

人表皮生长因子-天花粉蛋白融合蛋白的基因克隆、表达及纯化

目的 构建人表皮生长因子(EGF)-linker-天花粉蛋白(TCS)融合蛋白的表达载体,在大肠杆菌中表达并纯化EGF-linker-TCS融合蛋白.方法 用PCR方法扩增EGF及柔性连接肽Linker基因片段,插入质粒PQE30-TCS中,转化至大肠杆菌M15中,表达该融合蛋白(EGF-linker-TCS).表达产物经Ni-NTA Agrose亲和层析柱纯化.结果 PQE30-EGF-linker-TCS蛋白在大肠杆菌M15中获得稳定、高效的融合表达.目的蛋白占细胞总蛋白的40%左右,以可溶性形式存在,表达上清柱纯化后纯度达95%以上.结论 应用基因工程技术,成功地构建了融合蛋白EGF-linker-TCS的表达载体,表达并纯化了该融合蛋白,为进一步研究其结构功能关系和肿瘤临床应用奠定了基础.     

单顺反子表达人GM-CSF和B7.1融合基因真核表达载体的构建和鉴定

目的　构建单顺反子表达人 GM- CSF和 B7.1融合基因真核表达载体。　方法　应用巨引物 PCR技术对 h GM- CSF基因 c DNA进行定点突变 ;应用 PCR重叠延伸法 ,将 h GM- CSF和 h B7.1基因的 c DNA编码序列通过一 linker序列拼接 ,构建 h GM- CSF与 h B7.1融合基因 h GM- B7.1,将其插入 pc DNA3真核表达载体 ,测定核苷酸序列。　结果　序列分析表明 :(1) h GM- CSF突变体基因 c DNA编码序列的 178位核苷酸由 C变为 A,其余核苷酸序列均未发生变化 ;(2 ) h GM- CSF、linker、h B7.1的连接顺序、方向及序列完全正确。　结论　构建 pc DNA3- h GM- B7.1融合基因真核表达载体成功