两种乙肝病毒基因分型方法的比较

[目的]比较荧光PCR和型特异性引物PCR两种乙肝病毒基因分型方法,确立适合大规模流行病学调查和临床使用的HBV分型方法。[方法]用两种方法对福州市疾控中心保存的76份HBV DNA阳性血清标本进行基因分型。[结果]患者血清的荧光PCR法成功分型率90.8%(69/76);型特异性引物PCR法成功分型率82.9%(63/76)。两种方法均能分型的56分标本中,48份结果一致,分型结果符合率85.7%。[结论]两种分型方法的分型率类似。     

西尼罗病毒PCR检测方法的建立

[目的]应用通用引物建立快速、敏感、特异的PCR检测方法,用于西尼罗病毒感染相关疾病的实验室监测和早期诊断。[方法]以西尼罗病毒感染者血清分离得到的病毒RNA逆转录cDNA为检测样本,通过对多株病毒基因组序列各区段保守性进行分析比较,在基因组非编码区设计引物和探针,分别用巢式PCR和荧光定量PCR方法对样本进行扩增。[结果]以西尼罗病毒RNA逆转录cDNA为模板,采用所建立的两种PCR方法,均可得到阳性检测结果。[结论]本研究设计的PCR扩增引物具有较好的通用性;建立的实时荧光定量PCR结合巢式PCR用于检测WNV的分析方法具有互补性,为研制成熟的西尼罗病毒检测试剂盒提供实验基础。     

江苏省传染性非典型肺炎病原学检测研究

目的:建立传染性非典型肺炎(SARS)实验室检测方法,为SARS病例诊断和现场防治提供依据。方法:用逆转录套式PCR、实时荧光定量PCR检测SARS病毒核酸;酶联免疫法检测血清标本SARS病毒IgM抗体;部分PCR检测阳性或SARS病毒IgM抗体阳性病例的标本进行直接电镜观察;简并引物PCR检测冠状病毒属病毒核酸;鉴别诊断IFA检测血清中肺炎支原体等9种常见呼吸道感染病原IgM抗体,PCR检测军团菌以及甲、乙型流感病毒核酸。结果:检测各类临床标本506份。2003年全省报告临床诊断病例7例,5例检测结果阳性;逆转录套式PCR检测各类标本132份,阳性8份;对其中4份PCR扩增产物(108bp)进行了序列分析,与SARS病毒序列100%同源;实时荧光定量PCR检测各类标本30份,阳性3份;酶联免疫法检测血清标本101份,SARS病毒IgM抗体阳性4份;3个诊断病例的各类标本电镜检查发现冠状病毒样颗粒;IFA检测血清标本75份,嗜肺军团菌IgM抗体阳性9份,乙型流感IgM抗体阳性11份,两者同时阳性3份,其他病原体IgM抗体均为阴性。不明发热病例的标本21份简并引物PCR检测冠状病毒,2份咽拭子标本阳性;漱口液、尿液标本各15份PCR检测军团菌、漱口液25份PCR检测甲、乙型流感病毒结果均为阴性。结论:本研究建立的检测方法与临床诊断有比较好的符合性,对于临床诊断和防治工作具有重要的参考价值。PCR检测SARS-CoV特异性较好,而敏感性有待提高。     

实时荧光PCR技术检测高危型HPV的临床应用评价

[目的]评价实时荧光PCR技术检测高危型HPV的临床应用效果. [方法]应用实时荧光PCR技术检测80例已经HCⅡ方法检测高危型HPV的宫颈脱落细胞标本,其中40例为阴性标本;40例为阳性标本,比较两种方法检测结果的一致性.结果不一致的应用HPV基因分型试剂进行检测.以病理学检查结果作为金标准,评价实时荧光PCR技术的临床应用效果. [结果]80例标本的实时荧光PCR检测结果中,76例的结果与HCⅡ结果一致,总符合率为92.50％,Kappa值为0.85.6例结果不一致的标本,经HPV分型检测有1例为HPV6型,其余5例均为阴性.实时荧光PCR技术检测的灵敏度、特异度、阳性预测值和阴性预测值分别为93.33％,63.08％,39.47％和97.62％. [结论]实时荧光PCR技术与HC-Ⅱ方法检测结果一致性高,是检测高危型HPV感染的另一有效手段,可在临床上用于宫颈癌及其癌前病变的筛查.     

嗜肺军团菌基因检测及分子特征研究

目的:了解外环境水中分离的嗜肺军团菌菌株的基因特征及遗传背景。方法:40株分离株分别经血清学凝集试验、胶乳凝集试验确定为LP1型嗜肺军团菌后,利用普通PCR技术对军团菌属5S rRNA基因和嗜肺军团菌mip毒力基因的特异序列进行扩增,应用实时荧光定量PCR技术扩增嗜肺军团菌mip基因,使用脉冲场凝胶电泳(PFGE)分型技术对菌株进行全染色体DNA酶切电泳分型,并用BioNumerics Version 4.0软件进行聚类分析。结果:所有的菌株均带有属特异性5S rRNA基因及mip毒力基因,PFGE聚类分析结果显示大多数菌株的遗传相似度有一定差异。结论:所有菌株经普通PCR或定量PCR均相应扩增出其特征基因,PFGE聚类分析结果提示浙江省散在水系中分离的嗜肺军团菌菌株存在遗传多样性。     

分子信标荧光定量PCR法在结核病临床诊断中的应用

[目的]评价分子信标荧光定量PCR法检测临床标本中结核分枝杆菌的应用价值.[方法]分别采用分子信标荧光定量PCR法、抗酸染色法和集菌培养法检测272例肺结核临床标本,比较3种方法的检出率,分析有无差异.[结果]分子信标荧光定量PCR法的检出率显著高于抗酸染色法和集菌培养法,阳性率分别为66.91%、10.75%和43.01%.[结论]分予信标荧光定量PCR法检测临床样本中结核分枝杆菌具有快速、敏感和特异性高的特点,可为结核病的临床诊断提供一种快速、准确的病原学诊断手段,具有重要的临床意义.     

西宁地区秋冬季婴幼儿肠道病毒流行情况分析

[目的]对西宁市秋冬季婴幼儿肠道病毒进行流行病学的调查,并对流行株和流行趋势进行统计分析,为肠道病毒引起的腹泻提供实验室资料,更好的控制传染病的暴发流行. [方法]用Real-Time PCR方法对西宁地区婴幼儿腹泻的标本进行肠道病毒的检测. [结果]西宁地区120例婴幼儿病毒腹泻中肠道病毒的检测率分别为:轮状病毒Real-Time检测阳性数为50例,检出率41.67%,诺如病毒Real-Time检测阳性数为45例,检出率为37.50%,腺病毒Real-Time检测阳性数为5例,检出率4.17%. [结论]西宁地区秋冬季在婴幼儿腹泻中以轮状病毒和诺瓦克病毒是主要的病原之一,诺瓦克病毒发病率37.50%,仅次于轮状病毒41.21%.     

3种梅毒检测方法在献血筛检中的应用效果评价

[目的]对RPR、ELISA和PCR 3种梅毒检测方法在献血筛检中的应用效果进行评价,选择适合血站大规模血液筛检的梅毒检测方法。[方法]用RPR法和ELISA法对32 327份自愿无偿献血者血液标本同时进行梅毒检测,对任意一种方法检测出的阳性标本,再使用荧光PCR法和TPPA法进行检测。[结果]在32 327份标本中,RPR阳性108份,ELISA阳性174份;201份RPR阳性和/或ELISA阳性的标本,PCR全部阴性;108份RPR阳性标本中TP-PA阳性81份,174份ELISA阳性标本中TPPA阳性144份。[结论]综合考虑方法学和实际操作等因素,3种梅毒检测方法中,ELISA目前最适合血站大规模的血液筛检。     

荧光定量PCR在军团菌监测中的应用

目的发展一种敏感、快速、特异的检测军团菌的方法,并与运用常规的细菌培养方法所检测结果相比较。方法分别用传统的细菌培养法和以鉴定嗜肺军团菌种水平的mip设计引物的荧光定量PCR方法对68份公共场所中央空调的冷却塔水、客房热水、冷凝水进行检测,通过检测结果比较,评价该方法在实际工作中的应用。结果传统的细菌分离培养共有20份军团菌培养阳性,阳性检出率为29.4%,而以Mip基因为引物,对68份浓缩后的水样进行荧光定量PCR扩增共检出32份为嗜肺军团菌阳性,阳性检出率为47.1%,且细菌分离培养阳性的标本荧光定量PCR均阳性。结论荧光定量PCR法检测阳性率明显高于细菌培养法,且快速、敏感、特异;值得在疾病监测筛查检验中推广应用。     

荧光置换探针多重实时PCR检测结核杆菌3种耐药突变

[目的]建立单管检测结核分枝杆菌3种耐药突变的多重实时PCR检测方法,考察其敏感性并应用于痰标本的检测。[方法]将荧光双链置换探针、实时PCR和多重PCR相结合,针对3种一线药物链霉素、异烟肼和乙胺丁醇中最常见的且都是由于点突变而导致的耐药突变位点进行检测。[结果]该检测体系可以检测到5个菌/test。用该体系检测9份已知基因型的结核分枝杆菌培养标本和118份痰标本,所有检测结果均通过ARMS体系验证。[结论]该检测体系具有很高的敏感性和特异性,检测快速,测定突变位点范围较其它技术有较大提高,且操作简便,有利于结核病菌的早期耐药检测和指导医生用药。     

郴州市2008年17例临床诊断手足病病例病原学分析

[目的]了解2008年郴州市手足口病的病原体类型及分布特征。[方法]采集17例临床诊断手足口病病例的咽拭子、疱疹液等样本,采用RT-PCR及Real-Time法检测样本中的肠道病毒通用型(EV)、肠道病毒71型(EV71)、肠道病毒科萨奇A16型(CoxA16)这3种核酸。[结果]共检测17例临床诊断手足口病样本,其中通用型3例、CoxA16型3例、EV71型2例,总阳性率为47.00%。[结论]引起郴州市手足口病的病原体主要为CoxA16型及其他肠道病毒。     

郴州市2009年46例临床诊断为手足口病的病原学分析

[目的]了解2009年郴州市手足口病的病原体类型及分布特征。[方法]采集46例临床诊断为手足口病病例的粪便样本,采用RT-PCR及Real-Time PCR法检测样本中的肠道病毒通用型(EV)、肠道病毒71型(EV71)、肠道病毒科萨奇A16型(CoxA16)3种核酸。[结果]46例临床诊断手足口病样本,其中EV71型22例、通用型11例、CoxA16型4例,总阳性率为80.43%。[结论]2009年引起郴州市重症手足口病的病原体主要为EV71型。     

实时荧光RT-PCR法和NASBA方法在呼吸道多病原检测中的应用评价

目的 评价实时荧光RT-PCR和核酸依赖性序列扩增法（NASBA）两种方法在呼吸道多病原检测中的应用价值。方法 收集北京地区急性呼吸道感染病例标本140份,分别采用实时荧光RT-PCR方法和NASBA方法对样本进行平行检测并对两种方法的病原检出限、重复性、检测一致性及检测时间等指标进行比较。结果 两种检测方法批内重复CV值均<5%,重复性较好;实时荧光RT-PCR方法对脊灰毒株核酸和H1N1病毒核酸最低检出限分别为5.62 CCID50 /0.1 ml（107 倍稀释）和10³倍稀释度,NASBA方法最低检出限分别为56.2 CCID50 /0.1 ml（106 倍稀释）和10²倍稀释。实时荧光RT-PCR灵敏度略优于NASBA方法。针对两种方法共同检测呼吸道病原体种类,实时荧光RT-PCR和NASBA方法检测阳性率分别为89.28%（125/140）、70%（98/140）。两种方法对甲型H1N1病毒、肠道病毒及新型冠状病毒的检测结果一致性达100%,对甲型流感病毒、甲型H3N2、副流感病毒1-4型的检测结果基本一致, Kappa 值范围为0.81~1;对冠状病毒229E/HKU1/OC43/NL63、鼻病毒、呼吸道合胞病毒和乙型流感病毒的检测结果一致性较好, Kappa 值范围为0.61~0.80;对人偏肺病毒的检测结果一致性差, Kappa 值仅为0.55。实时荧光RT-PCR方法检测时间为90 min,NASBA方法仅需40 min即可完成。 结论 实时荧光RT-PCR方法灵敏度较高,适合对大批量临床样本进行筛查;NASBA方法检测时间短,不易污染,适用于时限性强但对灵敏度要求不太高的应用场景,如临床上重症呼吸道感染者的快速检测。建议根据不同需求和应用场景,选择合适的检测方法和产品。     

维生素E对氯化镍染毒大鼠肺组织p15基因甲基化过程的影响

[目的]探讨维生素E（VE）对氯化镍染毒大鼠肺组织p15基因甲基化过程的影响。[方法]以0．1、0．2、0．4和0．8mg／mL氯化镍灌胃染毒大鼠,并设立对照组（生理盐水）和拮抗组（0．8mg／mL氯化镍＋5mg／mL VE）,持续6周。染毒结束后处死大鼠,制备肺组织匀浆,采用分光光度法,测定谷胱甘肽（GSH）和丙二醛（MDA）水平的变化;以荧光定量PCR法检测肺组织中抑癌基因p15的表达水平;以甲基化PCR法检测p15启动子甲基化状态;以Western-blot检测DNA甲基转移酶1（DNMT1）和蛋氨酸腺苷转移酶2A（MAT2A）的表达水平。[结果]随着氯化镍染毒剂量的增加,MDA含量显著升高,GSH含量显著下降（P〈0．01）;与相同剂量染毒组相比,拮抗组大鼠肺组织中MDA含量降低,GSH含量升高（P〈0．05）;对照组大鼠肺组织p15启动子为非甲基化状态,染毒组大鼠肺组织p15启动子甲基化和非甲基化条带均有表达;各染毒组p15mRNA表达量与对照组相比均显著性降低（P〈0．01）,使用抗氧化剂VE后p15mRNA表达量与相同剂量染毒组相比显著性增高（P〈0．05）;随着染镍剂量的增高,DNMT1和MAT2A表达量显著性升高,与对照组相比,最高剂量染镍组DNMT1和MAT2A的表达量分别增高了1．52倍和1．49倍。使用拮抗剂VE后,与相同剂量染镍组相比DNMT1和MAT2A的表达量分别降低了10％和29％;双变量相关分析显示大鼠肺组织中GSH含量与DNMT1和MAT2A蛋白表达水平呈负相关关系,相关系数分别为r=-0．889（P=0．018）和r=-0．821（P=0．044）。[结论]维生素E可能通过影响GSH在氯化镍染毒大鼠肺组织中的含量而影响p15基因的甲基化过程。     

聚合酶链反应技术在从业人员体检中的应用

[目的]综合运用聚合酶链反应技术与常规技术的检测手段,提高行业从业人员体检中的阳性检出率。[方法]通过聚合酶链反应技术和常规技术相结合的综合检测手段与单纯的常规技术检测手段进行比对,观察分析阳性检出率情况。[结果]聚合酶链反应技术和常规技术相结合的综合检测手段,其阳性检出率(0.85‰)高于单纯常规技术检测手段的阳性检出率(0.12‰)。[结论]聚合酶链反应技术在行业从业人员体检中的应用将大大提高阳性检出率,同时还具降低检测成本和提高检测工作效率的优势。     

基于M基因构建的麻疹病毒实时荧光PCR检测技术

目的:建立麻疹病毒的实时荧光PCR检测方法并应用于临床标本的检测。方法:根据四十年来在我国流行的麻疹病毒M基因序列,设计用于病毒实时荧光PCR检测的引物和探针,建立麻疹病毒实时荧光PCR检测方法。用此法对40例麻疹的病人标本进行检测,并与血清学检测结果比较。结果:通过40例病人标本中实时荧光PCR检测,39份阳性,1份阴性,阳性率97.5%,高于血清学检测(阳性率77.5%)。结论:该方法方便快捷、特异性强、敏感性高,可用于麻疹病毒的快速诊断和分子流行病学调查。     

TaqMan荧光定量PCR检测和鉴别不同血清群脑膜炎奈瑟菌方法的建立及应用

目的 建立TaqMan荧光定量PCR检测方法,用于脑膜炎奈瑟菌不同血清群菌株的检测和鉴别.方法 设计合成7对引物和TaqMan探针,脑膜炎奈瑟菌种属特异性的基因为ctrA;不同血清群的脑膜炎奈瑟菌特异性基因分别为A群(sacB)、B群(siaD)、C群(siaD)、X群(xcbB)、Y群(synF)、W135群(synG).检测和确定不同探针和引物用于脑膜炎奈瑟菌荧光定量PCR检测的特异性、敏感性,并同时将荧光定量PCR和乳胶凝集方法应用于121份疑似脑膜炎奈瑟菌感染患者的脑脊液标本的检测.结果 ctrA、sacB、siaD(B群)、siaD(C群)、xcbB、synF、synG等7对引物和探针能准确检测和鉴定79株不同血清群的脑膜炎奈瑟菌菌株,检测灵敏性比相应的普通PCR高101～103倍,每对引物和探针反应体系中,能检测的最低全基因组DNA拷贝数分别为8、8、80、8、8、80、8;检测121份疑似脑膜炎奈瑟菌感染患者的脑脊液标本,TaqMan荧光定量PCR检测11份阳性,乳胶凝集方法检测6份阳性.结论 TaqMan荧光定量PCR方法能特异地检测和鉴定不同血清群脑膜炎奈瑟菌,具有较高的灵敏性和快速检测的特点,能提高临床疑似脑膜炎奈瑟菌感染病例的阳性检出率.     

Factors associated with clinical leptospirosis: a population-based case-control study in the Seychelles (Indian Ocean).

BACKGROUND: In Western countries, leptospirosis is uncommon and mainly occurs in farmers and individuals indulging in water-related activities. In tropical countries, leptospirosis can be up to 1000 times more frequent and risk factors for this often severe disease may differ. METHODS: We conducted a one-year population-based matched case-control study to investigate the frequency and associated factors of leptospirosis in the entire population of Seychelles. RESULTS: A total of 75 patients had definite acute leptospirosis based on microagglutination test (MAT) and polymerase chain reaction (PCR) assay (incidence: 101 per 100,000 per year; 95% confidence interval [CI]: 79-126). Among the controls, MAT was positive in 37% (past infection) and PCR assay in 9% (subclinical infection) of men aged 25-64 with manual occupation. Comparing cases and controls with negative MAT and PCR, leptospirosis was associated positively with walking barefoot around the home, washing in streams, gardening, activities in forests, alcohol consumption, rainfall, wet soil around the home, refuse around the home, rats visible around the home during day time, cats in the home, skin wounds and inversely with indoor occupation. The considered factors accounted for as much as 57% of the variance in predicting the disease. CONCLUSION: These data indicate a high incidence of leptospirosis in Seychelles. This suggests that leptospires are likely to be ubiquitous and that effective leptospirosis control in tropical countries needs a multifactorial approach including major behaviour change by large segments of the general public.     

儿童马尔尼菲青霉菌感染的鉴定方法研究

目的设计马尔尼菲青霉菌（PM）种特异性引物,采用荧光定量PCR的方法,并结合传统的形态学检查,以达到可以在临床实验室进行快速诊断的目的。方法取患儿血液、骨髓进行真菌双相培养,观察真菌生长情况及菌落形态,显微镜下观察菌体特征,并将培养物涂片进行一系列染色。针对PM5．8SrRNA设计特异性PCR引物,采用核酸荧光染料SYBRGreenI进行实时荧光定量PCR检测。结果PM为双相性真菌,于25℃为青霉相,于37℃为酵母相,并均有典型的菌落形态特征。染色可见菌体根据染色方法不同、形态不同呈现不同特征。荧光定量PCR方法的特异性较好,与该菌属内的其他细菌间无交叉反应。结论PM的特征性菌落形态对该菌有诊断价值,对该菌进行某些简单的染色可作为快速诊断与鉴别该菌的主要辅助手段,而实时荧光定量PCR方法在检测PM中的应用可以大大缩短临床的诊断时间,提高临床诊断的准确度和效率。     

利用激光捕获显微分离技术和突变分析法检测肺癌病人痰细胞的K—ras和p53基因突变

[目的]探索激光捕获显微分离技术在检测肺癌病人K-ras和p53基因突变的应用。[方法]以3种不同的基因突变分析法对20例患者的痰细胞进行基因突变分析：①以PCR＋DGGE方法分析K—ras基因突变，以PCR＋SSCP方法分析p53基因突变；②以PCR十MAE＋DGGE方法分析K—ras基因突变；以PCR＋MAE＋SSCP方法分析p53基因突变；③以激光捕获显微分离技术和突变分析法检测肺癌病人痰细胞的K—ras和p53基因突变。[结果]在20例患者中，以现有的方法仅发现有15％（3／20）的基因突变，而激光捕获显微分离技术则发现有60％（12／20）的基因突变。[结论]激光捕获显微分离技术和突变分析法能高效灵敏检测肺癌病人痰细胞的K—ras和p53基因突变。