人羊膜上皮细胞培养液抑制角膜新生血管的实验研究

背景 角膜新生血管(CNV)是一种常见的眼部病变,研究其发病机制及其抑制剂是眼科研究的热点和难点. 目的 研究人羊膜上皮细胞(AECs)培养液对CNV的抑制作用及机制. 方法 消化法培养及鉴定人AECs,并收集培养液,酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测色素上皮衍生因子(PEDF)和白细胞介素1受体拮抗剂( IL-1Ra)在培养液中的质量浓度.兔角膜上皮细胞分离后分别用无血清DMEM培养基、人AECs培养液、混合培养液(DMEM+人AECs培养液)培养48 h,采用实时定量聚合酶链反应(QRT-PCR)法检测不同培养液培养的角膜上皮细胞中血管内皮生长因子(VEGF)及碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的表达.用含质量分数10％胎牛血清的DMEM培养基培养人脐静脉血管内皮细胞(UVECs),并分别加入无血清DMEM、混合培养液和人AECs培养液,划痕法和细胞计数试剂盒8(CCK8)法检测各组培养液对人UVECs迁移的影响.分别在上述3种培养基中加入终质量浓度为50 μg/L的bFGF,CCK8法检测各培养液中人UVECs的增牛情况.在原子力显微镜(AFM)下观察人AECs培养液对人UVECs超微结构的影响. 结果 人羊膜培养和传代细胞角蛋白免疫组织化学染色阳性证实为人AECs.与无血清DMEM组相比,人AECs培养液组的兔角膜上皮细胞VEGF mRNA(1.00±0.22 vs.2.98±0.46)及bFGF mRNA( 1.00±0.36vs.2.55±0.48)的表达均明显下降,差异均有统计学意义(P=0.001、0.002);培养后不同时间人AECs培养液组人UVECs的增生吸光度(A)值明显下降,差异均有统计学意义(P＜0.05),人UVECs的迁移率下降,差异有统计学意义(P＜0.05).AFM观察见人AECs培养液组的血管内皮细胞膜粗糙、表面颗粒紊乱,细胞间连接及伪足减少.ELISA法检测人AECs培养液中PEDF的质量浓度为(70.41 ±0.68) μg/L,IL-1Ra的质量浓度为(153.56±0.36) ng/L,无血清DMEM组中未检出.结论 人AECs培养液可抑制角膜上皮VEGF及bFGF的表达,抑制血管内皮细胞的增生和迁移,细胞结构和功能改变,这可能是其抑制CNV的机制之一.     

sFlt-1基因片段对缺氧、高糖下人脐静脉血管内皮细胞及ERK1/2信号通路的影响

目的比较可溶性血管内皮生成因子受体1（sFlt-1）胞外第2～3区和第2～4区对缺氧、高糖条件下血管内皮细胞增生、迁移及细胞外调节蛋白激酶1/2（ERK 1/2）信号转导通路的影响。方法以逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）法从人胎盘组织cDNA文库中扩增出sFlt-1胞外第2～3区和第2～4区,连接入pcDNA3.1载体后电泳,并进行测序鉴定;以羧甲基化葡聚糖（CMD）纳米磁颗粒为基因载体分别携带2种重组质粒,转染人脐静脉内皮细胞（UVECs）后分别进行正常、缺氧和高糖条件下的培养。MTT法检测各组人UVECs的增生;光学显微镜下观察人UVECs的迁移;Western blot法检测各组人UVECs ERK1/2信号通路下游特异性磷酸化激酶ERK 1/2（p-ERK 1/2）蛋白的表达。结果经过pcDNA3.1/sFlt-1（2-3）或pcDNA3.1/sFlt-1（2-4）转染的人UVECs在缺氧和高糖条件下的增生、迁移及p-ERK 1/2蛋白的表达较转染前均明显下降（P〈0.01）;2种重组质粒对缺氧和高糖条件下人UVECs增生、迁移及ERK 1/2信号转导通路的影响差异均无统计学意义（P〉0.05）。结论 sFlt-1受体胞外第2～3区和第2～4区均可抑制缺氧和高糖条件下人UVECs的增生、迁移及ERK1/2信号通路的转导,且2种受体基因片段的作用无明显差异。     

两种血管内皮生长因子抑制剂对血管内皮细胞功能的抑制作用比较

目的　对比tenomodulin（TNMD）和avastin 对血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）诱导的人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells,HUVEC）增殖和体外血管样结构形成的抑制作用。方法　将传至3~6代的HUVEC接种于微孔板中贴壁生长,再置于孵箱中培养6 h,分别加入不同剂量VEGF处理24 h,MTT法测量细胞增殖能力,筛选促进细胞最大增殖作用的VEGF剂量A。将HUVEC分别加入A剂量的VEGF+不同剂量（0.25 mg·L^-1、0.50 mg·L^-1、1.00 mg·L^-1、2.00 mg·L^-1）的TNMD或avastin置于孵箱中培养24 h,MTT法检测TNMD和avastin对VEGF诱导的HUVEC增殖抑制的差异。基质胶体实验检测细胞体外血管形成的形态和长度:实验分为4组,A组为阳性对照;B组添加VEGF;C组添加 VEGF和 avastin;D组添加VEGF和TNMD,共焦显微镜下观察细胞形态,图像处理分析软件量化分析毛细血管样结构的差异。结果　MTT在490 nm波长处测定吸光值（A值）检测细胞增殖,结果显示,相同药物浓度时TNMD的A值均明显低于avastin的A值（均为P<0.01）。基质胶体实验结果显示,D组的毛细血管样结构破坏明显;A组、B组、C组和D组细胞总长度分别为（7422±311）μm、（9369±121）μm、（6499±258）μm、（5292±137）μm,两两相比差异均有统计学意义（均为P<0.05）。结论　TNMD比avastin对体外培养的HUVEC增殖具有更强的抑制作用。     

牛视网膜微血管内皮细胞的体外分离培养

目的探讨一种方便可靠的牛视网膜微血管内皮细胞(borein retinal microvas cular endothelial cell,BREC)体外培养方法.方法采用机械剪碎牛视网膜血管,用含牛血清、肝素、血管内皮生长因子(Vascularendothelial growthfactor,VEGF)的条件化培养基培养牛视网膜血管内皮细胞,观察细胞生长状况,制作生长曲线.应用Von Willebrand因子抗体免疫鉴定BREC,并通过透射电镜观察BREC的超微结构.结果添加了VEGF的条件化培养基对BREC有很好的选择刺激作用,初期细胞呈鲤鱼样聚集在微血管碎片周围,对数生长期细胞似铺路石样大片单层生长,存在接触抑制.Von Willebrand因子抗体染色阳性,获得BREC纯度在95％以上,能够连续传代.培养的细胞电镜下符合内皮细胞的特征.结论含VEGF培养基的应用可以获得高纯度、具有良好生长特性的BREC,是一种简便、效果稳定可靠的体外培养牛视网膜微血管内皮细胞的方法.     

Tenomodulin抑制氧诱导视网膜病变小鼠模型新生血管形成的研究

目的探讨Tenoinodulin（TeM）蛋白对C57BL／6J小鼠早产儿视网膜病变模型（ROP）视网膜新生血管形成的抑制作用。方法将60只7d龄C57BL／6J幼鼠随机分为高氧组（ROP组）、正常对照组各15只和TeM组30只。将ROP组小鼠置于体积分数（75％±2％）的高氧环境中5d,随后回到正常氧环境中饲养5d;对照组小鼠饲养在正常氧环境中;TeM组是将鼠1只眼玻璃体腔内注射1μg TeM,对侧眼注射PBS作为对照,然后置于体积分数（75％±2％）的高氧环境中饲养5d,之后返回正常氧环境中。17d时处死全部小鼠,收集各组眼球。视网膜荧光素灌注铺片观察视网膜血管的改变、计算视网膜无灌注区的面积;计数突破内界膜的内皮细胞数反映视网膜血管增生情况,观察TeM蛋白对视网膜新生血管形成的抑制作用及对视网膜可能的毒性反应;Western blot检测TeM蛋白在视网膜内的表达。结果与高氧组（2．94±0．55）mm^2。及TeM组中对侧眼注射PBS（2．83±0．46）mm^2的视网膜铺片中央非灌注区面积（mm^2）相比,注射TeM的视网膜铺片（0．44±0．26）mm^2,其中央非灌注区面积差异有统计学意义（P〈0．01）;每个视网膜切面突破内界膜的内皮细胞核数（10．57±2．95）与前二者（44．93±6．78、41．07±7．31）比较差异均有统计学意义（P〈0．01）。注射TeM的视网膜冰冻切片未见炎症反应和细胞毒性破坏。Western blot检测结果显示注射TeM的视网膜呈阳性表达,注射PBS的视网膜未出现条带反应,TeM的相对分子质量约为16000。结论TeM可有效抑制视网膜新生血管的形成,预示着TeM在预防和治疗眼部新生血管方面具有潜在的作用。     

基质细胞衍生因子-1α在增生性糖尿病视网膜病变继发新生血管性青光眼中的作用

目的 观察基质细胞衍生因子-1α(SDF-1α)在增生性糖尿病视网膜病变(PDR)继发新生血管性青光眼(NVG)中的作用,并探讨其作用机制.方法 采集PDR患者25例31只眼的玻璃体标本.其中,继发NVG者13只眼作为实验组,无NVG者18只眼作为对照组.配制含10、100、1000 ng/ml SDF-1α和10 ng/m1血管内皮生长因子(VEGF)培养液,并以此分组;测量各浓度组与体外对照组人脐静脉内皮细胞(HUVEC)管腔样结构及毛细血管样结构全长.配制含10、100、1000 ng/ml SDF-1α和100 ng/ml血管内皮生长因子(VEGF)培养液,并以此分组;采用5'-溴2'-脱氧尿嘧啶(BrdU)掺入法行细胞增生检测,分析各浓度组与体外对照组吸光度[A,旧称光密度(OD)]值.采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测玻璃体标本实验组和玻璃体标本对照组患者玻璃体标本中VEGF和SDF-1α含量.结果 体外血管生成检测显示,10、100、1000 ng/ml SDF-1α和10 ng/ml VEGF组HUVEC管腔样和毛细血管样结构长度均较体外对照组长,差异均有统计学意义(P＜0.05).细胞增生检测显示,10、100、1000 ng/ml SDF-1α和100 ng/ml VEGF 组A值均较体外对照组增高,差异有统计学意义(P＜0.05).ELISA法检测显示,玻璃体标本实验组患者玻璃体标本中SDF-1α和VEGF含量均明显高于玻璃体标本对照组,差异有统计学意义(P＜0.01).结论 SDF-1α参与了PDR继发NVG的形成过程,可能与SDF-1α促进血管内皮细胞增生而促进新生血管形成有关.     

二十碳五烯酸抑制血管内皮生长因子诱导人血管内皮细胞增生作用的研究

背景研究表明二十碳五烯酸（EPA）作为主要的脂质参与人体的生物代谢活动,抑制血管内皮生长因子（VEGF）的产生、阻滞血管平滑肌细胞的内移和增生。而眼部多种疾病与新生血管的形成有关。目的探讨EPA对VEGF诱导的人脐静脉内皮细胞（UVEC）增生的抑制作用。方法对人UVEC株培养和传代,并用Ⅷ因子相关抗原多克降抗体进行免疫细胞化学鉴定。应用免疫组织化学法检测EPA对VEGF受体2（Flk-1）在人UVEC中表达的影响;用MTT比色法检测不同质量浓度EPA作用不同时间后对非VEGF诱导及VEGF诱导的人UVEC增生的抑制率;用流式细胞术检测EPA对VEGF诱导的人UVEC细胞周期的影响。结果培养和传代的人UVEC呈纺锤形及鹅卵石样排列,Ⅷ因子相关抗原鉴定呈阳性反应。EPA作用后,Flk-1在人UVEC中的阳性染色强度明显弱于对照组,Flk-1阳性细胞数明显减少。6个质量浓度组的EPA对VEGF诱导及非VEGF诱导的人UVEC的增生均有明显的抑制作用,其作用呈质量浓度依赖性（F：23．072,P=0．000）;各质量浓度组的EPA对VECF诱导的人UVEC的抑制作用强于非VEGF诱导的人UVEC,差异有统计学意义（F=41．417,P=0．000）。各质量浓度组EPA对VEGF诱导的人UVEC作用24、48、72h后,其细胞数逐渐降低（F=87．823,P=0．000）,但作用时间对其抑制作用无明显影响（F=1．495,P=0．236）。EPA使VEGF诱导的人UVEC细胞阻滞在G0／G1期,EPA组G0／G1期细胞数比例为（75．83±1．56）％,对照组为（68．62±1．44）％,差异有统计学意义（t=-5．88,P=0．00）;EPA组与对照组均未发现凋亡细胞。结论EPA能够通过阻止人血管内皮细胞的DNA合成而明显抑制VEGF诱导的人UVEC的增生,其抑制作用呈剂量依赖性;EPA作用后人UVEC中Flk-1的表达下调,提示EPA可能有抗血管生成的作用。     

视网膜微血管内皮细胞培养及血管二维模型的建立

目的 培养人视网膜微血管内皮细胞，建立人视网膜血管体外二维模型。 方法 人视网膜血管内皮细胞在纤维连接蛋白包被的细胞培养池内，以无血清人内皮细胞培养基培养，形成二维血管模型。用辣根过氧化酶检测其通透性。部分血管模型加入5 ng/ml的血管内皮生长因子培养，与无血管内皮生长因子培养形成的血管模型比较通透性的变化，观察血管内皮生长因子对血管通透性的影响。 结果2～4 d左右内皮细胞亚融合形成网状血管样结构，6 d左右形成较完整的二维血管模型。血管内皮生长因子可增大血管的通透性，促进血管生成。 结论 用人内皮细胞培养基可成功培养人视网膜血管内皮细胞；利用细胞培养池和无血清人内皮细胞培养基培养，可建立标准的体外视网膜二维血管模型。 (中华眼底病杂志, 2006, 22: 110-112)     

整合连接激酶在血管内皮生长因子诱导视网膜新生血管形成的信号传导通路中的作用

目的 观察整合连接激酶（ILK）在血管内皮生长因子（VEGF）诱导的视网膜新生血管形成过程中的作用。方法 在体外培养的视网膜脉络膜血管内皮细胞（RF/6A细胞系）中，用LY294002抑制ILK活性或siRNA转染敲减ILK表达后，检测ILK对VEGF诱导的细胞黏附、增生、迁移及内皮细胞管状结构形成的作用；并在动物模型水平观察LY294002抑制ILK活性后对视网膜新生血管形成的影响。结果 正常对照组、VEGF处理组、LY294002抑制组、siRNA转染组细胞黏附实验结果分别为（0.0726±0.01961）、（0.1137±0.02631）、（0.0837±0.01503）、（0.0853±0.02454），VEGF处理组与正常对照组比较，差异有统计学意义（t =4.211，P<0.01）；LY294002抑制组以及siRNA转染组与VEGF处理组相比，差异有统计学意义(t =3.074 和2.91，P<0.01）。正常对照组、VEGF处理组、LY294002抑制组细胞增生实验结果分别为（0.4162±0.1392）、（0.6412±0.2420）、（0.4476±0.1834），VEGF处理组较正常对照组比较，差异有统计学意义（t=2.608，P<0.05）；LY294002抑制组与VEGF处理组相比，差异也有统计学意义（t=2.244，P<0.05）。正常对照组、VEGF处理组、LY294002抑制组细胞迁移实验结果分别为（83.66±30.283）、（248±74.748）、（138.5±38.167），VEGF处理组与正常对照组比较，差异有统计学意义（t=5.436，P<0.01）；LY294002抑制组与VEGF处理组相比，差异也具有统计学意义（t=3.682，P<0.01）。血管内皮细胞管状结构形成实验显示，ILK活性或表达受到抑制后无明显管状结构形成。动物实验显示腹膜下注射LY294002使视网膜后极部无灌注区面积从（62798±16995.62）μm2增加至（84722.65±10435.01） μm2，二者比较，差异有统计学意义（t=3.476，P<0.01）。 结论 应用LY294002抑制ILK活性或siRNA转染敲减ILK表达使细胞黏附率、细胞增生率及细胞迁移率均显著下降。ILK通过参与调控VEGF诱导的视网膜血管内皮细胞黏附、增生、迁移及内皮细胞管状结构形成过程而对VEGF诱导的视网膜新生血管形成过程发挥着重要作用。     

体外转染人发状分裂相关增强子-1基因重塑视网膜新生血管的研究

目的 探讨体外转染人发状分裂相关增强子1（HESR-1）基因至视网膜血管内皮细胞并重塑视网膜新生血管的可行性。方法 将HESR-1克隆至pcDNA3．1＋载体内,组成pcDNA3.1＋HESR-1重组质粒,原代培养人视网膜血管内皮细胞,实验中加入10ng血管内皮生长因子（VEGF）刺激内皮细胞生长,模拟体内新生血管内皮细胞激活状态,以脂质体转染pcDNA3．1＋HESR-1重组质粒至培养的细胞内,应用免疫组织化学法检测血管内皮生长因子（VEGF）第2受体（KDR）和紧密连接蛋白（occludin）表达的阳性率,采用免疫印迹法分析HESR-1对occludin表达的调控作用,体外建立视网膜血管模型,检测HESR-1对血管通透性的影响。结果 HESR-1基因成功转染至血管内皮细胞,KDR表达阳性率下降,occludin表达增强。重塑的体外血管样结构通过HESR-1的作用能降低血管通透性。结论 HESR-1基因能下调KDR的表达,增强occludin的表达,减少血管渗漏,达到重塑视网膜新生血管的目的;可为视网膜新生血管的治疗提供新的思路和方法。     

Inhibitory effect of tenomodulin versus ranibizumab on in vitro angiogenesis

AIM: To evaluate anti-angiogenic effect of tenomodulin (TNMD) and ranibizumab on cell proliferation and capillary-like morphogenesis of vascular endothelial cells under the stimulation of vascular endothelial growth factor (VEGF) in vitro. METHODS: The effects of TNMD and ranibizumab on VEGF-induced proliferation of human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) were evaluated by MTT assay, and the effects of TNMD and ranibizumab on capillary-like structures formed by HUVECs under the stimulation of VEGF were examined in culture. Capillary-like morphogenesis of HUVECs was quantitatively evaluated, and total lengths of tube-like structures per field were measured in a masked way. RESULTS: HUVECs with both ranibizumab and TNMD protein showed MTT reduction in VEGF-stimulated cell proliferation as expected, while MTT absorbance in the HUVECs with TNMD was significantly declined than that with ranibizumab (P<0.01). The capillary-like structures formed by HUVECs were markedly impaired by the presence of both TNMD and ranibizumab in the culture medium. The total length of the capillary-like structures per field was significantly shorter in the medium with TNMD than that of ranibizumab (P<0.01). The inhibitory effect of TNMD on tube formation in vitro angiogenesis was significantly stronger than that of ranibizumab. CONCLUSION: TNMD may have stronger inhibitory effect than ranibizumab on in vitro angiogenesis.     

Expression and localization of tenomodulin,a transmembrane type chondromodulin-I-related angiogenesis inhibitor,in mouse eyes

PURPOSE: To explore the role in the eye of tenomodulin (TeM), a chondromodulin (ChM)-I-related glycoprotein, the expression, localization, and antiangiogenic potential of TeM were investigated. METHODS: Gene expression and protein localization of TeM in mouse eyes were examined by Northern blot analysis, in situ hybridization, and immunohistochemical analysis. Antiangiogenic function included in the C terminus of TeM and ChM-I was examined in vascular endothelial cells through adenoviral gene transduction. RESULTS: TeM expression was detectable from day 15 of the embryonic stage and was clearly present in the eye and skin. In situ hybridization of the eye tissues revealed TeM mRNA in the tendon of the extraocular muscle, the sclerocornea, the lens fiber cells, and the ganglion cell layer, inner nuclear layer cells, and pigment epithelium of the retina. Corresponding immunoreactivity of TeM was present in most of these cells. Western blot detected 40- and 45-kDa immunoreactive bands of TeM in the eye as differently glycosylated forms of the transmembrane protein. Production of a secreted form of TeM and ChM-I through adenoviral gene transfer caused effective autocrine suppression of cell proliferation and capillary-like morphogenesis of retina vascular endothelial cells. The condition media from soluble TeM- and ChM-I-overexpressing cells also showed a marked inhibitory effect on in vitro angiogenesis. CONCLUSIONS: These results indicate a potential role for TeM in prevention of vascular invasion in the mouse eye and the possibility of both TeM and ChM-I as candidates for use in gene therapy approaches to treatment of ocular angiogenesis.     

FK506对高糖培养视网膜Müller细胞血管内皮生长因子表达的抑制作用

背景 视网膜M＆#252;ller细胞可通过表达血管内皮生长因子（VEGF）参与糖尿病视网膜病变（DR）的病理过程.FK506可抑制实体肿瘤及实验性角膜新生血管中VEGF的表达,但其对视网膜M＆#252;ller细胞中VEGF的表达是否有抑制作用鲜见文献报道.目的 观察FK506对高糖培养的大鼠视网膜M＆#252;ller细胞表达血管内皮生长因子（VEGF）的影响.方法 将大鼠永生化视网膜Müller细胞系进行常规培养并将对数生长期的Müller细胞分别接种到96孔培养板中,分别在培养液中加入800.00、400.00、200.00、100.00、75.00、50.00、25.00、12.50和6.25 pg/ml FK506 100 μl/孔（细胞密度为1×10^4个/ml）,MTT比色法确定Müller细胞半数抑制浓度（IC50）的最适FK506质量浓度.将大鼠视网膜Müller细胞系分为正常对照组、FK506组、高糖组和高糖＋ FK506组,分别用高糖DMEM培养液（含50 mmol/L D-葡萄糖）和正常DMEM培养基（含5.5 mmol/L D-葡萄糖）进行培养,并分别在培养基中加入FK506,至质量浓度为75 pg/ml.ELISA法检测培养细胞上清液中VEGF的质量浓度;分别采用逆转录PCR（RT-PCR）和Western blot法检测各组大鼠视网膜Müller细胞中VEGF mRNA及其蛋白的相对表达量,分别以目的基因与内参β-actin吸光度（A）比值和灰度比值表示.结果 光学显微镜下正常对照组、FK506组、高糖组及高糖＋Fk506组培养12、24、48 h的大鼠视网膜Müller细胞均呈多角形,大小一致.致大鼠视网膜Müller细胞IC50的FK506质量浓度为75 pg/ml.正常对照组、FK506组、高糖组和高糖＋FK506组细胞上清中VEGF蛋白的质量浓度分别为（966.46±13.59） pg/ml、（1 059.42±67.43） pg/ml、（16 243.11±3 926.38）pg/ml和（9 467.25±1 525.56） pg/ml,总体差异有统计学意义（F=20.51,P=O.00）,其中高糖组细胞上清中VEGF的质量浓度明显高于正常对照组,差异有统计学意义（P=0.00）;高糖＋FK506组较高糖组细胞上清中VEGF的质     

高糖下腺苷A_（2A）受体对人视网膜色素上皮细胞血管内皮生长因子表达的影响

目的研究高糖下腺苷A2A受体对人视网膜色素上皮（retinal pigment epithelium,RPE）细胞血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）表达的影响。方法体外培养人RPE细胞,应用免疫组化的方法检测腺苷A2A受体在人RPE细胞中的表达;用腺苷A2A受体作用培养的人RPE细胞,将其分为高糖（33mM）＋腺苷脱氨酶（ADA,2U/ml）、高糖＋ADA＋腺苷A2A受体特异性激动剂（CGS21680,50μM）、高糖＋ADA＋CGS21680＋腺苷A2A受体特异性拮抗剂（SCH58261,100μM）,药物组合刺激RPE细胞24h后,裂解细胞提取RNA,同时收集细胞培养液,分别应用real-time PCR和ELISA的方法检测高糖下腺苷A2A受体对人RPE细胞VEGF mRNA和蛋白的影响。结果腺苷A2A受体在RPE细胞中有表达,在高糖条件下,50μMCGS21680可以刺激RPE细胞VEGF mRNA水平升高约2.7倍,蛋白水平升高1.5倍,而再加100μMSCH58261反而使RPE细胞VEGF mRNA较前下降约 40%,蛋白水平较前下降60%。结论在高糖条件下,腺苷A2A受体可以刺激VEGF的合成,因此腺苷A2A受体可能参与糖尿病性视网膜病变新生血管的形成。     

鱼精蛋白体外抑制RF/6A细胞中血管内皮生长因子表达的研究

目的研究鱼精蛋白对体外培养的RF/6A细胞中血管内皮生长因子（VEGF）表达的抑制作用。方法建立RF/6A细胞的正常及缺氧培养模型,在上清液中加入鱼精蛋白,质量浓度分别为10、20、40、80、160μg/mL。在细胞培养的0、24、48、72、96、120h取上清液行ELISA检测,定量分析细胞的VEGF表达情况。在培养96h时,取出细胞铺片行免疫病理学检测,检测VEGF与受体的结合状况。结果在10～80μg/mL的范围内,鱼精蛋白的抑制作用与质量浓度成正比,80μg/mL为最佳的抑制质量浓度。缺氧条件下RF/6AVEGF的表达量始终高于正常氧浓度条件下;正常和缺氧状态下,鱼精蛋白均可以明显抑制VEGF的表达,不同组的差异有统计学意义（F=7.85,P=0.002）。免疫病理染色表明鱼精蛋白减少了VEGF与其受体的结合。结论一定质量浓度的鱼精蛋白对正常及缺氧状态下的RF/6AVEGF的表达有明确的抑制作用,同时还可以减少VEGF与VEGF受体的结合。鱼精蛋白有可能成为临床治疗缺血型新生血管性眼底病的新药。     

高糖对人脐静脉内皮细胞促红细胞生成素受体表达的影响

目的探讨高糖条件下促红细胞生成素（EPO）受体mRNA及蛋自在人脐静脉内皮细胞（UVECs）的表达差异。方法体外常规培养人UVECs细胞株,实验组分别给予22mmol／L葡萄糖作用12、24、48、72h,5．5mmol／L葡萄糖组（生理糖浓度）设为正常对照组,5．5mmol／L葡萄糖＋16．5mmol／L甘露醇组为渗透压对照组。采用逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）、免疫细胞化学法对高糖条件下人UVECsEPO受体mRNA和蛋白的表达进行检测。结果正常对照组和渗透压对照组相比,人UVECsEPO受体mRNA和蛋白表达差异均无统计学意义（P〉0．05）。人UVECs在22mmol／L高糖作用12、24、48、72h后,EPO受体mRNA和蛋白表达均显著高于正常对照组（P〈0．05）,且随着时间的延长,EPO受体mRNA和蛋白的表达均逐渐增加。结论高糖条件下人UVECsEPO受体mRNA和蛋白表达均增强,且呈时间依赖性。人UVECs在22mmol／L高糖条件下EPO受体mRNA及蛋白表达的增加与渗透压无关。     

视网膜酸化诱导VEGF与PEDF表达及其与氧化应激的关系

背景 缺氧与高糖是引起视网膜新生血管生长的主要原因,可引起视网膜糖酵解作用增强,导致组织酸中毒. 目的 探讨视网膜酸中毒对视网膜血管内皮生长因子(VEGF)与色素上皮衍生因子(PEDF)表达的影响及氧化应激的作用.方法 从2周龄雄性SD大鼠中分离出视网膜.分别在NaHCO3调制的pH7.2、6.8、6.5酸性环境的DMEM培养液中培养24 h;另外,在上述酸性培养液中培养后用PBS洗涤视网膜2遍后置于pH值为7.2的新鲜培养液中继续培养24 h;同时,在上述酸性培养液中加入抗氧化剂对视网膜进行培养.制作视网膜标本,然后行苏木精-伊红染色,采用荧光定量聚合酶链反应( PCR)及免疫蛋白印迹技术检测各组大鼠视网膜中VEGF和PEDF蛋白及其mRNA的表达,以pH7.2作为对照. 结果 视网膜培养24 h后,pH7.2组、pH6.8组视网膜层次清晰,但pH6.5组视网膜出现空泡.正常视网膜VEGF mRNA的表达为(112±11)％,pH7.2组为(100±7)％,差异无统计学意义(P=0.55);pH 6.8组、pH 6.5组中的视网膜VEGF mRNA分别为(196±43)％、(251±29)％,均较pH7.2组明显升高,差异均有统计学意义(P＜0.05).正常视网膜PEDF mRNA水平为(86±19)％,pH7.2组为(100±.33)％,差异无统计学意义(P=0.64);pH 6.5组视网膜PEDF mRNA水平为(230±66)％,较pH7.2组明显升高(P＜0.05).VEGF与PEDF蛋白与其mRNA表达趋势一致.视网膜酸化纠正后,pH 7.2、6.8、6.5组视网膜VEGF mRNA分别为(100±13)％、(111±9)％、(113±9)％,3个组之间比较差异无统计学意义(F=2.51,P=0.16).PEDF mRNA的表达分别为(100±13)％、(110±9)％、(108±11)％,3个组之间比较差异无统计学意义(F=0.98,P=0.43).加入抗氧化剂后,pH7.2组视网膜VEGF mRNA水平为(100±9)％,pH6.8组为(106±7)％,pH 6.5组为(148±22)％,pH6.5组VEGF mRNA表达水平均明显高于pH 7.2组和pH 6.8组(P＜0.05).pH 7.2、6.8、6.5组大鼠视网膜PEDF mRNA表达分别为(100±31)％、(282±45)％、(480±117)％,差异有统计学意义(F=20.73,P=0.00).结论 视网膜酸化诱导VEGF的表达受到氧化应激的调节,抗氧化剂可促进酸化视网膜PEDF的表达增加,表明氧化应激可抑制PEDF表达.