高糖对人脐静脉内皮细胞促红细胞生成素表达的影响

目的:探讨高糖条件下促红细胞生成素(erythropoietin,EPO)mRNA和蛋白在人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)的表达。方法:体外培养HUVECs,实验组分别给予22mmol/L葡萄糖作用6,12,24,48,72h,对照组1为生理糖浓度组(5.5mmol/L),对照组2为甘露醇组(与22mmol/L高糖组等渗)。运用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测HUVECs EPO mRNA的表达。采用免疫荧光细胞化学方法测定HUVECsEPO蛋白质的表达。结果:HUVECs在22mmol/L高糖刺激12,24,48h后,EPO mRNA和蛋白表达均显著高于对照组1(P<0.05),72h开始下降。结论:HUVECs在高糖条件下EPO mRNA和蛋白表达增强,且与时间相关。EPO表达增加有可能促进新生血管生成。     

高糖对视网膜Meller细胞VEGF，EPO和EPO RmRNA表达的影响

目的：观察高糖条件下VEGFmRNA,EPOmRNA和EPORmRNA在体外培养的Muiler细胞中的表达情况。方法：胰蛋白酶将新生小鼠视网膜组织吹打消化后,制成单细胞悬液,体外培养Muller细胞,RT．PCR测定高糖条件下视网膜Mailer细胞VEGF,EPO和EPOR基因的表达。结果：成功获得视网膜Muller细胞,传代后90％以上的细胞呈兔抗鼠谷氨酰胺合酶（GS）染色阳性。Muller细胞VEGFmRNA,EPO mRNA和EPORmRNA在高糖条件下表达升高,且呈浓度依赖性（P〈0．05）,但糖浓度50mmol／L组较40mmol／L组差异无统计学意义,无明显时间依赖性。结论：Muller细胞在高糖条件下VEGF,EPO,EPOR的表达增加。     

高糖对人视网膜色素上皮细胞Na-K-ATP酶表达的影响

目的 观察高糖对人视网膜色素上皮（RPE）细胞Na-K-ATP酶基因与蛋白表达的影响。方法 采用ARPE-19细胞，培养4周后分为高糖组（葡萄糖浓度30mmol／L）与对照组（葡萄糖浓度7mmol／L），继续培养2周、4周，RT-PCR法检测Na-K-ATP酶α1、Na-K-ATP酶β1的mRNA表达水平的变化，Western blot法检测Na-K-ATP酶β的蛋白表达情况。结果 高糖抑制Na-K-ATP酶α1与β1的mRNA表达，2周、4周时α1与β-actin光密度比值分别为0．17、0．23，对照组分别为0．37、0．36；β1与β-actin光密度比值分别为0．69、0．41，对照组分别为0．98、0．83；Na-K-ATP酶β蛋白表达水平较对照组降低，2周、4周时与β-actln的比值分别为0．51、0．25，对照组分别为0．65、0．68。结论 高糖环境下人RPE细胞Na-K-ATP酶基因与蛋白表达水平降低，可能参与了黄斑水肿的发生。     

sFlt-1基因片段对缺氧、高糖下人脐静脉血管内皮细胞及ERK1/2信号通路的影响

目的比较可溶性血管内皮生成因子受体1（sFlt-1）胞外第2～3区和第2～4区对缺氧、高糖条件下血管内皮细胞增生、迁移及细胞外调节蛋白激酶1/2（ERK 1/2）信号转导通路的影响。方法以逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）法从人胎盘组织cDNA文库中扩增出sFlt-1胞外第2～3区和第2～4区,连接入pcDNA3.1载体后电泳,并进行测序鉴定;以羧甲基化葡聚糖（CMD）纳米磁颗粒为基因载体分别携带2种重组质粒,转染人脐静脉内皮细胞（UVECs）后分别进行正常、缺氧和高糖条件下的培养。MTT法检测各组人UVECs的增生;光学显微镜下观察人UVECs的迁移;Western blot法检测各组人UVECs ERK1/2信号通路下游特异性磷酸化激酶ERK 1/2（p-ERK 1/2）蛋白的表达。结果经过pcDNA3.1/sFlt-1（2-3）或pcDNA3.1/sFlt-1（2-4）转染的人UVECs在缺氧和高糖条件下的增生、迁移及p-ERK 1/2蛋白的表达较转染前均明显下降（P〈0.01）;2种重组质粒对缺氧和高糖条件下人UVECs增生、迁移及ERK 1/2信号转导通路的影响差异均无统计学意义（P〉0.05）。结论 sFlt-1受体胞外第2～3区和第2～4区均可抑制缺氧和高糖条件下人UVECs的增生、迁移及ERK1/2信号通路的转导,且2种受体基因片段的作用无明显差异。     

高浓度葡萄糖体外对人晶状体上皮细胞整合素连接激酶表达的影响

目的:观察体外培养的人晶状体上皮细胞系SRA01/04在高浓度葡萄糖条件下细胞的增殖活性及整合素连接激酶(integrin-linked kinase,ILK)的表达变化。方法:用人晶状体上皮细胞系SRA01/04,在培养液中加入不同浓度的葡萄糖溶液,使糖浓度分别为5.5mmol/L(正常对照组),15.5mmol/L,30.5mmol/L和50.5mmol/L,并设立5.5mmol/L葡萄糖+25mmol/L甘露醇组(甘露醇对照组)。细胞经过处理0,6,12,24,48,72h后,用MTT法检测晶状体上皮细胞的增殖活性,并用Western blot法检测细胞在30.5mmol/L葡萄糖处理6,12,72h后ILK蛋白表达量的变化。结果:高糖作用下晶状体上皮细胞的增殖活力高于正常对照组和甘露醇组,在30.5mmol/L组最为明显,而且随高糖暴露时间的延长,在48,72h时细胞的增殖活力增加更显著。30.5mmol/L葡萄糖作用6,72h,晶状体上皮细胞ILK蛋白的表达明显增高,分别是正常组的1.25和1.28倍,而甘露醇并不引起ILK的表达增加。结论:高浓度的葡萄糖促进人晶状体上皮细胞的增生,使细胞中ILK的表达量增加,这些变化并不依赖于高糖引起的高渗透压改变。     

高糖对体外培养的人视网膜色素上皮细胞HSP47表达的影响

目的 探讨高浓度葡萄糖对体外培养的人视网膜色素上皮(RPE)细胞热休克蛋白47(HSP47)表达的影响.方法 RPE细胞分别在5.56 mmol/L葡萄糖(对照组)以及25 mmol/L葡萄糖(高糖组)的培养条件下,通过RT-PCR检测HSP47 mRNA的表达,使用Western blot检测其蛋白水平.结果 高糖条件下,HSP47 mRNA表达水平显著增加(P＜0.05),蛋白水平亦显著增加(P＜0.05).结论 HSP47作为一种胶原特异的分子伴侣,在高糖条件下RPE细胞内表达的增加可能是导致增生型糖尿病视网膜病变(PDR)发展的重要因素之一.     

高糖对人视网膜色素上皮细胞VEGF及PEDF表达的影响

目的 探讨高糖对人视网膜色素上皮(RPE)细胞表达血管内皮生长因子(VEGF)及色素上皮源性生长因子(PEDF)的干预作用.方法 采用HRPE细胞株,将细胞分为正常对照组(NG,5.6 mmol/L葡萄糖)、高糖组(HG,15、20、30 mmol/L葡萄糖)、高渗组(HM,24.4 mmol/L甘露醇+5.6 mmol/L葡萄糖).应用逆转录PCR(RT-PCR)技术检测VEGF及PEDF mRNA的表达.用ELISA技术检测细胞上清液中VEGF蛋白的表达.结果 高糖作用下VEGFmRNA和蛋白表达显著增高,PEDFmRNA的表达受到显著抑制.结论 高糖可从转录水平及蛋白水平诱导HRPE细胞VEGF的表达,并抑制PEDF的表达.     

高糖环境下视网膜微血管周细胞β1，4半乳糖基转移酶-1的表达

目的 了解高糖培养环境下牛视网膜微血管周细胞β1,4半乳糖基转移酶-1(galactosyltransferase-1,GalT-1)的表达情况以及细胞凋亡情况.方法 原代培养牛视网膜微血管周细胞,在含不同浓度葡萄糖的培养基(5 mmol/L,10 mmol/L,20 mmol/L,30 mmol/L)培养72 h,以5 mmol/L浓度葡萄糖培养组作为正常对照组.采用RT-PCR,蛋白凝集素染色法观察不同浓度葡萄糖培养下GalT-1表达的改变情况,同时采用流式细胞观察高糖诱导的细胞凋亡.结果 高糖培养环境下,视网膜微血管周细胞内GalT-1 mRNA表达上调,凝集素染色提示视网膜微血管周细胞蛋白由Galβ1→4GlcNAc糖基化基团的修饰表达上调;视网膜微血管周细胞凋亡加剧,各葡萄糖浓度组的凋亡细胞平均死亡率为7.35±1.82%,16.34±2.25%,29.85±6.66%,39.48±6.48%.结论 高糖环境下,牛视网膜微血管周细胞内β1,4半乳糖基转移酶-1的表达上调,其可能参与了高糖环境下的视网膜微血管周细胞凋亡,参与机制有待进一步研究.     

6-磷酸果糖激酶-2/果糖-2，6-二磷酸酶（PFKFB3）抑制剂3PO对高糖环境下人脐静脉血管内皮细胞新生血管形成的影响

目的　探讨6-磷酸果糖激酶-2/果糖-2,6-二磷酸酶（6-phosphofructokinase-2/fructose-2,6-bisphosphatase 3,PFKFB3）抑制剂3-（3-吡啶基）-1-（4-吡啶基）-2-丙烯-1-酮［3-（3-pyridinyl）-1-（4-pyridinyl）-2-propen-1-one,3PO］对高糖环境下人脐静脉血管内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells,HUVEC）增殖、迁移和管腔形成的影响。方法　将传代培养的HUVEC随机分为4组:正常对照组（5.5 mmol·L^-1葡萄糖）、高渗组 （5.5 mmol·L^-1葡萄糖 +24.5 mmol·L^-1甘露醇）、高糖组 （30.0 mmol·L^-1葡萄糖）及高糖+3PO组（30.0 mmol·L^-1葡萄糖+ 10 μmol·L^-1 3PO）。细胞同步化后按分组情况更换相应培养基,继续培养细胞,用于后续实验。采用MTS实验检测细胞增殖率,细胞划痕实验检测细胞迁移率,体外管腔形成实验检测细胞成管情况,实时荧光定量PCR检测PFKFB3 mRNA表达,Western blot检测PFKFB3及ERK蛋白表达情况。结果　与正常对照组相比,高渗组细胞增殖能力降低（均为P<0.05）;24 h高糖组细胞增殖能力无明显升高（P>0.05）,48 h高糖组细胞增殖能力升高（P<0.05）。与高糖组相比,高糖+3PO组细胞增殖能力明显被抑制（均为P<0.05）。与正常对照组相比,高渗组细胞迁移率明显升高（均为P<0.05）;24 h高糖组细胞迁移率明显升高（P<0.05）,但在48 h高糖组中细胞迁移率升高不明显（P>0.05）。与高糖组相比,高糖+3PO组细胞迁移率明显降低（均为P<0.05）。与正常对照组相比,高渗组及高糖组细胞管腔形成能力均明显减弱（均为P<0.05）。与高糖组相比,高糖+3PO组细胞管腔形成能力减弱（P<0.05）。与正常对照组相比,高渗组PFKFB3 mRNA的表达水平变化不大（P>0.05）,高糖组PFKFB3 mRNA的表达升高 （P<0.05）。与高糖组相比,高糖+3PO组 PFKFB3 mRNA的表达明显降低（P<0.05）。与正常对照组相比,高渗组及高糖组中p-ERK/ERK蛋白比值及PFKFB3蛋白表达均升高（均为P<0.05）。与高糖组相比,高糖+3PO组p-ERK /ERK蛋白比值及PFKFB3蛋白表达下降（均为P<0.05）。结论　PFKFB3抑制剂3PO可明显降低高糖环境下HUVEC的增殖、迁移和管腔形成的能力,其作用机制可能与MAPK/ERK信号通路有关。     

高糖对视网膜Müller细胞VEGF,EPO和EPOR mRNA表达的影响

目的:观察高糖条件下VEGF mRNA,EPO mRNA和EPORmRNA在体外培养的Mller细胞中的表达情况。方法:胰蛋白酶将新生小鼠视网膜组织吹打消化后,制成单细胞悬液,体外培养Mller细胞,RT-PCR测定高糖条件下视网膜Mller细胞VEGF,EPO和EPOR基因的表达。结果:成功获得视网膜Mller细胞,传代后90%以上的细胞呈兔抗鼠谷氨酰胺合酶(GS)染色阳性。Mller细胞VEGF mRNA,EPO mRNA和EPOR mRNA在高糖条件下表达升高,且呈浓度依赖性(P<0.05),但糖浓度50mmol/L组较40mmol/L组差异无统计学意义,无明显时间依赖性。结论:Mller细胞在高糖条件下VEGF,EPO,EPOR的表达增加。     

人羊膜上皮细胞培养液抑制角膜新生血管的实验研究

背景 角膜新生血管(CNV)是一种常见的眼部病变,研究其发病机制及其抑制剂是眼科研究的热点和难点. 目的 研究人羊膜上皮细胞(AECs)培养液对CNV的抑制作用及机制. 方法 消化法培养及鉴定人AECs,并收集培养液,酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测色素上皮衍生因子(PEDF)和白细胞介素1受体拮抗剂( IL-1Ra)在培养液中的质量浓度.兔角膜上皮细胞分离后分别用无血清DMEM培养基、人AECs培养液、混合培养液(DMEM+人AECs培养液)培养48 h,采用实时定量聚合酶链反应(QRT-PCR)法检测不同培养液培养的角膜上皮细胞中血管内皮生长因子(VEGF)及碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的表达.用含质量分数10％胎牛血清的DMEM培养基培养人脐静脉血管内皮细胞(UVECs),并分别加入无血清DMEM、混合培养液和人AECs培养液,划痕法和细胞计数试剂盒8(CCK8)法检测各组培养液对人UVECs迁移的影响.分别在上述3种培养基中加入终质量浓度为50 μg/L的bFGF,CCK8法检测各培养液中人UVECs的增牛情况.在原子力显微镜(AFM)下观察人AECs培养液对人UVECs超微结构的影响. 结果 人羊膜培养和传代细胞角蛋白免疫组织化学染色阳性证实为人AECs.与无血清DMEM组相比,人AECs培养液组的兔角膜上皮细胞VEGF mRNA(1.00±0.22 vs.2.98±0.46)及bFGF mRNA( 1.00±0.36vs.2.55±0.48)的表达均明显下降,差异均有统计学意义(P=0.001、0.002);培养后不同时间人AECs培养液组人UVECs的增生吸光度(A)值明显下降,差异均有统计学意义(P＜0.05),人UVECs的迁移率下降,差异有统计学意义(P＜0.05).AFM观察见人AECs培养液组的血管内皮细胞膜粗糙、表面颗粒紊乱,细胞间连接及伪足减少.ELISA法检测人AECs培养液中PEDF的质量浓度为(70.41 ±0.68) μg/L,IL-1Ra的质量浓度为(153.56±0.36) ng/L,无血清DMEM组中未检出.结论 人AECs培养液可抑制角膜上皮VEGF及bFGF的表达,抑制血管内皮细胞的增生和迁移,细胞结构和功能改变,这可能是其抑制CNV的机制之一.     

乳酸对鼠视网膜血管内皮生长因子表达的影响

目的 观察不同浓度乳酸对培养的大鼠视网膜血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响.方法 2周龄Sprague-Dawley大鼠36只,根据培养液中乳酸含量分为10、20、30 mmol/L乳酸组,每组均为12只大鼠.处死大鼠,摘出眼球剥离视网膜,将视网膜置入插入式培养皿中培养24 h.培养皿中培养液分别为含10、20、30 mmol/L乳酸的Dulbecco改良Eagle培养液+2%胎牛血清.光学显微镜观察视网膜结构、实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白质免疫印迹(Western blot)检测VEGF的表达.结果 光学显微镜组织病理学观察结果显示,视网膜层次清晰,结构完整,未见明显细胞溶解和坏死.RT-PCR检测结果显示,10、20、30 mmol/L乳酸组VEGF mRNA表达量分别为0.74±0.06、0.99±0.12、1.45±0.17;Western blot检测结果显示,10、20 mmol/L乳酸组和30 mmol/L乳酸组视网膜VEGF表达量分别为0.34±0.15、0.54±0.16、0.93±0.23.RT-PCT和Western blot检测结果均显示30 mmol/L乳酸组较10 mmol/L乳酸组VEGF表达明显升高.结论 乳酸诱导视网膜VEGF表达有浓度依赖性.     

Tenomodulin蛋白对血管内皮细胞增生的抑制作用

目的研究tenomodulin（TeM）蛋白对血管内皮生长因子（VEGF）诱导的人视网膜血管内皮细胞（RECs）和人脐静脉内皮细胞（UVECs）增生及其对体外血管样结构形成的作用。方法将传代至3～6代的人RECs和人UVECs生长至融合时用含质量分数0.5%胎牛血清（FBS）的培养基孵箱中培养6h,加入不同质量浓度的VEGF或VEGF＋TeM混合物,继续培养12h,ELISA法检测TeM对VEGF诱导的血管内皮细胞增生的影响。将含10%FBS、1%FBSDMEM培养基的人RECs和人UVECs悬液分别接种于预先放置基质胶的24孔培养板表面,含1%FBS培养基的细胞培养板内分别加入VEGF（100μg/L）或VEGF＋TeM混合物37℃继续培养6h,共焦显微镜下观察,图像处理分析软件量化分析TeM蛋白对毛细血管样结构形成的作用。结果随着VEGF质量浓度的增加,血管内皮细胞DNA合成增加,其吸光度（A）值呈明显上升曲线,而添加TeM组的A值比VEGF组降低,差异有统计学意义（P〈0.01）。含10%FBS和1%FBS培养基的血管内皮细胞在基质胶表面形成毛细血管样结构,并连接成网状;在基质胶表面同时添加VEGF的血管内皮细胞,其毛细血管样结构明显增多,长度明显变长。添加TeM组的血管内皮细胞和其毛细血管样结构破坏,每个视野内血管内皮细胞毛细血管样结构显著破坏,管形细胞总长度明显变短。结论 TeM蛋白对血管内皮细胞的增生及体外血管样结构的形成有明显抑制作用。     

FK506对高糖培养视网膜Müller细胞血管内皮生长因子表达的抑制作用

背景 视网膜M＆#252;ller细胞可通过表达血管内皮生长因子（VEGF）参与糖尿病视网膜病变（DR）的病理过程.FK506可抑制实体肿瘤及实验性角膜新生血管中VEGF的表达,但其对视网膜M＆#252;ller细胞中VEGF的表达是否有抑制作用鲜见文献报道.目的 观察FK506对高糖培养的大鼠视网膜M＆#252;ller细胞表达血管内皮生长因子（VEGF）的影响.方法 将大鼠永生化视网膜Müller细胞系进行常规培养并将对数生长期的Müller细胞分别接种到96孔培养板中,分别在培养液中加入800.00、400.00、200.00、100.00、75.00、50.00、25.00、12.50和6.25 pg/ml FK506 100 μl/孔（细胞密度为1×10^4个/ml）,MTT比色法确定Müller细胞半数抑制浓度（IC50）的最适FK506质量浓度.将大鼠视网膜Müller细胞系分为正常对照组、FK506组、高糖组和高糖＋ FK506组,分别用高糖DMEM培养液（含50 mmol/L D-葡萄糖）和正常DMEM培养基（含5.5 mmol/L D-葡萄糖）进行培养,并分别在培养基中加入FK506,至质量浓度为75 pg/ml.ELISA法检测培养细胞上清液中VEGF的质量浓度;分别采用逆转录PCR（RT-PCR）和Western blot法检测各组大鼠视网膜Müller细胞中VEGF mRNA及其蛋白的相对表达量,分别以目的基因与内参β-actin吸光度（A）比值和灰度比值表示.结果 光学显微镜下正常对照组、FK506组、高糖组及高糖＋Fk506组培养12、24、48 h的大鼠视网膜Müller细胞均呈多角形,大小一致.致大鼠视网膜Müller细胞IC50的FK506质量浓度为75 pg/ml.正常对照组、FK506组、高糖组和高糖＋FK506组细胞上清中VEGF蛋白的质量浓度分别为（966.46±13.59） pg/ml、（1 059.42±67.43） pg/ml、（16 243.11±3 926.38）pg/ml和（9 467.25±1 525.56） pg/ml,总体差异有统计学意义（F=20.51,P=O.00）,其中高糖组细胞上清中VEGF的质量浓度明显高于正常对照组,差异有统计学意义（P=0.00）;高糖＋FK506组较高糖组细胞上清中VEGF的质     

羟基红花黄色素A对高糖作用下视网膜微血管内皮细胞增殖的影响

目的:探讨羟基红花黄色素A(HSYA)对高糖培养下恒河猴脉络膜血管内皮细胞(RF/6A)增殖及血管内皮生长因子(VEGF)mRNA表达的影响。方法:取体外培养的RF/6A细胞,分为NG+H0组(含有5.5mmol/L葡萄糖,HSYA的浓度为0mg/L)及HG+H0、HG+H18、HG+H37、HG+H73组(各组中均含有22mmol/L葡萄糖,HSYA的浓度分别为0,18,37,73mg/L)。培养24,48和72h,分别使用噻唑盐比色法(MTT)检测细胞增殖的活性。采用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)检测各组中RF/6A细胞中VEGFmRNA的表达。结果:MTT检测结果表明,HSYA作用48h,HG+H37、HG+H73组细胞吸光度值均明显低于HG+H0组(P<0.01),随着HSYA浓度的增加,各组吸光度值降低。作用72h,HG+H18、HG+H37和HG+H73组细胞吸光度值均明显低于HG+H0组(P<0.01),随着HSYA浓度的增加,各组吸光度值降低,HG+H73组抑制作用最明显,其细胞吸光度值明显低于HG+H18和HG+H37组(分别为P<0.01和P<0.05)。RT-PCR实验结果表明:与HG+H0组相比,作用48h,HG+H37、HG+H73对RF/6A细胞VEGFmRNA表达的抑制作用显著(P<0.01);而作用72h,HG+H18、HG+H37和HG+H73对高糖诱导的VEGFmRNA的表达均有抑制作用(P<0.01)。结论:HSYA能够抑制高糖诱导的RF/6A细胞的增殖并下调高糖所致的VEGFmRNA表达升高,提示其可能机制是通过VEGF途经来实现的。