VEGF siRNA对兔眼碱烧伤后角膜新生血管的抑制作用

目的:研究血管内皮生长因子小干扰RNA(VEGF small in-terfering RNA,VEGF siRNA)对兔眼碱烧伤后角膜新生血管的抑制作用。方法:普通家兔25只以碱烧伤法(1mol/LNaOH溶液)诱导角膜新生血管(CNV)生成。碱烧伤后立即以脂质体(LF2000)为载体,右眼球结膜下注射VEGF siRNA重组质粒,左眼球结膜下注射pSilencer 2.1-U6 hygro空白质粒作为阴性对照。碱烧伤后1,3,5,7,14d,形态学分析评价角膜新生血管的生长情况。结果:与对照眼相比,碱烧伤后球结膜下注射VEGF siRNA重组质粒,实验眼在各时间段(3,5,7,14d),CNV长度明显变短,面积明显变小,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:VEGF siRNA能有效地抑制碱烧伤后CNV的形成。     

HIF-1α特异性dsRNA抑制鼠视网膜新生血管的剂量效应关系

目的探讨缺氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)特异性dsRNA抑制鼠视网膜新生血管的剂量效应关系。方法 (1)采用Smith的方法 ,将8d龄的C57BL/6J小鼠置于氧舱,控制氧分压75%±3%,5d后回到正常氧环境,喂养7d后处死;采用FITC-Dextran荧光造影视网膜铺片观察视网膜新生血管的形态,鉴定视网膜新生血管模型;(2)将8只8d龄小鼠于空气中喂养,为正常组。(3)另51只8d龄小鼠放入75%±3%的高氧环境中(同Smith方法 ),5d后出舱分为3组:对照组、空载体组和基因治疗组,其中对照组3只,空载体组3只,基因治疗组45只。基因治疗组按照剂量比例(脂质体∶质粒)又随机分成9组,每组5只。出舱当天,空载体组小鼠玻璃体内注射空载体pSilencer2.1-U6hygro,基因治疗组按照不同剂量比例注射HIF-1α特异性dsRNA表达质粒pSilencer2.1-U6hygro,均采用脂质体介导。对照组小鼠不作任何处理。(4)注射后7d,采用FITC-Dextran荧光造影视网膜铺片观察视网膜新生血管的形态变化,采用病理切片统计突破内界膜的血管内皮细胞核数。结果 (1)荧光造影视网膜铺片发现,正常组整个视网膜血管分布呈规则均匀的网状结构。对照组和空载体组视网膜血管不规则扩张,周边部有大量血管新生。基因治疗组中央区视网膜血管迂曲及不规则扩张较对照组和空载体组明显减轻,其中脂质体∶质粒为1∶1组更为明显。(2)病理切片显示,正常组很少见到突破视网膜内界膜的内皮细胞核,而对照组和空载体组中均有大量突破内界膜的内皮细胞核,其发生率为100%。对照组平均每张切片的血管内皮细胞核数为11.6个,空载体组为11.5个,基因治疗组较对照组和空载体组明显减小,平均为4.56个,其中脂质体与质粒比为1∶1组最少,为2.2个。统计学分析表明,除对照组和空载体组间差异无统计学意义外,其余各组间差异均有统计学意义(均为P<0.05)。结论采用脂质体介导,玻璃体腔显微注射HIF-1α特异性dsRNA表达质粒pSilencer2.1-U6hygro能有效抑制小鼠缺血性视网膜病变模型新生血管的形成,其中脂质体∶质粒为1∶1组抑制效率最高。     

L 形钛板黄斑外垫压治疗近视牵拉性黄斑病变

目的 评价L 形硅海绵钛板黄斑外垫压联合玻璃体切割术治疗近视牵拉性黄斑病变的临床疗效。方法 前瞻性研究收集2015 年8 ～ 11 月在中南大学湘雅医院行L 形硅海绵钛板黄斑外垫压联合玻璃体切割术的7 例7 眼近视牵拉性黄斑病变患者的临床资料,术后随访观察黄斑形态变化（如劈裂腔有无缩小或消失）,最佳矫正视力、眼轴长度及眼压变化情况。计量资料采用t 检验进行统计学分析。结果 随访时间为4 ～ 6 个月,黄斑部劈裂腔完全消失者2 例,明显缩小者5 例。患者术前平均LogMAR 视力为（1.50±0.50）,末次随访平 均LogMAR 视力为（0.87±0.32）,差异有统计学意义（P <0.05）。至末次随访时,患者的平均眼轴为（27.72±1.75）mm,术前平均眼轴为（28.72±1.97）mm,差异有统计学意义（P <0.05）。其中1 例患者术后1 周出现高眼压,加用2 种局部降压滴眼液,眼压恢复正常,至术后1.5 个月停药。结论 L 形硅海绵钛板黄斑外垫压联合玻璃体切割术治疗近视牵拉性黄斑病变是一种有效的手术法。     

缺氧诱导因子1α和血管内皮生长因子干扰性RNA抑制鼠视网膜新生血管的研究

目的 探讨缺氧诱导因子1α(HIF-1α)和血管内皮生长因子(VEGF)小片段干扰性RNA(siRNA)对小鼠视网膜新生血管的抑制作用.方法 本研究采用随机对照方法.构建HIF-1αsiRNA重组质粒.C57BL/6J小鼠玻璃体腔注射增强型绿色荧光蛋白(EGFP)表达质粒pEGFP-N1,1 d后视网膜铺片观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达.选7天龄C57BL/6J小鼠90只,17只为正常组,73只建立氧诱导的视网膜新生血管模型,分为模型对照组、空载体组和基因治疗组(HIF-1α siRNA组、VEGF siRNA组及共转染组).于出氧舱前1 d,向空载体组小鼠玻璃体腔注射空载体质粒;HIF-1α siRNA组注射HIF-1α siRNA,VEGF siRNA组注射VEGF165 siRNA,共转染组注射HIF-1αsiRNA+VEGF165 siRNA.采用荧光造影视网膜铺片方法观察血管形态变化;制作组织切片计算突破视网膜内界膜的血管内皮细胞核数;采用逆转录聚合酶链反应和Western blot检测视网膜HIF-1α和VEGF的表达.采用单因素方差分析和组间最小显著差法进行统计学分析.结果 pEGFP-N1经脂质体LF2000介导转染视网膜细胞后1 d即可见GFP表达.基因治疗组较模型对照组新生血管丛明显减少,荧光渗漏明显减轻,其中共转染组效果最明显.基因治疗组[HIF-1α siRNA组为(27.73±2.33)个,VEGF siRNA组为(15.43±3.23)个,共转染组为(8.70 ±2.88)个]较其他3组突破视网膜内界膜的细胞核数量减少,差异均具有统计学意义(F=3016.527,P＜0.01).视网膜HIF-1α mRNA及蛋白表达水平:模型对照组(1.08±0.06,0.383±0.009)和空载体组(1.09±0.05,0.386 ±0.010)较正常组(0.81 ±0.07,0.035±0.003)上调,而HIF-1α siRNA组(0.46±0.06,0.182±0.008)较模型对照组下调,抑制效率分别为57.4%和52.5%,差异均有统计学意义(F=139.804,2686.001;P＜0.01).VEGF mRNA及蛋白表达水平:模型对照组(1.53 ±0.07,0.340±0.004)和空载体组(1.59±0.06,0.337±0.009)较正常组(0.27±0.08,0,051±0.008)明显上调,而基因治疗组较模型对照组明显下调,差异均有统计学意义(F=421.423,2513.583;P＜0.01),其中共转染组下调最明显,抑制效率分别为85.6%和80.9%.结论 HIF-1α siRNA和VEGF165siRNA均可有效抑制小鼠视网膜新生血管形成,两种siRNA共转染抑制效果最明显.     

轴突导向因子-1 mRNA在氧诱导血管增生性视网膜病变中的表达

目的研究高氧诱导的视网膜新生血管模型鼠中轴突导向因子-1（Netrin-1）mRNA的表达差异。方法采用高氧诱导的方法制作鼠视网膜新生血管模型;运用荧光造影视网膜铺片及视网膜切片苏木精-伊红染色观察视网膜新生血管的形态。于出生后第12、14、17d取小鼠视网膜,采用RT-PCR测定Netritt-1mRNA的表达水平。结果模型组视网膜铺片及组织切片可见大量视网膜新生血管形成。出生后12d,模型组与正常组视网膜组织中Netrin-1mRNA表达水平无明显差异;出生后14d,模型组视网膜组织中Netrin-1mRNA表达水平明显上调;出生后17d模型组视网膜组织中Netrin-1mRNA表达水平仍高于正常组。结论模型鼠视网膜新生血管发生过程中,持续缺氧的视网膜组织可能从转录水平增加Netrin-1的表达,从而诱导视网膜新生血管的发生。     

脂质体介导增强型绿色荧光蛋白基因在鼠视网膜M&#252;ller细胞中的表达

目的研究脂质体介导增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因对体外培养的鼠视网膜M&#252;ller细胞转染的有效性及安全性。方法采用视网膜组织块法培养鼠视网膜M&#252;ller细胞,振荡法分离纯化细胞,并对其进行免疫细胞化学鉴定。用阳离子脂质体Lipofectamine 2000负载pEGFP-N1质粒转染M&#252;ller细胞,荧光显微镜检测转染后12、24、48、72h的转染效率。台盼蓝排斥实验检测转染和未转染细胞的活力,明确脂质体Lipofectamine 2000对M&#252;ller细胞的毒性作用。结果成功培养视网膜M&#252;ller细胞,传代后90%以上的细胞呈神经胶质纤维酸性蛋白（GFAP）染色阳性。Lipofectamine 2000介导质粒pEGFP-N1转染M&#252;ller细胞后12、24、48、72h的转染效率分别为（9.7&#177;1.9）%、（18.1&#177;16）%、（17.2&#177;2.5）%、（16.9&#177;1.7）%。台盼蓝排斥实验显示Lipofectamine 2000转染前后活细胞率分别为（98.2&#177;5.6）%、（96.1&#177;6.2）%。结论脂质体Lipofectamine 2000可安全有效地介导M&#252;ller细胞的转染,为进一步明确M&#252;ller细胞的病理、生理功能及靶向M&#252;ller细胞的基因治疗提供了新的手段。     

促红细胞生成素在视网膜新生血管形成中的作用

探讨促红细胞生成素(EPO)在增殖性视网膜新生血管形成中的作用。采用高氧诱导的方法制作小鼠增殖性视网膜病变模型,运用视网膜铺片免疫组化染色观察视网膜新生血管的形态。用RT-PCR及Western blot技术测定视网膜组织中EPO的表达水平。结果显示,模型鼠视网膜组织具有大片无灌注区和视网膜新生血管形成伴荧光渗漏。模型鼠视网膜组织中EPO mRNA及蛋白质表达水平在缺氧状态下逐渐升高,于缺氧48小时(出生后14天)到达高峰,然后缓慢下降,至出生后26天降至基线水平。这说明,氧诱导的增殖性视网膜病变模型鼠中,持续缺氧的视网膜组织通过增加EPO的表达,从而诱导视网膜新生血管的发生。     

转录因子Islet-1在氧诱导血管增生性视网膜病变中的表达

目的:研究高氧诱导的视网膜新生血管模型鼠中转录因子Islet-1的表达差异。方法:采用高氧诱导的方法制作鼠视网膜新生血管模型,运用荧光造影视网膜铺片及视网膜切片苏木精-伊红染色观察视网膜新生血管的形态。于小鼠出生后第7,12,14,17,26d取视网膜组织,采用Real-time PCR及Western blot技术测定视网膜组织中Islet-1的表达水平。结果:模型组视网膜铺片及组织切片可见大量视网膜新生血管形成。小鼠出生后第7d,模型组与正常组视网膜组织中Islet-1表达水平无明显差异;小鼠出生后第12~14d,模型组视网膜组织中Islet-1表达水平明显上调;出生后17d,模型组视网膜组织中Islet-1表达水平仍高于正常组;出生后26d,随着视网膜新生血管消退,视网膜组织中Islet-1表达水平降至正常水平。结论:模型鼠视网膜新生血管发生过程中,持续缺氧的视网膜组织通过增加转录因子Islet-1的表达,从而诱导视网膜新生血管的发生。     

高糖对人脐静脉内皮细胞促红细胞生成素受体表达的影响

目的探讨高糖条件下促红细胞生成素（EPO）受体mRNA及蛋自在人脐静脉内皮细胞（UVECs）的表达差异。方法体外常规培养人UVECs细胞株,实验组分别给予22mmol／L葡萄糖作用12、24、48、72h,5．5mmol／L葡萄糖组（生理糖浓度）设为正常对照组,5．5mmol／L葡萄糖＋16．5mmol／L甘露醇组为渗透压对照组。采用逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）、免疫细胞化学法对高糖条件下人UVECsEPO受体mRNA和蛋白的表达进行检测。结果正常对照组和渗透压对照组相比,人UVECsEPO受体mRNA和蛋白表达差异均无统计学意义（P〉0．05）。人UVECs在22mmol／L高糖作用12、24、48、72h后,EPO受体mRNA和蛋白表达均显著高于正常对照组（P〈0．05）,且随着时间的延长,EPO受体mRNA和蛋白的表达均逐渐增加。结论高糖条件下人UVECsEPO受体mRNA和蛋白表达均增强,且呈时间依赖性。人UVECs在22mmol／L高糖条件下EPO受体mRNA及蛋白表达的增加与渗透压无关。     

低氧诱导因子-1α干扰RNA对血管内皮生长因子mRNA表达的抑制作用

目的 探讨低氧诱导因子-1α（hypoxia inducible factor-1α．HIF-1α）特异性小片段干扰RNA表达载体pSUPER^H1-SiHIF1α对低氧诱导因子-1α和血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor．VEGF）mRNA表达的抑制作用。方法 构建HIF-1α特异性小片段干扰RNA表达载体pSUPER^H1-SiHIF1α通过脂质体Lipofectamine2000分别介导pSUPER^H1-SiHIF1α转染低氧状态下培养的人低分化鼻咽鳞癌细胞（nasopharyngeal carcinoma cell line，CNE2），对照组转染pSUPER空载体．采用半定量RT—PCR方法检测HIF-1αmRNA和VEGF mRNA的表达。结果 转染DSUPER^H1-SiHIF1α的CNE2细胞中HIF-1α mRNA和VEGF mRNA的表达较对照组分别降低79．4％和65．7％。结论 HIF-1α特异性小片段干扰RNA表达载体pSUPER^H1-SiHIF1α能明显抑制HIF-1α mRNA和VEGF mRNA的表达。