严重急性呼吸综合征冠状病毒2假病毒的制备及验证

目的 建立严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）假病毒（SARS-CoV-2 pps）的制备方法。方法 设计、合成序列优化的SARS-CoV-2刺突蛋白（S）基因,构建表达质粒,转染293T细胞,用免疫荧光检测S蛋白的表达;将该质粒与基于慢病毒基因骨架的含增强绿色荧光蛋白（EGFP）报告基因的假病毒包装质粒共转染293T细胞,收集细胞培养上清,感染Vero E6和Huh7细胞,观察细胞内EGFP的表达;将制备的SARS-CoV-2 pps感染Vero E6细胞,检测膜融合抑制剂氯喹和盐酸阿比朵尔、SARS-CoV-2 S1蛋白单克隆抗体及新型冠状病毒肺炎患者恢复期血清对假病毒感染性的影响。结果 构建的SARS-CoV-2 S质粒转染的293T细胞可与S1蛋白单克隆抗体及新型冠状病毒肺炎患者恢复期血清反应。SARS-CoV-2 S质粒与HIV假病毒包装质粒共转染293T细胞的上清加入Vero E6细胞和Huh7细胞36 h和72 h后可分别观察到细胞内表达的EGFP,EGFP阳性的Huh7细胞数量明显多于Vero E6细胞。2种膜融合抑制剂、1株人源S1单克隆抗体及2份新型冠状病毒肺炎患者恢复期血清均可有效抑制SARS-CoV-2 pps对Vero E6细胞的感染（P均<0.01）。结论 成功制备了SARS-CoV-2 pps,其可用于后续抗SARS-CoV-2药物筛选与疫苗评价。     

严重急性呼吸综合征冠状病毒2 DNA疫苗与重组亚单位疫苗在小鼠中诱导中和抗体的效力分析

目的 探讨以严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）受体结合区（RBD）和表面刺突蛋白（S蛋白）S1亚基为疫苗靶抗原诱导中和抗体的效果。方法 构建SARS-CoV-2 RBD与小鼠IgG1 Fc段（mFc）融合蛋白表达质粒pVRC-RBD-mFc,转染人胚肾细胞293T并进行培养。用蛋白质印迹法检测细胞培养上清中的RBD-mFc融合蛋白,用微量中和实验检测细胞培养上清中的RBD-mFc及CHO细胞重组表达的SARS-CoV-2 S1与人IgG1 Fc段（S1-hFc）融合蛋白对SARS-CoV-2感染的抑制作用。分别用质粒pVRC-RBD-mFc及S1-hFc融合蛋白通过肌内注射接种BALB/c小鼠,用ELISA检测小鼠血清中的抗-S1 IgG,用微量中和实验检测小鼠血清的病毒中和活性。结果 pVRC-RBD-mFc质粒转染293T细胞的培养上清中可检测到RBD-mFc融合蛋白,超滤浓缩的细胞培养上清及S1-hFc融合蛋白均呈浓度依赖性抑制SARS-CoV-2对Vero E6细胞的感染;经pVRC-RBD-mFc质粒及S1-hFc融合蛋白免疫的小鼠血清中均可检测出抗-S1 IgG,且能中和SARS-CoV-2的感染;S1-hFc融合蛋白免疫小鼠血清的抗体滴度及病毒中和活性均高于质粒pVRC-RBD-mFc免疫小鼠血清（P均<0.01）。结论 SARS-CoV-2 RBD和S1蛋白均可能作为有效的疫苗抗原,重组亚单位疫苗较DNA疫苗能更有效地诱导中和抗体。     

严重急性呼吸综合征冠状病毒2咽拭子核酸检测法假阴性调查分析

目的 探讨严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）咽拭子核酸检测法的假阴性率,并分析其原因,为稳固我国新型冠状病毒肺炎（COVID-19）防控工作提供参考。方法 对2020年2月19日至3月20日湖北省妇幼保健院光谷院区收治的1 452例COVID-19患者的咽拭子核酸检测结果进行回顾性分析,将出院前检测结果为阳性之前的阴性结果判定为假阴性,统计假阴性患者例数。随访出院患者,筛选出院后再次核酸检测阳性（复阳）的患者,分析出院前病毒核酸检测连续阴性次数和核酸复阳的关系。结果 1 452例COVID-19患者中男592例（40.77%）、女860例（59.23%）。212例（14.60%）咽拭子核酸检测结果曾出现假阴性。共随访到28例（1.93%）出院后复阳患者,连续2次核酸检测阴性的918例患者中有24例（2.61%）复阳,高于连续3次及以上核酸检测阴性患者的复阳率（0.75%,4/534）,差异有统计学意义（χ²=6.21,P=0.012 7）。结论 SARS-CoV-2咽拭子核酸检测法具有一定比例的假阴性,是患者出院后核酸复阳的原因之一。建议出院前由不同检测者进行多次、连续检测,满足连续3次及以上核酸检测阴性的出院标准可以降低复阳率。     

硫酸羟氯喹联合阿奇霉素治疗难治性普通型新型冠状病毒肺炎的临床疗效及安全性

目的 初步评价硫酸羟氯喹联合阿奇霉素治疗难治性普通型新型冠状病毒肺炎（COVID-19）患者的临床疗效及安全性。方法 回顾性收集2020年3月22日至25日湖北省妇幼保健院光谷院区治疗的11例难治性普通型COVID-19患者资料。联合治疗方案：硫酸羟氯喹200 mg每天3次口服（第1～7天）;阿奇霉素500 mg每天1次口服（第1天）,250 mg每天1次口服（第2～4天）。在给药后第4～10天连续复查咽拭子严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）核酸,给药前3 d内及给药后第8天进行血常规等实验室检查。结果 11例COVID-19患者均为普通型,其中7例为SARS-CoV-2核酸检测持续阳性患者,4例为核酸检测复阳患者。联合给药前11例患者的平均病程为50.2 d。治疗过程顺利,给药后第4天咽拭子SARS-CoV-2核酸转阴0例,第5天转阴2例,第6天转阴2例,第7天转阴2例,第8天转阴1例,第9天转阴1例。11例患者均未进展为重型或危重型,未观察到明显不良反应。结论 硫酸羟氯喹联合阿奇霉素方案对于接受多种治疗失败、SARS-CoV-2核酸检测持续阳性的难治性普通型COVID-19患者安全有效。     

新型冠状病毒特异性抗体微流控法定量检测能力评价及应用

目的：建立并评价新型冠状病毒即严重急性呼吸综合征冠状病毒2型(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)特异性抗体定量检测方法,为新型冠状病毒肺炎(corona virus disease-2019,COVID-19)疫情防控提供血清学研判支持。方法：采集2020年1—2月SARS-CoV-2感染者及其密切接触者的血清和咽拭子样本,分别用RT-qPCR法检测SARS- CoV-2核酸,微流控法和胶体金法检测SARS-CoV-2特异性抗体,并比较分析检测结果的一致性。结果：微流控法、胶体金法检测SARS-CoV-2特异性IgG抗体的结果均与RT-qPCR方法一致。发病早中期(＜14 d)与后期(≥14 d)微流控法IgG抗体阳性率差异有统计学意义。结论：微流控法是一种新型可定量的SARS-CoV-2抗体检测法,检测结果准确且耗时短。     

高压氧治疗老年危重型新型冠状病毒肺炎气管插管患者1例临床效果

目的 报道1例高龄危重型新型冠状病毒肺炎（COVID-19）气管插管患者的高压氧治疗（HBOT）经验,为拓展HBOT在COVID-19治疗中的应用提供参考依据。方法和结果 患者男,87岁,2020年2月3日出现昏迷症状,行胸部CT检查示双肺多发小片状模糊影,2月5日肺泡灌洗液严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）核酸检测阳性,确诊COVID-19。经对症、支持治疗后患者病情逐渐稳定,于2月22日拔除气管插管,但因患者无咳嗽、排痰能力于2月24日再次气管插管、呼吸机辅助呼吸,判断病情为危重型。2月29日患者首次接受HBOT,医护人员经专用通道进入高压氧舱全程陪同。HBOT治疗4次后,患者动脉血氧分压（PaO₂）与动脉血二氧化碳分压（PaCO₂）趋向稳定,CO₂潴留现象缓解,肝肾功能有所改善,凝血功能恢复,3月6日查SARS-CoV-2 IgM阴性、SARS-CoV-2 IgG阳性,转入普通病房继续治疗。结论 HBOT有利于缓解危重型COVID-19患者的CO₂潴留现象,对降低机体缺氧损伤、保护重要脏器功能有积极作用。整体HBOT感染控制程序可行,通过合理设计能够保障医务人员安全。     

新型冠状病毒疫苗接种对维持性血液透析合并COVID-19患者的价值

目的 探讨接种新型冠状病毒疫苗（新冠疫苗）对维持性血液透析（MHD）患者新型冠状病毒感染（COVID-19）严重程度的影响。方法 回顾性分析2022年12月至2023年1月安徽医科大学附属阜阳人民医院肾内科收治的166例终末期肾脏病行MHD合并COVID-19患者的临床资料。依据疫苗接种情况分为未接种组（接种0针）及接种组（接种≥2针）。比较两组患者临床特征及短期预后，并应用logistic回归模型分析患者住院及重症风险增加的独立危险因素。结果 166例MHD合并COVID-19患者中，未接种组91例（54.8%），接种组75例（45.2%）。未接种组年龄与吸烟比例高于接种组（P<0.05）。感染新型冠状病毒肺炎后，患者临床表现多样，发热（73.1%）、乏力（65.6%）、食欲减退（57.5%）最常见。接种组使用激素、中心吸氧、住院、重症比例明显减少，治愈患者比例显著增加（P<0.05）。接种新冠疫苗可减少MHD患者住院（OR=0.364，95% CI：0.147~0.901）及重症（OR=0.182，95% CI：0.037~0.901）发生风险。合并糖尿病、冠状动脉粥样硬化性心脏病（冠心病）是MHD合并COVID-19患者住院及重症风险增加的独立危险因素，年龄是其重症风险增加的独立危险因素。结论 终末期肾脏病接受MHD合并COVID-19患者临床表现多样，合并糖尿病、冠心病患者住院及重症风险均增加，年龄增加患者重症风险增加，接种新冠疫苗可减少住院及重症风险。     

严重急性呼吸综合征冠状病毒2核衣壳蛋白原核表达、纯化及其抗血清制备

目的 表达并纯化重组的严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）核衣壳（N）蛋白,通过免疫小鼠制备SARS-CoV-2 N蛋白抗血清。方法 将含有SARS-CoV-2 N基因的pET28a-N原核表达质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）,用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导蛋白表达,用Ni-NTA亲和层析柱纯化SARS-CoV-2 N重组蛋白;将SARS-CoV-2 N重组蛋白联合锰佐剂通过肌内和皮下多点注射免疫BALB/c小鼠,获得抗血清;用蛋白质印迹分析检测SARS-CoV-2 N重组蛋白与SARS-CoV-2 N单克隆抗体及严重急性呼吸综合征冠状病毒（SARS-CoV）N多克隆抗体的反应;用间接免疫荧光实验检测小鼠抗血清与真核表达质粒转染细胞中SARS-CoV-2 N重组蛋白的反应。结果 成功诱导大肠杆菌表达出可溶性的SARS-CoV-2 N重组蛋白,相对分子质量约为55 000,纯化出该重组蛋白;蛋白质印迹分析结果显示SARS-CoV-2 N重组蛋白能与SARS-CoV-2 N单克隆抗体及SARS-CoV N多克隆抗体结合;间接免疫荧光实验检测结果表明制备的小鼠抗血清能与哺乳动物细胞中表达的SARS-CoV-2 N重组蛋白结合。结论 成功表达、纯化出SARS-CoV-2 N重组蛋白,并制备出该蛋白的小鼠抗血清,为后续建立SARS-CoV-2的快速诊断方法及开展SARS-CoV-2 N蛋白的功能研究奠定了基础。     

新型冠状病毒肺炎患者6例临床特征和影像学表现

目的 总结6例新型冠状病毒肺炎（COVID-19）患者的临床特征和影像学表现，为COVID-19早期确诊和临床干预提供依据。方法 选择上海中医药大学附属第七人民医院2020年1月1日至2020年2月22日严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）核酸检测阳性的6例COVID-19患者，回顾性分析流行病学史、临床表现、影像学资料和实验室检查。结果 6例患者均有明确的武汉旅行或居住史，4例患者有发热，3例有咳嗽，2例有流涕、咽痛等上呼吸道症状，2例有头痛、肌肉酸痛等全身症状。6例患者胸部CT检查均可见肺部异常表现，病灶均为双侧分布，下肺病灶多于上肺，主要表现为双侧肺野外带多发磨玻璃影、实变影、“铺路石”征及不同程度纤维化。发病后较晚行胸部CT检查可见肺实变和明显纤维化。结论 COVID-19影像学具有一定的特征性表现，结合患者流行病学史、临床表现和SARS-CoV-2核酸检测能早期诊断。     

重型新型冠状病毒肺炎患者病毒核酸阳性持续时间的影响因素分析

目的 分析重型新型冠状病毒肺炎（COVID-19）患者病毒核酸阳性持续时间及其影响因素,为了解重型COVID-19患者的病毒清除状态及临床治疗和管理提供依据。方法 回顾性收集2020年2月10日至3月28日在湖北武汉同济医院中法院区住院治疗的41例重型COVID-19患者的临床资料,采集患者口咽部分泌物的病毒核酸检测结果及其临床信息和实验室检查结果。患者从发病到病毒核酸转阴时间定义为病毒核酸阳性持续时间。使用多因素Cox回归分析探讨影响重型COVID-19患者病毒核酸阳性持续时间的因素。结果 41例重型COVID-19患者中男20例（48.8%）、女21例（51.2%）,中位年龄为68.0（58.5,74.0）岁,平均病毒核酸阳性持续时间为（28.98±11.71）d。多因素Cox回归分析提示糖尿病、淋巴细胞绝对值及较大剂量糖皮质激素（激素总量≥300 mg）的使用与病毒核酸阳性持续时间有关（P均<0.05）,而较小剂量糖皮质激素（激素总量<300 mg）的使用与病毒核酸阳性持续时间无关（P>0.05）。结论 重型COVID-19患者病毒核酸持续时间较长;糖尿病、淋巴细胞绝对值降低及较大剂量糖皮质激素（激素总量≥300 mg）的使用是病毒核酸阳性持续时间的独立危险因素。     

临床诊断的SARS患者鼻咽拭子采集、SARS冠状病毒分离及鉴定

目的 从临床诊断的严重急性呼吸综合征(severe aeute respiratory syndrome,SARS)患者鼻咽拭子标本分离并鉴定SARS冠状病毒。方法 SARS患者鼻咽拭子标本接种于含Veto及MRC-5单层细胞的24孔培养板中。分离物使用血清学方法、电镜及基因测序进行鉴定。结果 2003年4月-5月北京协和医院共采集79例临床诊断SARS患者的158份鼻咽拭子标本。3例接种Veto细胞孔的鼻拭子标本发现细胞病变效应(cytopathic effect,CPE)。用分离物感染细胞做为抗原,免疫荧光血清学发现SARS患者急性期和恢复期血清标本存在SARS冠状病毒抗体(IgG和IgM)阳转和／或4倍及以上升高。分离物上清液负染电镜观察到冠状病毒。基因测序证实3株分离物是SARS冠状病毒。结论3株自79例SARS患者鼻咽拭子标本的病毒分离物是SARS冠状病毒。     

3例新型冠状病毒肺炎患者不同标本检测分析

目的 分析新型冠状病毒肺炎（COVID-19）患者临床表现及治疗后咽拭子、粪便、尿液的严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）核酸检测阴转情况,探讨新型冠状病毒肺炎（COVID-19）病人的出院标准。方法 回顾性分析3例海南省人民医院收治的COVID-19病例,对其临床表现及治疗后咽拭子、粪便、尿液的严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）核酸检测结果进行描述。结果 3例COVID-19病例治疗后咽拭子核酸转阴性,粪便核酸检测仍呈阳性,合并尿液核酸阳性1例,1例患者病程3周后出现SARS-CoV-2抗体lgM、lgG均阳性(滴度分别为4.416和18.485)。结论 建议严格把握出院标准,推荐增加粪便、尿液核酸检测,出院后仍需集中医学观察14 d以最大限度降低消化道传播风险的可能。     

严重急性呼吸综合征冠状病毒2与新型冠状病毒肺炎

目前正在暴发流行的新型冠状病毒肺炎（COVID-19）的病原体是严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）,这是近年来继严重急性呼吸综合征冠状病毒（SARS-CoV）和中东呼吸综合征冠状病毒（MERSCoV）之后发现的能够感染人的第7种冠状病毒。SARS-CoV-2系单股正链RNA病毒,传染性强,人群普遍对其缺乏免疫力,疫情目前仍在持续。2020年1月30日（当地时间）,WHO将此次疫情列为国际关注的突发公共卫生事件（PHEIC）。本文就SARS-CoV-2病原学、致病性及COVID-19的检测诊断、预防控制和临床治疗等领域的进展进行讨论。     

6例确诊新型冠状病毒肺炎患者临床特征分析

目的 分析新型冠状病毒肺炎（COVID-19）确诊患者的临床特征及流行病学特征,探讨该病早期识别与诊断的方法与经验。方法 归纳截至2020年2月12日海军军医大学（第二军医大学）长海医院感染科6例确诊COVID-19患者的流行病学特征、症状、体征、实验室检查及影像学检查结果,总结其特点与规律。结果 6例确诊COVID-19患者中男5例,女1例。青年患者2例,年龄分别为28、29岁;中老年患者4例,年龄分别为45、62、71、75岁。6例患者起病前均有明确的流行病学接触史,其中2例为家庭聚集性病例。临床表现均以发热和呼吸道症状为主,临床分型均为普通型。6例患者经上海市杨浦区疾病预防控制中心严重急性呼吸综合征冠状病毒2核酸检测均为阳性,实验室检查提示白细胞计数5例正常,1例略降低;淋巴细胞计数3例减少,3例正常。未见其他呼吸道病原体感染证据。6例患者CT检查结果均具有磨玻璃样或双侧斑片状影等典型病毒性肺炎特征。结论 COVID-19传染性很强,人群普遍易感,尽早识别感染者并隔离传染源是防止病毒传播的重要手段。流行病学史仍然是COVID-19诊断的重中之重,CT联合病毒PCR核酸检测是确诊COVID-19的有效方法。     

蝙蝠相关的冠状病毒

2019年12月,新型冠状病毒肺炎（COVID-19）暴发,继2003年严重急性呼吸综合征（SARS）暴发后又给人类敲响了一记警钟。研究者通过溯源分析,发现COVID-19病原体严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）的自然宿主可能是中华菊头蝠。21世纪以来,全球共出现4次冠状病毒[严重急性呼吸综合征冠状病毒（SARS-CoV）、中东呼吸综合征冠状病毒（MERS-CoV）、猪急性腹泻综合征冠状病毒（SADS-CoV）、SARS-CoV-2]的暴发,给人类健康、公共卫生、经济发展及社会稳定造成了巨大的威胁与损失。大量证据表明,这4种冠状病毒的自然宿主可能均为蝙蝠。本文对蝙蝠相关冠状病毒的种类、全球地理分布及引起暴发的蝙蝠相关冠状病毒作一综述。     

支气管镜技术在新型冠状病毒肺炎诊断中的应用及相关职业防护

由严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）引起的新型冠状病毒肺炎（COVID-19）已发展为全球大流行,对民众健康和经济发展造成严重影响。本文总结了SARS-CoV-2首次分离、鉴定样本的来源及病毒RNA病原学检测过程中存在的问题,探讨了支气管镜技术应用于COVID-19诊断的必要性和局限性,阐述了在对COVID-19患者进行支气管镜操作中的职业防护措施,提出加快研发支气管镜操作相关的一次性防护装置的重要性。