lncRNA PITPNA-AS1靶向miR-367-3p调控多发性骨髓瘤细胞增殖、迁移和侵袭的分子机制

【摘要】 目的 探讨长链非编码RNA (lncRNA)PITPNA反义RNA 1（PITPNA-AS1）靶向miR-367-3p调控多发性骨髓瘤细胞增殖、迁移和侵袭的分子机制。方法定量实时聚合酶链反应（qRT-PCR)测定多发性骨髓瘤细胞系RPMI-8226、MM1. S、OPM-2中lncRNA PITPNA-AS1和miR-367-3p表达。在RPMI-8226细胞中转染si-NC (si-NC组）、si-lncRNA PITPNA-AS1（si-lncRNA PITPNA-AS1组）、miR-NC (miR-NC组）、miR-367-3p mimics (miR-367-3p组）,或同时转染anti-miR-NC与si-lncRNA PITPNA-AS1（anti-miR-NC+si-lncRNA PITPNA-AS1组）、anti-miR-367-3p与si-lncRNA PITPNA-AS1（anti-miR-367-3p+si-lncRNA PITPNA-AS1组）,并将未转染的细胞设为对照组（NC组）。采用Western Blot、细胞计数试剂盒8（CCK-8）、细胞克隆形成实验和Transwell实验分别测定RPMI-8226细胞的基质金属蛋白酶（MMP)2、MMP9蛋白表达、细胞活力、克隆形成和迁移、侵袭。双荧光素酶活性检测实验分析lncRNA PITPNA-AS1和miR-367-3p的靶向关系。结果与成骨细胞MC3T3-E1比较,多发性骨髓瘤细胞系RPMI-8226、MM1. S、OPM-2中lncRNA PITPNA-AS1表达量均增加,miR-367-3p的表达量均减少（P<0.05）。干扰lncRNA PITPNA-AS1或miR-367-3p高表达显著降低RPMI-8226细胞的MMP2蛋白、MMP9蛋白的表达量,并降低细胞活力、克隆形式数、迁移和侵袭数量（均P<0.05）。lncRNA PITPNA-AS1靶向调控miR-367-3p的表达。anti-miR-367-3p可以逆转干扰lncRNA PITPNA-AS1对多发性骨髓瘤细胞RPMI-8226增殖、迁移和侵袭的影响。 结论干扰lncRNA PITPNA-AS1通过靶向调控miR-367-3p,从而抑制多发性骨髓瘤细胞的增殖、迁移和侵袭。     

β-榄香烯抑制人骨髓瘤细胞RPMI-8226增殖的实验研究

目的 研究β-榄香烯对人骨髓瘤RPMI-8226细胞增殖、周期和凋亡的影响.方法 用噻唑蓝(MTT)法检测β-榄香烯对骨髓瘤RPMI-8226细胞增殖的影响;Annexin V/ PI双标流式术检测β-榄香烯对骨髓瘤RPMI-8226细胞周期、细胞凋亡的影响;Hoechst33342/PI 双染荧光显微镜观察β-榄香烯处理后骨髓瘤RPMI-8226细胞形态学变化.结果 β-榄香烯对RPMI-8226骨髓瘤细胞生长具有显著抑制作用,呈浓度和时间依赖性.β-榄香烯处理后,与对照组相比G0/G1细胞比例显著升高,而S、 G2/M细胞比例降低.β-榄香烯作用48 h可诱导骨髓瘤细胞凋亡,凋亡率随药物浓度而递增.结论 β-榄香烯可有效抑制人骨髓瘤细胞增殖;其抑制作用与细胞周期阻滞和细胞凋亡激活有关.     

2-甲氧基雌二醇对小鼠恶性黑色素瘤B16细胞增殖、侵袭和迁移能力的影响

目的探讨2-甲氧基雌二醇(2-Methoxyestradiol,2-ME)对恶性黑色素瘤(malignant melanoma,MM)B16细胞增殖、侵袭及迁移的影响。方法将体外培养的小鼠MM B16细胞用不同浓度(10、20、40μmol/L)的2-ME处理。未经任何处理的小鼠MM B16细胞,记作B16-negative。倒置显微镜下观察细胞形态,平板克隆形成实验检测2-ME处理小鼠MM B16细胞2周后的克隆形成能力。Transwell方法观察药物在体外对细胞趋化侵袭能力的影响。观察药物在体外对细胞迁移能力的影响。细胞划痕实验观察经10μmol/L 2-ME处理MM B16细胞24h后划痕愈合程度。结果与对照组比较,不同浓度的2-ME处理MM B16细胞后克隆形成率差异有统计学意义(P<0.05)。与对照组比较,2-ME组细胞侵袭能力及迁移能力差异均有统计学意义(P<0.05)。划痕实验证实对照组的MM B16细胞经过24h后几乎迁移至所有的划痕区域,而实验组MM B16-10μmol/L的划痕区域仅有部分由MM B16细胞占有。结论 2-ME对小鼠MM B16细胞的增殖具有抑制作用,能够抑制MM B16细胞的克隆形成能力。2-ME可以抑制小鼠MM B16细胞的侵袭和迁移运动能力。     

鱼藤素对人骨髓瘤细胞 RPMI-8226 增殖和凋亡的影响

目的 观察鱼藤素对人多发性骨髓瘤细胞株 RPMI-8226 细胞增殖和凋亡的影响及其对核受体共激活因子-3 (SRC-3) 的调控作用,研究鱼藤素诱导凋亡作用与其调节 SRC-3 的相互关系。方法 采用 MTT 法检测细胞增殖活性,Annexin-V FITC/PI 双标法及 Hoechst 33258 染色法分析细胞凋亡的改变,RT-PCR 法检测鱼藤素对 RPMI-8226 细胞内 SRC-3 基因表达的影响;免疫组化法检测鱼藤素对 RPMI-8226 细胞 SRC-3 蛋白的影响和分布情况。结果 鱼藤素能明显抑制 RPMI-8226 细胞的增殖,其抑制作用呈时间、 剂量依赖性,其作用 24 h 的 IC５０为 (54.55±0.40) nmol/L。此外,鱼藤素具有较强的诱导 RPMI-8226 细胞凋亡的效应,25 nmol/L即能诱导(17.04±0.73)% 的 RPMI-8226 细胞发生凋亡;当药物浓度达到 100 nmol/L 时,总凋亡率达 (63.57±1.36)%。在 RPMI-8226 细胞中 SRC-3 高表达,且主要分布于细胞核,经鱼藤素干预后,SRC-3 的 mRNA 和蛋白表达水平明显下降。结论 鱼藤素能明显抑制 RPMI-8226 细胞的增殖,并诱导其凋亡。而鱼藤素诱导的 SRC-3 表达量的下调可能参与了其诱导凋亡作用。     

冬凌草甲素协同马法兰对人骨髓瘤RPMI-8226细胞增殖和凋亡的影响

目的: 观察冬凌草甲素（oridonin）和马法兰( melphalan)单药及联合用药对人骨髓瘤RPMI-8226细胞生长、凋亡和细胞周期的影响及二者的协同作用,阐明药物联合应用对骨髓瘤细胞的毒性增强作用。方法: 本实验共设4个RPMI-8226细胞处理组,即空白对照组（未加任何药物）、冬凌草甲素（10 μmol/L）组、马法兰（30 μmol/L）组和联合（冬凌草甲素 10 μmol/L + 马法兰 30 μmol/L）组。MTT法检测各用药组作用不同时间后RPMI-8226细胞的增殖抑制率,采用两药相互作用指数（CDI）评价联合用药性质;Annexin-Ⅴ/PI双染检测细胞凋亡率;流式细胞术检测药物作用前后细胞周期分布。结果:与空白对照组比较,冬凌草甲素组、马法兰组和联合组RPMI-8226细胞增殖抑制率明显增加(P<0.01),均具有时间-效应依赖性,联合组各时间点细胞增殖抑制率明显高于单药组(P<0.01)。各时间点CDI值均小于1,即冬凌草甲素可协同提高马法兰的细胞毒作用。冬凌草甲素和马法兰单独处理RPMI-8226细胞36 h,细胞凋亡率分别为15.01%±0.47％ 和20.03%±1.30％,而联合组细胞凋亡率为43.06%±1.96％,与单药组比较显著升高(P<0.01)。流式细胞术DNA含量分析,各药物组RPMI-8226细胞主要阻滞于G0/G1期,S期细胞比例明显减少,除冬凌草甲素组S期细胞比例外,其余药物组各期细胞比例与空白对照组比较差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01),联合组与单药组比较差异亦有统计学意义(P<0.01)。结论: 冬凌草甲素联合马法兰通过阻滞细胞周期和诱导细胞凋亡而抑制骨髓瘤细胞的增殖,其作用具有协同性。     

白藜芦醇对多发性骨髓瘤细胞的体外抗癌作用

目的研究白藜芦醇对多发性骨髓瘤细胞体外抗癌作用,探讨其抗癌作用的分子机制。方法用MTT法检测白藜芦醇对骨髓瘤细胞系RPMI-8226和KM3增殖的影响;Annexin-V/PI双标流式细胞术检测白藜芦醇对RPMI-8226细胞凋亡的影响;PI单标流式细胞术测定白藜芦醇对RPMI-8226、KM3细胞DNA分布的影响;Western-blotting方法检测白藜芦醇对RPMI-8226细胞Bcl-2、Bax、XIAP、c-IAP-1、c-IAP-2蛋白表达的影响。结果白藜芦醇对RPMI-8226和KM3细胞具有明显的增殖抑制作用,其抑制增殖作用呈时效和量效关系。25～100μmol/L白藜芦醇作用24h可诱导RPMI-8226细胞凋亡,100μmol/L作用24h时KM3细胞凋亡率达(26.5±2.7)%。白藜芦醇处理组RPMI-8226及KM3细胞周期均发生变化,细胞周期被阻滞于S期和G0/G1期。白藜芦醇以时间依赖方式下调抗凋亡蛋白Bcl-2、XIAP、c-IAP-1、c-IAP-2的表达,并可上调促凋亡蛋白Bax的表达,但白藜芦醇对各蛋白作用的动力学不同。结论白藜芦醇可通过调控细胞周期进程、诱导细胞凋亡而有效抑制骨髓瘤细胞增殖,其诱导细胞凋亡与调节Bcl-2和IAP家族蛋白的表达有关。     

三氧化二砷诱导人骨髓瘤细胞RPMI8226自噬及凋亡关系的研究

目的通过引入自噬及凋亡抑制剂观察三氧化二砷（As2O3）作用于骨髓瘤细胞RPMI 8226引起自噬和凋亡之间的关系。方法①MTT法计算细胞生长抑制率。②流式细胞仪检测RPMI 8226细胞的自噬率及凋亡率的变化。③通过Western Blot方法检测不同实验组Beclin-1及Caspase-3表达的变化。结果①各浓度As2O3对人骨髓瘤细胞RPMI 8226都显示出明显的生长抑制作用（P〈0.05）,且呈时间-剂量依赖性。②与As2O3单独处理组相比,3-MA预处理组,As2O3诱导RPMI 8226细胞凋亡率呈下降趋势,有统计学意义（P〈0.05）;zVAD-fmk与As2O3联合处理组,凋亡率未见明显变化（P〉0.05）。与As2O3单独处理组相比,3-MA预处理组,As2O3诱导RPMI 8226细胞自噬率下降,有统计学意义（P〈0.05）;zVAD-fmk与As2O3联合处理组As2O3诱导RP-MI8226细胞自噬率亦下降,有统计学意义（P〈0.05）。③与As2O3单独加药组比较,3-MA预处理组As2O3诱导RPMI 8226细胞Procaspase-3蛋白表达明显升高,Beclin-1表达下降;zVAD-fmk预处理组亦表现为Procaspase-3蛋白表达明显升高,Beclin-1下降。结论①不同浓度组As2O3作用24、48、72h对RPMI8226细胞的增殖均有明显的抑制作用（P〈0.05）,且该作用成时间-剂量依赖关系。②As2O3可诱导RPMI 8226细胞发生凋亡及自噬,两者的关系表现为互为前提。抑制任何一方都会导致另一方过程受抑。③As2O3诱导RPMI 8226细胞凋亡过程中可能存在Caspase非依赖型细胞凋亡程序。     

自噬调控对小鼠精原细胞缺氧/复氧损伤的影响研究

目的 研究自噬调控对小鼠精原细胞缺氧/复氧损伤(H/RI)的影响,探讨自噬对小鼠睾丸组织缺血再灌注损伤(IRI)的影响。方法 以小鼠精原细胞系GC1 spg为研究对象构建H/RI模型,雷帕霉素(RAPA)和3-甲基腺嘌呤(3-MA)分别作为自噬激动剂和抑制剂,设置对照组、模型组(H/RI)、自噬激动剂干预组(H/RI+自噬激动剂)、自噬抑制剂干预组(H/RI+自噬抑制剂)。用噻唑蓝(MTT)法检测各组细胞增殖能力,流式细胞术检测各组细胞活性氧(ROS)释放水平和凋亡水平,实时荧光定量PCR(qPCR)检测各组细胞自噬相关基因Beclin1和凋亡相关基因Bcl-2、Bax mRNA的表达水平,Western blot检测各组细胞自噬相关蛋白LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Beclin1、p62和凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、caspase-3的表达水平。结果 与对照组比较,模型组增殖能力、Beclin1和Bcl-2 mRNA表达水平明显下降(P<0.01),p62和Bcl-2蛋白表达水平明显下降(P<0.01),ROS水平、细胞凋亡率、Bax mRNA相对表达水平明显上升(P<...     

苦参碱对多发性骨髓瘤细胞的体外作用机制研究

目的:阐明苦参碱对多发性骨髓瘤(MM)细胞的作用和内在机理。方法:MTT法检测苦参碱对多发性骨髓瘤细胞株RPMI8226和多发性骨髓瘤原代细胞增殖的影响;根据中效原理分析苦参碱联合亚砷酸对RPMI8226细胞株的联合作用;应用DAPI染色检测细胞凋亡。结果:M1TT比色法检测结果显示,苦参碱对RPMI8226细胞及MM原代细胞均有生长抑制作用,与空白对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。体外联合亚砷酸作用RPMI8226细胞抑制率>50%时联合指数(CI)<1。DAPI荧光染色,荧光显微镜下观察苦参碱以终浓度2.0g/L作用于RPMI8226细胞12h后可见明显的凋亡小体出现。结论:苦参碱对RPMI8226细胞和MM原代细胞均有生长抑制作用,体外联合亚砷酸作用MM细胞株RPMI8226细胞,抑制率>50%时呈协同作用。苦参碱通过诱导细胞凋亡抑制RPMI8226细胞的增殖。     

siRNA沉默PTP4A1表达对人舌鳞癌细胞系TCA8113体内外生物学行为的影响

目的 探讨特异性沉默人舌鳞癌细胞系TCA8113中PTP4A1基因的表达,并研究沉默该基因表达后对TCA8113细胞体内外生物学行为的影响.方法 采用siRNA的慢病毒载体siRNA-PTP4A1作为阳性干扰组(KD),空病毒载体作为阴性对照组(NC),未作任何处理的TCA8113细胞作为空白对照组(CON).Real-time PCR和Westem blot检测PTP4A1基因的干扰效果,MTT法检测3组细胞的增殖能力,流式细胞技术分析3组细胞凋亡和细胞周期情况,平板克隆形成实验检测体外克隆形成能力,Western blot分别检测3组细胞抑制凋亡蛋白Bcl-2、促凋亡蛋白Bax的表达情况,3组细胞分别裸鼠成瘤后观察移植瘤的生长情况.结果 siRNA-PTPA1转染TCA8113细胞成功,Real-time PCR和Western blot 检测PTP4A1基因的抑制率达到55％和60％以上(P ＜0.05);MTT结果显示KD组细胞增殖能力小于NC、CON组;细胞凋亡率也明显增加,KD组早期凋亡为(17.48 ±0.70)％,而NC、CON组的早期细胞凋亡率为(7.34±0.70)％和(4.86±0.25)％ (P ＜0.01);KD组细胞周期阻滞在G1/G0和S期(P＜0.05);Western blot结果显示Bcl-2蛋白表达降低(P＜0.01),Bax蛋白表达增高(P＜0.01);KD组体外克隆形成数小于NC、CON组(P＜0.01);KD组裸鼠移植瘤的生长速度缓慢,质量和体积均小于NC、CON组(P＜0.0l).结论 siRNA PTP4A1在体内外均能有效抑制舌鳞癌TCA8113细胞的恶性生物学行为,PTP4A1基因可能与舌鳞癌的发生、发展相关.     

自噬抑制剂硫酸羟氯喹对去势抵抗性前列腺癌化疗敏感性的影响

  目的  探讨自噬抑制剂硫酸羟氯喹（HCQ）干预自噬对去势抵抗性前列腺癌22RV1细胞株体内外化疗药物多西他赛（DOC）敏感性的影响,及其自噬基因Bcelin-1、自噬特异性底物P62、促凋亡基因Bax mRNA的表达变化与自噬蛋白Bcelin-1、自噬特异性标记物LC3B、促凋亡蛋白Bax的表达影响。  方法  体外培养22RV1细胞株,分别设置空白对照组（不加药物）、DOC组、HCQ（20 μmol/L）+DOC组3个组,后两组DOC浓度均为10-6 mol/L、10-7 mol/L、10-8 mol/L,分组培养72 h后CCK-8法检测细胞增殖。于裸鼠皮下一次性注射22RV1细胞悬液,建立22RV1细胞株裸鼠移植瘤,造模成功后随机分为模型组（生理盐水）、DOC组、HCQ+DOC组3个组,每组5只,均为腹腔注射,干预4周。观察移植瘤生长体积的变化。应用实时荧光定量PCR检测22RV1细胞株和移植瘤中自噬和凋亡相关基因（Beclin-1、P62、Bax）以及Western blot检测自噬和凋亡相关蛋白（Beclin-1、LC3B、Bax）的表达水平。  结果  体外实验中,与空白对照组相比,DOC组和HCQ+DOC组细胞的增殖能力减弱(P<0.05);在同一DOC浓度下,与DOC组相比,HCQ+DOC组细胞的增殖被抑制(P<0.05);HCQ+DOC组DOC的半数抑制浓度IC₅₀较DOC组低。体内实验中,与模型组相比,各时点DOC组及HCQ+DOC组的移植瘤同时点周体积增长值均减小;HCQ+DOC组的周体积增长值均小于DOC组(P<0.05),以第4周最为明显。在体内、外实验中,与其余两组比较,HCQ+DOC组Beclin-1、P62、Bax mRNA和Beclin-1、LC3B、Bax蛋白的表达均出现上调(P<0.05)。  结论  HCQ可干预去势抵抗性前列腺癌细胞的自噬,抑制其增殖,增强其对化疗药物的敏感性。     

先天性肾上腺发育不良症基因-1对垂体瘤细胞自噬和增殖的调控作用

目的：探讨先天性肾上腺发育不良症基因-1（DAX -1 ）对垂体瘤（MMQ）细胞自噬和增殖的作用。方法：利用基因芯片技术筛选垂体瘤与正常垂体之间的差异基因群,并通过PubMed数据库基因组分析侵袭性垂体瘤和非侵袭性垂体瘤之间DAX -1 的表达差异;将siRNA转染至MMQ细胞敲低DAX -1 的表达（DAX-1 KD组）,DAX -1 过表达质粒转染至MMQ细胞提高DAX -1 的表达（DAX-1 OE组）,正常对照组（NC组）,采用CCK-8和平板克隆实验检测DAX -1 对MMQ细胞增殖的影响;通过实时定量聚合酶链反应（RT-qPCR）检测自噬相关基因ATG5 、ATG7 和ATG12 的表达;通过蛋白质印迹（Western blot）法和免疫荧光法检测DAX -1 对自噬标记蛋白LC3的表 达影响,通过裸鼠移植瘤实验观察敲减DAX -1 对MMQ细胞生长和自噬的影响。结果：基因芯片结果提示,和正常垂体组比,垂体肿瘤中DAX -1 基因表达显著下调,并且DAX -1 在侵袭性垂体瘤中比非侵袭性垂体瘤表达低（P ＜0.05）;与NC组MMQ细胞比,DAX-1 KD组MMQ细胞增殖水平升高,而DAX-1 OE组MMQ细胞增殖受抑且 卡麦角林和溴隐亭的药物敏感性增高（均P ＜0.05）;与NC组MMQ细胞比,DAX-1 KD组MMQ细胞自噬水平降低（P ＜0.05）;裸鼠移植瘤实验显示,与NC组MMQ细胞移植瘤比,DAX-1 KD组移植肿瘤生长速度更快（P ＜0.05）。结论：DAX -1在垂体瘤中表达降低,且DAX -1表达降低后促进垂体瘤发展,DAX -1可能是垂体瘤治疗的潜在靶点。     

Gas6/MerTK通路诱导线粒体自噬在肺癌进展的机制研究

目的:通过下调Gas6/MerTK信号通路探究线粒体自噬在肺癌进展中的可能机制。方法:培养Calu-1与A-427细胞系,分为(1)对照组、Gas6干预(下调Gas6)组,(2)对照组、雷帕霉素(自噬诱导剂,RAPA)组,Western blotting检侧Gas6、MerTK、LC3Ⅱ、Beclin1蛋白表达水平,透射电镜观察细胞自噬小体,平板克隆检侧Calu-1与A-427细胞克隆能力,CCK-8检测Calu-1与A-427细胞活力,细胞划痕实验检测Calu-1与A-427细胞的迁移能力,免疫荧光检测Calu-1与A-427细胞中LC3表达水平。结果:与对照组相比,Gas6干预组Calu-1细胞与A-427细胞的Gas6、MerTK蛋白水平显著降低(P<0.05),LC3Ⅱ、Beclin1蛋白水平显著增加(P<0.05),且Calu-1细胞与A-427细胞中自噬小体形成,大量自噬空泡聚集,细胞克隆能力显著降低(P<0.05)、细胞活力显著降低(P<0.05)、细胞迁移距离显著减少(P<0.05)。与对照组相比,RAPA组Calu-1细胞与A-427细胞...     

miR-18a对结直肠癌SW116细胞辐射敏感性的影响

目的:探讨miR-18a与结直肠癌SW116细胞辐射敏感性之间的关系,阐明miR-18a影响细胞凋亡和自噬的可能机制。方法:人结直肠癌SW116细胞分为miR-18a NC组、miR-18a mimic组、miR-18a NC+4Gy组和miR-18a mimic+4Gy组。qRT-PCR法检测照射前后SW116细胞中miR-18a的表达;集落形成实验观察miR-18a对SW116细胞辐射敏感性的影响;GFPLC3形态学方法检测SW116细胞自噬率;流式细胞术检测SW116细胞凋亡率;采用生物信息学方法预测miR-18a的靶基因,以荧光素酶报告基因验证miR-18a与靶基因3'UTR结合;Western blotting法检测SW116细胞中共济失调-毛细血管扩张突变基因(ATM)蛋白表达。结果:与照射前比较,照射后SW116细胞中miR-18a表达水平明显降低(P<0.05)。集落形成实验,与miR-18a NC组比较,miR-18a mimic组SW116细胞辐射敏感性增强(P<0.05),细胞凋亡率和自噬率明显增加(P<0.05)。与miR-18a NC+4Gy组比较,miR-18a mimic+4Gy组SW116细胞中ATM蛋白表达减少。结论:miR-18a的靶基因为ATM;miR-18a mimic可促进辐射诱导的细胞凋亡和自噬,且能增加结直肠癌SW116细胞辐射敏感性。     

MitoQ通过NIX介导的线粒体自噬对肺腺癌A549细胞迁移及凋亡的影响

目的 探讨Mitoquinone(MitoQ)通过NIX介导的线粒体自噬对人肺腺癌A549细胞迁移及凋亡的影响.方法 不同浓度的MitoQ诱导A549细胞12 h,利用CCK-8检测细胞存活率,细胞划痕实验检测细胞迁移能力,Western blot检测NIX、p62及Bax等线粒体自噬及凋亡相关蛋白表达.结果 与对照组比较,各MitoQ组细胞发生明显的增殖及细胞迁移抑制.并且随着凋亡的发生,自噬促进相关蛋白NIX表达上调,自噬抑制相关蛋白p62表达下调,凋亡促进相关蛋白BaX表达上调,并且伴随着MitoQ浓度的升高差异有统计学意义(P＜0.05).与对照组相比,MitoQ组细胞表现出迁移及增殖能力下降,线粒体自噬及凋亡水平升高.结论 MitoQ能抑制A549细胞的迁移及增殖,促进A549细胞凋亡,其机制可能与MitoQ调节线粒体自噬通路上的关键分子诱导A549细胞自噬有关,该自噬的关键分子可能为NIX蛋白.     

抑制Aurora激酶B的表达可促进骨肉瘤143B细胞凋亡

目的 探讨抑制Aurora激酶B（AURKB）诱导骨肉瘤143B细胞自噬对凋亡的影响及其潜在的分子机制。方法 构建慢病毒载体（干扰慢病毒Lv/shAURKB和相应的空载慢病毒Lv/shScrambled）,分别感染人源骨肉瘤细胞系143B细胞,并采用氯喹（CQ）进行干预24 h,分别作为：AURKB慢病毒干扰组（plv/shAURKB组）;阴性对照组（plv/NC组）;plv/shAURKB+CQ组;空载慢病毒+氯喹处理组（plv/NC+CQ组）。RT-qPCR检测Lv/shAURKB慢病毒载体对AURKB mRNA的干扰效率。Western blot检测AURKB、P62、LC3、Cleaved-Caspase3、Bcl2、P-ULK1（Ser555）等蛋白表达水平。采用透射电镜和LC3双标荧光法示踪143B细胞内自噬小体并检测自噬水平,流式细胞术和Tunel实验检测细胞凋亡。免疫共沉淀检测AURKB蛋白与ULK1（UNC-51样激酶1）蛋白间的相互作用关系。结果 plv/shAURKB组细胞中AURKB mRNA及蛋白表达水平均低于plv/NC组,差异有统计学意义（P<0.05）;plv/shAURKB组中自噬相关蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ的比率和自噬小体数量高于plv/NC组,而P62的表达低于plv/NC组,差异均有统计学意义（P<0.05）;plv/shAURKB组细胞中促凋亡蛋白Cleaved-caspase3显著高于plv/NC组（P<0.05）,而抑制凋亡蛋白Bcl2的表达水平显著低于plv/NC组（P<0.05）;与plv/shAURKB组相比plv/shAURKB+CQ组中凋亡相关蛋白 Cleaved-caspase3和Bcl2的表达得到明显回复（P<0.05）。Tunel实验和流式细胞术结果显示,plv/shAURKB组细胞凋亡率显著高于plv/NC组（P<0.05）,plv/shAURKB+CQ组细胞凋亡率与plv /shAURKB组相比得到明显的回复（P<0.05）。plv/shAURKB组细胞中自噬启动蛋白ULK1Ser555磷酸化水平显著高于plv/NC组（P<0.05）。免疫共沉淀检测显示：免疫沉淀AURKB的同时ULK1也发生了沉淀。结论 沉默AURKB能够通过激活ULK1Ser555磷酸化诱导细胞自噬促进骨肉瘤143B细胞凋亡。     

miR-21对宫颈癌HeLa细胞辐射敏感性的影响

目的：探讨miR-21与宫颈癌HeLa细胞辐射敏感性之间的关系,阐明miR-21对细胞凋亡和自噬改变的可能作用机制。方法：人宫颈癌HeLa细胞分为假照组和4 Gy照射组,分别转染miR-21 NC（阴性对照）、miR-21 mimics、miR-21 inhibitor NC和miR-21 inhibitor。实时荧光定量PCR检测照射前和照射后miR-21的表达水平;集落形成实验观察miR-21对HeLa细胞辐射敏感性的影响;流式细胞术检测细胞凋亡和自噬细胞百分率;采用生物信息学方法预测miR-21的靶基因;荧光素酶报告基因分析验证miR-21与靶基因3′UTR的结合;Western blotting法检测相关蛋白beclin1表达水平。结果：与假照组比较,4 Gy照射组miR-21表达水平明显增加(P<0.05）;集落形成实验,与miR-21 NC组比较,miR-21 mimics组HeLa细胞辐射敏感性无明显变化(P>0.05）;与miR-21 inhihitor NC组比较,miR-21 inhibitor 组HeLa细胞辐射敏感性无明显变化(P>0.05）;与miR-21 NC+4 Gy组比较,miR-21 mimics+4 Gy组HeLa细胞凋亡率明显增加(P<0.05）;与miR-21 inhibitor NC组比较,miR-21 inhibitor组HeLa细胞凋亡率明显减少（P<0.05）。与miR-21 NC组比较,miR-21 mimics组自噬率升高（P<0.05）。与miR-21 NC+4 Gy组比较,miR-21 mimics+4 Gy组自噬率升高（P<0.05）;与miR-21 NC+4 Gy组比较,miR-21 mimics+4 Gy组beclin1蛋白表达水平增加（P<0.05）。
结论：发现了miR-21新的靶基因beclin1。过表达miR-21促进辐射诱导的凋亡和自噬,但对于宫颈癌HeLa细胞辐射敏感性无直接影响。
［关键词］ miR-21;宫颈肿瘤;HeLa细胞;辐射敏感性;细胞凋亡;自噬     

沉默BECN1对人三阴性乳腺癌细胞生物学行为的影响

目的:探讨沉默人三阴性乳腺癌(TNBC)细胞MDA-MB-231中beclin 1(BECN1)基因后其生物学特性的变化.方法:设计3组沉默BECN1基因的慢病毒(干扰组1、干扰组2和干扰组3)以及阴性对照慢病毒(NC组)分别转染MDA-MB-231维胞,空白组不做处理.实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测BECN1 mRNA表达,蛋白免疫印迹(WB)实验检测各组细胞BECN1蛋白与自噬标志蛋白LC3B的表达,筛选出抑制率最高的一组用于后续实验.细胞计数试剂8(CCK-8)检测各组细胞的增殖情况、Transwell实验检测各组细胞的迁移及侵袭能力、流式细胞术检测各组细胞凋亡率与周期分布情况.结果:慢病毒感染细胞后,干扰组2中BECN1的信使核糖核酸(mRNA)与蛋白的表达量最低(P＜0.05),WB结果显示干扰组2的LC3B蛋白中LC3-Ⅱ/LC31-Ⅰ的比值明显低于空白组和NC组(均P＜0.05),选取干扰组2用于后续实验.沉默BECN1基因后细胞的增殖、迁移和侵袭能力均明显降低(均P＜0.05);流式细胞术结果显示干扰组2、NC组与空白组的凋亡率没有明显差异;相比于空白组与NC组,干扰组2处于G0/G1期的比例升高(P＜0.05).结论:BECN1基因沉默可以降低细胞的自噬水平,抑制TNBC MDA-MB-231细胞增殖、迁移与侵袭能力.     

沉默BECN1对人三阴性乳腺癌细胞生物学行为的影响

目的:探讨沉默人三阴性乳腺癌(TNBC)细胞MDA-MB-231中beclin 1(BECN1)基因后其生物学特性的变化.方法:设计3组沉默BECN1基因的慢病毒(干扰组1、干扰组2和干扰组3)以及阴性对照慢病毒(NC组)分别转染MDA-MB-231维胞,空白组不做处理.实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测BECN1 mRNA表达,蛋白免疫印迹(WB)实验检测各组细胞BECN1蛋白与自噬标志蛋白LC3B的表达,筛选出抑制率最高的一组用于后续实验.细胞计数试剂8(CCK-8)检测各组细胞的增殖情况、Transwell实验检测各组细胞的迁移及侵袭能力、流式细胞术检测各组细胞凋亡率与周期分布情况.结果:慢病毒感染细胞后,干扰组2中BECN1的信使核糖核酸(mRNA)与蛋白的表达量最低(P＜0.05),WB结果显示干扰组2的LC3B蛋白中LC3-Ⅱ/LC31-Ⅰ的比值明显低于空白组和NC组(均P＜0.05),选取干扰组2用于后续实验.沉默BECN1基因后细胞的增殖、迁移和侵袭能力均明显降低(均P＜0.05);流式细胞术结果显示干扰组2、NC组与空白组的凋亡率没有明显差异;相比于空白组与NC组,干扰组2处于G0/G1期的比例升高(P＜0.05).结论:BECN1基因沉默可以降低细胞的自噬水平,抑制TNBC MDA-MB-231细胞增殖、迁移与侵袭能力.     

扶正抗癌汤含药血清对人卵巢癌HO-8910PM细胞增殖、凋亡与周期进程的影响

目的 探讨扶正抗癌汤(Fuzheng kangai decoction, FZKAD)含药血清对人卵巢癌HO-8910PM细胞增殖、凋亡与周期进程的影响。方法 SD大鼠40只随机分为对照组及FZKAD低(4.725 g/kg)、中(9.45 g/kg)、高(18.9 g/kg)剂量组,灌胃给药7 d后制备含药血清,用于HO-8910PM细胞的培养。分别采用噻唑蓝(MTT)实验检测细胞增殖能力,平板克隆形成实验检测克隆形成能力,膜联蛋白V(Annexin V)-异硫氰酸荧光素/碘化丙啶(FITC/PI)双染法流式细胞术检测细胞凋亡,PI单染法流式细胞术检测细胞周期进程,Western blot法检测蛋白表达水平。结果 与对照组比较,除低、中剂量组处理24 h后的细胞存活率无显著性降低外(P>0.05),其余各组处理24、48及72 h后的细胞存活率均显著性降低(P<0.05或P<0.01),且各剂量组细胞克隆形成能力也显著降低(P<0.01);与对照组比较,低、中、高剂量组的细胞凋亡率及P53、Bcl-2相关X蛋白(Bax)表达水平增加(P<0.05或P&l...