交链孢酚诱发人胚食管上皮鳞癌的研究

互隔交链孢霉是食管癌高发区林县粮食中的优势污染菌,我们曾证明该菌产生的毒素之一交链孢酚(Alternariol,AOH)能引起大鼠肝细胞的DNA单链断裂,激活人胚食管上皮的H-ras和myc癌基因,与人食管上皮DNA的各种碱基呈共价结合。为研究AOH能否引起人食管上皮癌,将水囊引产的胎儿食管在体外培养一周后,用AOH处理,再培养2周,     

人胃癌裸鼠胃原位移植转移模型的建立

目的 :建立人胃癌裸鼠原位移植转移模型 .方法 :用人胃癌细胞悬殊液接种于裸鼠皮下 ,形成稳定传代的皮下移植瘤 ,将皮下移植瘤组织再接种于裸鼠胃浆膜下 ,称为间接胃原位移植模型 ,并与直接用细胞悬液接种于裸鼠胃浆膜下、皮下、腹腔、尾静脉的移植瘤模型比较 ,观察移植肿瘤的生长状况、移植成功率和自发转移的发生率及组织学变化及细胞动力学改变等生物学特性 .结果 :肿瘤组织块保留了人胃腺癌的组织学特片 ,尾静脉注射与直接原位接种成瘤率均为6 0 % ,间接原位接种模型移植成瘤率为 80 % ,皮下与腹腔接种成瘤率均为 10 0 % .间接胃原位移植模型肝脏转移率为6 0 % ,直接胃原位移植模型肝脏转移率为 33.3% (P <0 .0 5 )尾静脉移植瘤模型仅见肝脏转移 ,实验过程中裸鼠衰竭处死后的肺脏经连续组织切片未见瘤细胞侵袭 .移植瘤细胞具有分泌CEA的功能 ,细胞动力学检测显示以五倍体细胞为主 .结论 :人胃癌裸鼠皮下 -胃原位移植瘤模型的生物学行学与人胃癌自然生长和转移过程相似 ,为研究人胃癌转移机制提供了理想的模型 .     

简讯

最近,我们和中国医学科学院肿瘤研究所陆士新教授协作,用林县分离的优势污染霉菌互隔交链孢霉代谢物交链孢酚单甲醚(AME)和交链孢酚(AOH)和人胎儿食管上皮作短期培养后,观察了二者对人食管上皮癌基因的作用。两轮转染NIH/3T 3细胞已获成功,     

耐紫杉醇肺癌细胞BNX动物模型的建立

目的建立一种耐药性稳定的人肺癌BNX小鼠皮下移植瘤模型,为研究体内肿瘤耐药机制和逆转药物的筛选奠定实验基础。方法将体外培养的对数生长期的肺癌耐药细胞株A549-Taxol,接种在免疫缺陷小鼠的皮下,形成肿瘤,采用肿瘤组织块或肿瘤组织原代培养的细胞,分别于动物皮下接种致瘤;体内外交叉进行致瘤,提高耐药细胞株A549-Taxol的致瘤率和缩短致瘤时间。通过免疫组化鉴定该耐药细胞的特性。用MTT法检测细胞的耐药指数。结果耐药细胞接种于SCID小鼠4个月后在皮下形成肿瘤灶。用该肿瘤组织块或细胞悬液移植于SCID小鼠,通过反复3次后,细胞生长速度变快,2个月后皮下即可形成肿瘤。将该细胞移植于BNX小鼠,以同样的方法将瘤组织体内外交叉进行致瘤,最终BNX小鼠种植成功率达到80%。致瘤时间为3周。耐药细胞和组织块P-gp170、GST-π和MMP-7均高表达。A549-Taxol细胞的紫杉醇半数抑制浓度(IC50)是亲代A549细胞的520倍。结论初步建立了人肺腺癌耐药细胞(A549-Taxol)的动物模型,为肺癌临床个体化治疗及耐药逆转研究等提供了良好的实验动物平台。     

经交链孢酚处理胎儿食管上皮组织中EGFr,Rb基因的扩增

目的：探讨互隔交链孢霉诱导食管癌的发生机制。方法：用交链孢酚（ＡＯＨ）体外处理不同时间胎儿食管上皮组织,提取组织的ＤＮＡ,从１０例食管癌组织及１０例癌旁组织中分别提取ＤＮＡ,设正常胎儿食管上皮ＤＮＡ为对照。ＥｃｏＲＩ酶切,Ｓｏｕｔｈｅｒｎ转移,与ＥＧＦｒ癌基因,Ｒｂ抗癌基因探针杂交。结果：正常对照组中ＥＧＦｒ、Ｒｂ无扩主丢失;ＡＯＨ诱导２４ｈ１周和３周的胎儿食管上皮未抗癌基因Ｒｂ的丢失,食管癌组织     

交链孢酚单甲醚在大鼠小鼠体内的分布

对食管癌高发区粮食中分离的互隔交链孢霉的毒素交链孢酚单甲醚(AME)在大鼠、小鼠体内的分布进行研究。给动物腹腔内注射氚标记的交链孢酚单甲醚(~3H-AME),然后在不同时间测各脏器的放射性。结果表明:在所测9个脏器中,2h肝脏含量最高,食管下段在大小鼠分别居第四和第三。但大小鼠分别在72、24h则以食管下段最高,说明AME及其代谢物在此清除较慢,即对其有较高的亲和力。     

互隔交链孢霉诱发大鼠前胃和食管乳头状瘤的实验研究

我们从食管癌高发区林县粮食中分离到互隔交链孢霉[Alternaria alternata(Fr) Keissler],以此霉菌发霉食物,用Wistar大鼠进行诱癌实验。实验组动物喂饲该菌发霉的食物,时间62～363天,诱发了大鼠前胃上皮乳头状增生(15/39),前胃乳头状瘤(10/39)和前胃乳头状癌(1/39)。39例中还发现食管上皮乳头状增生和乳头状瘤各2例。对照组动物食管和前胃未发现上述病变。结果表明:该互隔交链孢霉发霉的食物对大鼠前胃和食管上皮有致瘤作用,对前胃可能有较弱的致癌作用。互隔交链孢霉霉食的70％乙醇提取物灌喂小鼠,LD_(50)为115.95克霉食/公斤体重。70％乙醇提取后的乙醚提取物,LD_(50)为273.66克/公斤体重。毒性物质具有耐热性。     

互隔交链孢霉毒素诱发人胎食管上皮组织c-Ha-ras点突变的研究

体外培养的人胎儿食管上皮组织经互隔交链孢霉毒素AME或AOH短时间(4h)处理后,提取该组织高分子量DNA;同时提取未经处理的人胎儿食管上皮组织DNA(空白对照)以及食管癌组织和癌旁组织DNA。提取的高分子量DNA作为模板进行PCR反应,扩增含c-Ha-ras癌基因第12位密码子的104bp片段。该片段中第12位密码子处存在限制性内切酶     

开腹及超声引导下深植入法和浅植入法建立兔肝VX2肿瘤模型的比较

目的 比较开腹和超声引导下深植入法和浅植入法建立兔肝VX2肿瘤模型的成功率和异位种植率.方法 选取80只新西兰白兔,按植入组织块或其悬液及穿刺深、浅分为4组,超声引导下将VX2肿瘤组织块或其悬液穿刺接种于兔左肝内(浅≤20mm,深>20mm),接种后第1、2、3周行超声检查.第3周检查后处死实验兔,行原位、异位肿瘤肉眼及病理检查.结果 开腹及超声引导下运用深植入法及浅植入法造模,成模率均为100%.开腹组及超声组织块组肿瘤体积明显大于组织块悬液组.组织块深植入法,开腹组及超声组无异位种植.组织块浅植入法,超声组1例腹腔种植,开腹组未见腹腔种植.组织块悬液深植入法,开腹组无腹腔种植,超声组2例腹腔种植.组织块悬液浅植入法,开腹组2例腹腔种植;超声组5例腹腔种植,其中1例同时腹腔和腹壁种植.结论 超声引导下穿刺组织块及组织块悬液接种制作兔肝VX2瘤模型方法 简单,创伤小,成功率高.组织块穿刺植入法优于组织块悬液穿刺植入法,深植入法优于浅植入法.     

体内连续筛选法建立自发性肺转移人肝癌细胞系

目的　从人肝癌裸鼠肺转移灶中建立人肝癌细胞系 ,为探索肝癌转移的分子机制提供模型。方法　用高转移性人肝癌克隆细胞株MHCC97 H接种裸鼠 ,进行 3次肺转移筛选 ,取肺转移瘤建成皮下接种后自发性肺转移的细胞系。检测下列指标 :形态学、生长曲线、克隆形成率、运动速度、核型分析、流式细胞分析、免疫细胞化学检查、HBVDNA、成瘤性和转移性。结果　从裸鼠肺转移灶中培养出人肝癌细胞系HCCLM3,为多边形上皮性癌细胞 ,亚三倍体核型 ,染色体众数范围 5 5～ 5 8条 ;细胞倍增时间 34 9h ;克隆形成率 32 4 %± 3 2 % ;细胞运动速度 (2 0± 2 ) μm/h ;免疫细胞化学显示甲胎蛋白、白蛋白、细胞角质蛋白 8、P16阳性 ,P5 3、nm2 3、HBsAg阴性 ;细胞基因组中有HBVDNA整合。裸鼠皮下接种成瘤率 10 0 % ,5周后自发性肺转移率为 10 0 % ,肺转移灶中位数 12 1个 /裸鼠。瘤组织原位接种于裸鼠肝脏 ,5周后腹壁转移 10 0 %、腹腔内转移 80 %、肝内转移 10 0 %、膈肌转移 70 %、肺转移10 0 % ,肺转移灶中位数 2 6 8个 /裸鼠。结论　建成一个皮下和原位接种均出现自发性高转移的人肝癌细胞系 ,为研究肝癌转移提供了新的实验模型     

交链孢酚和交链孢酚单甲醚诱发人淋巴细胞DNA损伤的研究

用从食管癌高发区林县严重污染粮食的链格孢(Alternaria alternata)培养物中分离纯化的交链孢酚(AOH)和交链孢酚单甲醚(AME)诱发正常人外周血淋巴细胞程序外DNA合成(UDS)。结果表明:AOH及AME均可不同程度地诱发UDS,并发现AOH比AME作用更强。结果提示,AOH及AME可引起人外周血淋巴细胞DNA损伤,其提示与食管癌发生可能有关。     

Etiological role of Alternaria alternata in human esophageal cancer.

In this paper, the mutagenicity and carcinogenicity of alternariol monomethyl ether (AME), alternariol (AOH), and their relevance to the etiology of human esophageal cancer were studied. These mycotoxins were produced by Alternaria alternata which was the main contaminating fungi isolated from the grain in Linxian County, an area with high incidence of esophageal cancer. This study demonstrated that: 1. AME and AOH might cause cell mutagenicity and transformation; 2. AME and AOH could combine with the DNA isolated from human fetal esophageal epithelium, activate the oncogens, c-H-ras and c-mys in it, and promote proliferation of human fetal esophageal epithelium in vitro; 3. squamous cell carcinoma of the fetal esophagus could be induced by AOH. According to the results of the studies of AME and AOH mentioned above, we consider that Alternaria alternata plays an important role in the etiology of human esophageal cancer.

     

互隔交链孢霉毒素AME和AOH合成物的诱变性

对互隔交链孢霉毒素——交链孢酚单甲醚(Alternariol monomethyl ether,AME)和交链孢酚(Alternariol.AOH)的合成物进行了细菌回复突变试验.检测其诱变性。结果表明:AME和AOH提取物和合成物(不加S_9)对鼠伤寒沙门氏菌TA102菌株和大肠菌ND-160菌株.均显示致突变效应.而后者对AME和AOH更为敏感。用相同剂量.AOH对大肠杆菌ND—160菌株诱变比值(MR)比AME高2～7倍,表明AOH的诱变性更强。合成物与提取物相比,合成物的诱变作用较强。     

交链孢酚和交链孢酚单甲醚对大鼠不同器官细胞DNA损伤的器官亲和性研究

用污染食管癌高发现场粮食的优势菌互隔交链孢霉(Alternaria alternata)的主要毒素交链孢酚(AOH)和交链孢酚单甲醚(AME),诱发大鼠不同器官细胞的程序外DNA合成(UDS)。结果表明,AOH及AME在最高有效浓度时,诱发肝细胞掺入指数分别为0.45及0.55;诱发食管上皮细胞掺入指数分别为2.32和1.75;诱发肺细胞掺入指数分别为1.7和1.05;该结果提示,AOH及AME对食管上皮细胞具有显著的器官亲和性,大鼠食管可能为AOH及AME的重要靶器官之一。     

交链孢酚对人胎儿食管和胃上皮脂质过氧化的影响

采用硫队巴比妥酸试验测定丙二醛含量反映脂质过氧化程度。用林县粮食中分离的互隔交链孢霉的代谢物交链孢酚(AOH,体外攻击人胎儿食管及胃上皮后观察对相应组织脂质过氧化的影响,AOH可使4人胎儿食管及胃上皮丙二醛含量明显升高(P?0.01),其程度与AOH剂量有关,并随时间延长,其程度增高,4～5h达高峰、食管对AOH反应较胃强烈,提示AOH可引发食管及胃上皮组织的脂质过氧化,并有一定的器官选择性。据结果可推测AOH可能是林县地区人食管癌病因之一。     

交链孢酚单甲醚对人胚食管上皮的作用

用人胚食管上皮体外培养,经交链孢酚单甲醚(Alternariol monomethyl ether,AME)处理后,食管上皮底层细胞比对照组的层次明显增多,细胞排列紧密紊乱,细胞核浆比增加,核不规则,大小不等.浓染,可见核分裂相,且有乳头状向内增生。该变化与甲基硝基亚硝基胍(MNNG)和甲基苯基亚硝胺(MPNA)所诱发的人胚食管上皮癌前病变相类似。结果提示,AME与人的食管癌发生很可能有关。     

互隔交链孢霉诱发姐妹染色单体互换及染色体畸变的研究

本文介绍了10株互隔交链孢霉提取物诱发人淋巴细胞姐妹染色单体互换(SCE)及染色体畸变。结果发现,当用不同浓度提取物加入培养基时,有8株所诱发的SCE增高,与对照组比较差异极为显著(P<0.01)、在8株阳性株中,有6株在加入低量提取物时即诱发SCE频率增高显示统计学差异、同时,在阳性株中有两株提取物所诱发的染色体畸变频率增高,与对照组比较亦有极显著性差异(P<0.01)。由此可见,多数互隔交链孢霉菌株(8/10)所产生的代谢产物或毒素,都含有致突变物,不同菌株具有不同强度的致突作用。另外,对应用人淋巴细胞的SCE技术检测致突变物的优点进行了讨论。     

互隔交链孢霉毒素引起大鼠肝细胞DNA单链断裂的作用

应用碱性洗脱荧光分析法对互隔交链孢霉产生的两种主要毒素——交链孢酚单甲醚(Alternariol Monomethyl Ether.AME)和交链孢酚(Alternariol.AOH)引起大鼠肝细胞DNA单链断裂效应进行了研究。实验结果表明:二者都能引起大鼠肝细胞DNA单链断裂,并有明显的剂量效应关系.DNA在滤膜上的存留分数明显低于溶剂对照组.具有统计学意义(P<0.01)。结果提示AME和AOH有致突变作用,二者可能是林县食管癌的病因之一。     

互隔交链孢酚激活EC9706细胞DNA聚合酶β表达的信号通路初探

目的：研究互隔交链孢酚（AOH）对食管癌EC9706细胞株中DNA聚合酶β（DNA pol β）表达的影响．方法：以PKA激活剂Forskolin（40μmol／L）为阳性对照,采用免疫细胞化学,Western Blot方法检测20μmol／LAOH作用EC9706细胞16h后pol β蛋白水平的表达．以PKA特异性抑制剂H89（10μmol/L）预处理EC9706细胞1h,再以20μmol／LAOH作用细胞16h,观察H89阻断AOH激活pol β蛋白表达的作用．结果：免疫细胞化学结果显示,与溶剂对照组和I-189处理组相比较,AOH处理组,Forskolin处理组的细胞中pol β表达增高．Western Blot结果表明,AOH处理组,Forskolin处理组pol β表达分别是溶剂对照组的2．05和3．12倍（P〈0．05）,而H89组仅为对照组的1．32倍．结论：AOH可以激活食管癌EC9706细胞中pol β基因表达,这可能是通过PKA信号转导通路介导的．     

应用DSI试验观察互隔交链孢霉提取物的诱变性

应用DSI试验对食管癌高发区河南林县粮食中分离的互隔交链孢霉的提取物进行诱变性研究。在五个数量级浓度中,互隔交链孢霉提取物均能明显地抑制DNA的合成。其抑制率为51.2%～62.8%,有明显的剂量相关性。与对照组相比有极显著差异(P<0.01)。追踪观察表明,经10~-3mg/ml浓度的提取物作用后,靶细胞DNA合成速度在与提取物脱离接触后的0.5h内呈进行性下降,以后才逐渐回升,在0.5h处形成一个DNA合成的谷值。故可认为,互隔交链孢霉提取物中含有损伤性DNA合成抑制剂,但损伤修复较快。结果表明,互隔交链孢霉提取物中含有诱变性物质。