IGF-ⅠR、IGF-ⅡR反义基因对SMMC-7721肝癌细胞生物学行为的影响

目的 研究胰岛素样生长因子I型及Ⅱ型受体（IGF－ⅠR、IGF-ⅡR）反义基因对SMMC－7721肝癌细胞生物学行为的影响。方法 应用反义技术，在已转染了IGF－Ⅰ R反义基因的肝癌SMMC－7721（7721－IGF－I R－AS）细胞基础上，继续利用IGF-ⅡR反义基因真核表达系统，通过DOTAP脂质体介导的转染技术，将IGF－ⅡR反义基因导入该细胞，经G418及潮霉素双重筛选获得稳定表达IGF－ⅠR、IGF-ⅡR反义基因的7721－IGF－R－AS细胞。采用电镜、电镜观察形态学变化，双层软琼脂克隆形成实验、MTT细胞生长曲线；在软琼脂培养基中的生长能力降低（P＜0．01）；在裸鼠体内的致瘤能力也降低（P＜0．05）；但细胞生长曲线与对照组比较则无明显差异。结论 IGF－ⅠR、IGF-ⅡR反义基因对SMMC－7721肝癌细胞的恶性行为有明显抑制作用。利用反义技术干预肝癌细胞生长因子受体基因表达可能给肝癌的基因治疗提供新的途径。     

人DNA MTase反义基因转染对诱导肝癌SMMC-7721细胞凋亡的影响

目的；观察人DNA MTase反义基因转染对肝癌细胞系SMMC－7721凋亡的影响。方法：采用脂质体法将构建的包含正，反义DNA MTase基因片段的真核表达载体转染入肝癌细胞系SMMC－7721；采用MTT法绘制生长曲线；流式细胞法和原位末端标记法检测细胞凋亡改变。结果：PCR法扩增外源性NeoR基因证实用脂质体法成功将重组载体转染入细胞；生长曲线显示转染反义DNA MTase基因片段的SMMC－7721细胞增殖速度减慢；流式细胞法测得其凋亡率由3．1％增加到13．5％，末端标记法也显示其调亡指数增加。结论：人DNA MTase反义基因转染可诱导肝癌细胞系SMMC－7721凋亡。凋亡基因功能被恢复可能主要原因之一。     

人DNA MTase反义基因转染诱导E-Cadherin基因启动子区域去甲基化

目的：观察人DNA MTase反义基因转染对肝癌细胞系SMMC－7721E－Cadherin基因启动子区域甲基化状态的影响。方法：采用脂质体法将已构建的包含正，反义DNA MTase基因片段的真核表达载体转染入肝癌细胞系SMMC－7721；用甲基化特异的PCR法检测E－Cadherin基因启动子区域甲基化状态的改变，结果：PCR法扩增外源性NeoR基因证实用脂体法成功将重组载体转染入细胞，甲基化特异的PCR法检测显示转染反义DNA MTase基因片段的SMMC－7721细胞中的E－Cadherin基因启动子区域呈现去甲基化状态。结论：人DNA MTase反义基因片段可诱导E－Cadherin基因启动子区域去甲基化，实验结果有助于进一步了解DNA MTase在肝癌发展中的作用。     

人DNA MTase反义基因转染对肝癌细胞DNA MTase基因mRNA表达的影响

目的：观察人DNA MTase反义基因转染对肝癌细胞系SMMC－7721内源性DNA MTase基因mRNA的表达的影响。方法：将将建的包含正、反义DNA MTase基因片段的真核表达载体用脂质体法将其转染入肝癌细胞系SMMC－7721；采用RT－PCR法观察DNA MTase基因mRNA表达变化。结果：PCR法扩增外源性NeoR基因证实证用脂质体法成功将重组载体转染入细胞：RT－PCR法检测DNA MTase基因mRNA表达，显示转染反义DNA MTase基因片段的SMMC－7721细胞中DNA MTase基因mRNA表达下调。结论：人DNA MTase基因反义基因转染是一种有效，可靠的抑制肝癌细胞系SMMC－7721DNA MTase基因表达的方法。它为更多了解DNA MTase在肝癌发生的作用提供了帮助。     

人胰岛素样生长因子Ⅱ型受体反义基因对肝癌细胞恶性表型的影响

目的 研究人胰岛素样生长因子Ⅱ型受体（IGF-ⅡR）反义基因对SMMC-7721人肝癌细胞恶性表型的逆转作用。方法 构建IGF-ⅡR正、反义基因真核表达质粒,用磷酸钙-DNA共沉淀的方法,导入SMMC-7721人肝癌细胞株,经G418培养基筛选稳定的抗性细胞。采用Northern杂交检测对转染细胞内源性IGF-ⅡR基因转录的抑制,观察转染细胞克隆形成率,细胞生长曲线,软琼脂生长及裸鼠致瘤能力的变化。结果 IGF-ⅡR反义基因转染肝癌细胞的内源性IGF-ⅡR基因转录受到有效抑制,转染细胞克隆形成率明显降低,并失去在软琼脂上生长的能力,裸鼠致瘤性明显降低,但细胞生长曲线无明显变化。结论 IGF-ⅡR反义基因可以有效阻断IGF-Ⅱ至IGF-ⅡR的自泌/旁泌生长刺激信号环路,一定程度地抑制肝癌细胞的恶性表型。     

胰岛素样生长因子Ⅰ型受体基因对肝细胞癌生物学行为的影响

目的　研究胰岛素样生长因子Ⅰ型受体 (insulin likegrowthfactorⅠreceptor,IGF ⅠR)对肝细胞癌 (hepatocellularcarcinoma ,HCC)生物学行为的影响。方法　应用免疫组化SP法检测肝细胞癌、癌旁和正常肝组织IGF ⅠR的表达。构建IGF ⅠR正、反义基因真核表达载体 ,经脂质体介导转入SMMC 772 1肝癌细胞株 ,观测IGF ⅠR正、反义基因对肝癌细胞生物学行为的影响。结果　 (1)在肝癌组织中IGF ⅠR呈过度表达 (90 .3% ) ,以膜、胞浆混合型表达为主 ,显著高于正常肝组织。肝癌多发结节组高于单发结节组 (P <0 .0 5 )。 (2 )IGF ⅠR反义基因能明显下调内源性IGF ⅠR的表达 ,与 772 1细胞、正义细胞有显著性差异 (P <0 .0 1)。 (3)电镜下反义细胞内可见微腺腔、灶性坏死、髓鞘样结构。 (4 )反义细胞G0 /G1期明显增加 (6 3.9% ) ,S期减少 (19.3% ) ,细胞凋亡增加 (5 .89% ) ,与 772 1细胞、正义细胞有显著性差异 (P <0 .0 1)。 (5 )反义细胞不能在软琼脂中生长。结论　 (1)IGF ⅠR高表达与肝癌的发生及侵袭性行为有密切关系。 (2 )IGF ⅠR反义基因下调 772 1细胞内源性IGF ⅠR的表达 ,对肝癌细胞的增殖有明显抑制作用     

肝癌HSV-tk/ACV基因治疗的实验研究

目的：观察单纯疱疹病毒胸苷激酶基因（HSV－tk基因,自杀基因）与阿昔洛韦（ＡＣＶ）系统对人肝癌细胞的体外杀伤效果。方法：体外培养已感染含ＨＳＶ-tk基因的重组逆转录病毒的PA317-tk细胞,获取含HSV－tk基因的重组逆转录病毒颗粒。用后者感染人肝癌细胞株SMMC－7721,G418培养基筛选抗性克降SMMC-7721-tk,并以PCR技术检测HSV-tk基因判断转染成功与否。用形态学方法和MTT法检测ACV对SMMC－7721－tk细胞的杀伤作用。结果：SMMC－7721－tk细胞经PCR证实含PCR－tk基因。形态学观察显示,ACV浓度在0.01-1μg/ml时,SMMC－7721－tk细胞小部分死亡,在浓度自1μg-1000μg/ml时,细胞大部分死亡;HE染色可见细胞凋亡。MTT法测定显示,ACV浓度自1μg/ml开始即对SMMC－7721－tk细胞产生明显抑制作用,抑制率自49％到78％,作用强度呈ACV浓度依赖性。各种浓度的ACV对SMMC－7721细胞没有或只有轻度抑制作用。结论：HSV－tk/ACV系统体外对肝癌细胞有明显的杀伤作用,有可能成为临床基因治疗方案。     

慢病毒介导的TSPY1对肝癌SMMC7721和Huh7细胞系增殖的影响

目的：观察转染睾丸特异性蛋白1（ TSPY1）慢病毒表达载体对肝癌细胞SMMC7721和Huh7细胞系增殖能力的影响。方法构建特异性的TSPY1慢病毒过表达载体稳定转染至SMMC7721和Huh7肝癌细胞系,采用荧光定量PCR和蛋白印迹技术检测TSPY1 mRNA和蛋白的表达情况,Cell Counting Kit-8（CCK-8）实验检测转染后细胞的增殖情况。结果在转染过表达TSPY1慢病毒的SMMC7721和 Huh7细胞中, TSPY1 mRNA和蛋白的表达均明显上调（ P＜0.01）。 CCK-8细胞增殖实验发现,过表达TSPY1组SMMC7721和Huh7细胞的增殖能力比对照组增强。结论 TSPY1慢病毒表达载体可明显上调TSPY1 mRNA和蛋白表达,并能够促进肝癌SMMC7721和Huh7细胞的增殖。     

CXCR4基因RNA干扰对人肝癌细胞系SMMC7721体外粘附、迁移的影响

目的研究CXCR4基因RNA干扰对肝癌细胞系SMMC7721体外增殖、粘附能力的影响。方法psiR—NA．CXCR4真核表达载体转染SMMC7721细胞,Trans well法检测细胞的体外迁移能力,12（;5检测细胞的粘附能力。结果psiRNA-CXCR4真核表达载体转染SMMC7721细胞后,明显沉默了SMMC7721mRNA表达,转染后48h抑制效率最高。SMMC7721细胞体外增殖、迁移能力受到抑制（P〈0．05）。结论CXCR4基因RNA干扰在体外可明显沉默肝癌细胞系SMMC7721CXCR4基因的表达,抑制肝癌细胞系SMMC7721的生长和转移。     

人肝癌特异性EB病毒载体—p^EBAF介导hGM—CSF基因的转移及表达

目的：探索人粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子（hGM-CSF)基因在肝癌细胞中特异性表达的新途径。方法：构建p^EBAF/hGM-CSF基因克隆,用脂质体转染法将它分别导入分泌甲胎蛋白（AFP）的肝癌细胞株HepG2和不分泌APF的细胞株SMMC7721,构建两围基因的细胞克隆HepG2/hGM-CSF,SMMC7721/hGM-CSF,用MTT比色法测定细胞上清中hGM-CSF活性。结果：HepG2/hGM-CSF细胞上清hGM-CSF活性平均为46．5ng/ml/10^6/24h,SMMC7721细胞上清中无明显hGM-CSF活性。结：载体p^EBAF介导的hGM-CSF基因能在分泌AFP的肝细胞中获得特异性表达。     

基因捕获技术在肝癌侵袭和迁移相关基因筛选中的应用

目的：用基因捕获技术在肝癌细胞SMMC7721细胞中寻找与肝癌侵袭和迁移相关的基因。方法：首先,将pU21质粒转染到肝癌细胞SMMC7721细胞,用G418筛选出单克隆稳定细胞系;其次,采用Transwell小室实验和划痕实验,检测这些单克隆细胞侵袭和迁移能力的变化;最后,用5’-Full RACE实验、T克隆及基因测序检测这些细胞系中被pU21质粒捕获的基因。结果：成功获得了约300株稳定转染pU21质粒的单克隆细胞系,得到了约30株侵袭和迁移能力增强的细胞株和约40株侵袭和迁移能力减弱的细胞株。通过5’-Full RACE实验、T克隆及基因测序检测,证明了在A554细胞系中,被pU21质粒捕获的基因是long inter-genic non-protein coding RNA 52（LINC00052）。结论：应用基因捕获技术筛选肝癌侵袭和迁移相关基因是可行的。     

血清TGF-α和IGF-Ⅱ水平对肝癌与肝硬化的诊断价值研究

目的：探讨血清转化生长因子－α（TGF－α）和胰岛素样生长因子－Ⅱ（IGF－Ⅱ）的水平变化对肝癌与肝硬化的诊断价值。方法;对正常35例,肝硬化患者30例,肝癌患者60例,采用放射免疫分析法分别检测血清TGF－α水平与正常对照组比较无显著性差异（P＞0．05）,其IGF－Ⅱ值则明显高于对照组（P＜0．01）,而肝癌患者的TGF－α和IGF－Ⅱ两项指标水平均显著高于对照组和肝硬化组（P＜0．01）,结论：血清TGF－α和IGF－Ⅱ可作为鉴别论断肝癌和肝硬化 辅佐性指标,联合检测AFP可提高肝癌阳性检出率。αⅡ     

选择性阻断异常Wnt信号通路对肝癌细胞生长及侵袭的影响

 目的 构建T细胞转录因子（Tcf）反义RNA真核表达载体以阻断异常Wnt信号通路,探讨其对肝癌细胞生物学特性的影响。方法 利用GeneJammer将反义基因转染人肝癌细胞系SMMC-7721,应用RT-PCR及Western blot方法分别检测转染前后细胞mRNA及蛋白表达差异,通过生长曲线、Transwell小室实验比较转染细胞生长增殖及运动侵袭能力,并进一步用流式细胞仪检测细胞凋亡及生长周期的改变。结果 反义RNA转染降低了Tcf表达,减慢了肝癌细胞的生长速度并抑止其运动侵袭能力。转染反义RNA的肝癌细胞7721-pTas凋亡比例增加［（26.34±2.07）%］,明显高于空载体转染细胞7721-vector［（6.53±1.02）%］和亲本SMMC-7721细胞［（4.33±0.68）%］ （P<0.001）。同时,处于G0-G1期的反义转染细胞比相应亲本SMMC-7721细胞和转染空载体的细胞7721-vector分别高20.24%和20.95%,而S期细胞比亲本细胞SMMC-7721和7721-vector细胞分别低11.8%和11.38%。结论 反义Tcf RNA转染可通过诱导细胞凋亡和阻止细胞周期的进程而抑制肝癌细胞的恶性增殖,提示选择性阻断异常Wnt信号通路有望成为肝癌基因治疗的新途径。     

反义端粒酶RNA抑制肝癌细胞生长的机制

目的：观察反义端粒酶RNA对SMMC－7721肝癌细胞系的作用,探讨抗端粒端治疗在原发性肝癌治疗中的意义。方法：采用脂质体介导的方式将反义端粒酶RNA真核表达载体pBBS212/hTP转入SMMC7721细胞中,经潮霉素筛选,克隆细胞株扩增鉴定后,采用TRAP－PCR－ELISA,FCM及电镜检测反义端粒酶RNA对转染细胞端粒酶活性和细胞凋亡的影响;同时进行裸鼠荷瘤生长实验观察。结果：TRAP－PCR－ELISA法检测细胞端粒酶活性的结果为：实验组吸光度值为0．980,对照组吸光度值为2．861;FCM检测细胞凋亡结果为：实验组13．8％,对照组未见有凋亡峰形成,电镜观察发现转染细胞表现出典型的凋亡细胞形态。裸鼠移植瘤生长实验发现,转染细胞生长明显受到抑制作用,说明反义端粒酶RNA显抑制SMMC7721细胞的端粒酶活性,并且对其有显的促凋亡作用。结论：反义端粒酶RNA能有效地抑制肝癌细胞端粒酶活性,同时显促进癌细胞凋亡。     

siRNA介导的NF-κB P65沉默诱导肝癌细胞SMMC7721凋亡

目的 研究siRNA介导的NF-κBP65沉默诱导肝癌细胞凋亡相关机制。方法实验以肝癌SMMC772l细胞株为材料，分为空白对照（Con）、脂质体对照（LP）以及siRNA干扰实验（siRNA）3组。以体外转录法合成dsRNA，并用脂质体转染SMMC7721细胞株；Westernblotting检测NF．KBP65表达水平，MTT检测细胞增殖情况，Annexin V-PI法检测细胞凋亡，免疫组化检测Bcl-2和Bax表达。结果与Con和LP组相比，siRNA具有抑制SMMC7721细胞NF-κBP65表达的作用，NF-κBP65表达抑制率分别达到64．74％和34．52％。siRNA明显抑制SMMC．7721细胞的增殖，并诱导细胞凋亡，晚期凋亡细胞分别是Con组和LP组的8倍和7倍。siRNA引起Bcl-2表达下调，而Bax表达上调。结论siRNA可以有效抑制NF-κBP65蛋白表达，并通过调节Bcl-2和Bax诱导SMMC7721细胞的凋亡。     

TGF—α和IGF—Ⅱ在肺癌患者血清中的表达及其临床意义

目的：为了解生长因子对肺部恶性肿瘤细胞的作用。方法：用放射免疫分析法检测了58例不同期别的肺癌患血清中IGF－Ⅱ和TGF－α水平。结果：各期肺癌患血清中IGF－Ⅱ和TGF－α水平均明显高于对照组（P＜0．01）；不同类型肺癌患血清IGF－Ⅱ和TGF－α含量之间比较无显性差异（P＞0．05）；非小细胞性肺癌患中Ⅳ期与Ⅲ期患IGF－Ⅱ和TGF－α的含量显高于Ⅱ期、且Ⅳ期高于Ⅲ期（P＜0．01）。结论：检测肺癌患血清IGF－Ⅱ和TGF－α含量可作为肺癌患的临床诊断、病情观察及预后判断的重要实验室指标之一。     

IGF-Ⅱ和CT浓度在甲亢患者中的分析

目的：了解甲状腺机能亢进时胰岛素样生长因子Ⅱ（IGF－Ⅱ）及血清降钙素（CT）含量的变化，方法：采用放射免疫法测定了17例甲亢患者血清IGF－Ⅱ和CT的含量与正常对照组进行比较。结果：17例甲亢患者中仅有2例IGF－Ⅱ和CT较高，其它均低于正常对照组，P＜0．001，差异显著；结论：甲状腺机能亢进能引起患者骨代谢的异常，导致骨质疏松症的发生是CT含量的变化引起的高转换性骨质疏松的IGF－Ⅱ在骨储存库中浓度的下降为主要的因素之一。     

腺病毒介导反义c—myc基因诱导人肝癌细胞凋亡的分子机制

目的：观察重组腺病毒介导反义c-myc基因（Ad-ASmyc)诱导体外培养不同人肝癌细胞凋亡的差异并探讨其分子生物学机制。方法：Ad-ASmyc感染人肝癌细胞系后，观察细胞生长形态变化，通过细胞生长存活率，流式细胞仪分析、RT－PCR、Western Blot分析Ad-Asmyc对人肝癌细胞系BEL－7402、QSG－7701、SMMC－7721和HCC－9204细胞凋亡诱导、c-myc和bcl-2基因表达的影响。结果：Ad-Asmyc可高效转导4种人肝癌细胞系（BEL－7402、QSG－7－1、SMMC－7721和HCC－9204细胞），镜下可见细胞凋亡的形态学变化并出现“凋亡小体”，细胞存活率分别为对照组的（37．7％、49．3％、51．3％和43．1％），诱导肝癌细胞GI期阻滞和凋亡，4种人肝癌细胞系均为c-myc 、bcl-2RNA及c-myc蛋白水平高表达，但表达水平有差异，Ad-ASmyc作用后，其表达水平均明显下降。结论：重组腺病毒介导的反义c-myc基因能够诱导体外培养人肝癌细胞凋亡，引起人肝癌细胞c-myc、bcl-2RNA及c-myc蛋白表达下调和细胞生长抑制，其诱导凋亡的程度与肝癌细胞内的c-myc表达水平密切有关。     

反义IGF-I R基因对肝癌细胞生长的抑制作用

目的:研究反义IGF-IR基因对肝癌细胞株7721细胞生长的抑制作用.方法:利用基因治疗的反义技术,通过脂质体介导将IGF-IR正、反义基因真核表达载体导入人肝癌细胞株SMMC-7721,经潮霉素筛选阳性克隆后,分别采用流式细胞仪检测细胞周期、凋亡,MTT法检测细胞生长及软琼脂克隆形成试验.结果:1GF-IR反义细胞与7721细胞IGF-IR正义细胞在前6 d生长趋势无明显变化,第7天后反义IGF-IR细胞生长减慢.反义IGF-IR基因细胞G1/G 2期细胞明显增加,为63.9%,明显高于7721细胞(49.8%);S期减少(1 9.3%),细胞凋亡增加(5.89%),不能在软琼脂中生长,而7721细胞及IGF-I R正义细胞在软琼脂中生长良好.结论:反义IGF-IR基因对肝癌细胞株7721生长具有明显抑制作用.     

稳定表达促血管生成素基因肝癌细胞系的建立及产物的检测

目的 构建携带促血管生成素(Angiopoietin)基因并稳定表达的肝癌细胞系SMMC7721，为进一步研究奠定基础。方法 选择本身不表达Angiopoietin的肝癌细胞系SMMC7721，通过脂质体介导的基因转染方法将Angiopoietin基因导入SMMC7721肝癌细胞系，并用G418筛选稳定表达的细胞克隆，构建携带Angiopoietin基因并稳定表达的SMMC7721肝癌细胞系。用RT-PCR方法从RNA水平以及用免疫荧光法从蛋白水平均检测新构建的肝癌细胞系是否携带了Angiopoietin基因并能稳定表达其蛋白产物。结果 成功构建了携带Angiopoietin基因的肝癌细胞系，新的细胞系可以稳定表达外源基因及其蛋白产物。结论 脂质体介导基因转染法是一种高效转染方法，新细胞系的建立将为进一步的促血管生成素在肝癌血管的生成和转移中的作用研究奠定基础。