左归丸含药血清对MC3T3-E1细胞分化过程中Cx43表达及GJIC功能的影响

目的:研究左归丸含药血清对培养MC3T3-E1细胞分化成熟过程中Cx43表达及GJIC功能的影响。方法:胰蛋白酶消化法传代培养MC3T3-E1细胞,通过血清药理学方法,设立正常对照组、左归丸组(5%、10%、15%)。分别用RT-PCR、Western blot法检测培养细胞第7、14、21天Cx43mRNA、蛋白表达;第21天划痕染料标记示踪法检测细胞GJIC功能。结果:随着培养时间增加,各组MC3T3-E1细胞Cx43mRNA、蛋白表达逐渐增强;GJIC染料标记检测中,可见绿色荧光在划痕两侧扩散,荧光定量分析存在组间差异。各浓度左归丸含药血清均可促进培养细胞的Cx43mRNA和蛋白表达、增强GJIC功能,并与含药浓度正性相关,其中以10%组作用最显著(P0.05或P0.01)。结论:左归丸含药血清能增强MC3T3-E1细胞Cx43mRNA、蛋白表达及GJIC功能,这可能是其促进MC3T3-E1细胞分化成熟的重要机制之一。     

左归丸通过线粒体途径抗叔丁基过氧化氢诱导的MC3T3-E1细胞凋亡

目的:观察左归丸对叔丁基过氧化氢诱导的MC3T3-E1细胞凋亡的保护效应,探讨其作用机制是否与其干预线粒体途径有关。方法:以成骨细胞MC3T3-E1为研究对象,制备左归丸含药血清,建立叔丁基过氧化氢(t-BHP)成骨细胞MC3T3-E1氧化应激模型,实验分为空白组,t-BHP组,左归丸+t-BHP组,补佳乐+t-BHP组。孵育24,48,72 h后,采用噻唑蓝(MTT)法检测左归丸含药血清对t-BHP诱导MC3T3-E1细胞存活的影响;孵育48 h后,采用吖啶橙溴乙啶(AO/EB)染色法检测细胞凋亡,采用Hoechst 33342染色法观察凋亡细胞核变化,采用罗丹明123荧光染色法观察线粒体膜电位的改变,采用蛋白质免疫印迹(Western blot)法分析线粒体蛋白家族B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2),Bcl-2相关X蛋白(Bax),半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)蛋白表达水平。结果:与空白组比较,t-BHP组显著抑制细胞增殖(P0.05,P0.01),细胞凋亡增加,线粒体膜电位降低,Bcl-2蛋白表达明显下调(P0.01);与t-BHP组比较,左归丸加t-BHP组促进暴露于t-BHP诱导的MC3T3-E1氧化损伤细胞的存活(P0.01),48 h者尤佳,逆转细胞凋亡情况,提高细胞线粒体膜电位,上调Bcl-2蛋白表达(P0.05),抑制Bax和Caspase-3蛋白表达(P0.01)。结论:左归丸含药血清能够抗t-BHP诱导的MC3T3-E1细胞凋亡,其作用机制可能与其干预线粒体途径有关。     

沉默Cx43基因对左归丸促MC3T3-E1细胞分化作用的影响

目的:研究沉默Cx43基因对左归丸含药血清促MC3T3-E1细胞分化作用的影响。方法:采用慢病毒介导的RNA干扰技术沉默Cx43基因,将培养细胞分为正常对照A组、含药血清B组、基因沉默C组。细胞培养第3、5、7、9天进行ALP活性测定、第21天矿化结节茜素红染色,进行组间对比。结果:左归丸含药血清可以促进MC3T3-E1细胞的分化,与A组比较:ALP活性增强,其中第5、7、9天差异显著(P0.05);茜素红染色面积增加(P0.01)。C组与B组比较:ALP活性降低,其中第7、9天差异显著(P0.05);茜素红染色面积明显减少(P0.05)。结论:沉默细胞Cx43基因导致左归丸含药血清促MC3T3-E1细胞分化作用明显下降。     

JNK通路对左归丸含药血清调控MC3T3 成骨细胞Runx2 mRNA表达的影响

目的:探讨c-Jun氨端激酶(JNK)信号通路在左归丸含药血清调控成骨前体细胞(MC3T3-E1)增殖和成骨特异转录因子核心结合因子(Runx2) mRNA表达中的作用.方法:以MC3T3-E1为研究对象,制备左归丸含药血清,选用JNK特异抑制剂SP 600125,实验分为空白对照组、SP 600125组、左归丸组、左归丸加SP 600125组、倍美力组、倍美力加SP 600125组.孵育48 h后,采用噻唑蓝(MTT)法检测SP600125对左归丸含药血清干预MC3T3-E1成骨前体细胞增殖作用的影响,采用Western blot法分析JNK蛋白磷酸化水平,采用Real Time RT-PCR法检测成骨细胞特异转录因子Runx2 mRNA表达情况.结果:与空白对照组比较,左归丸含药血清组显著促进细胞增殖,明显上调p-JNK蛋白和Runx2 mRNA表达(P＜0.01);SP600125显著抑制左归丸含药血清诱导的增殖和p-JNK蛋白表达(P＜0.01),对Runx2 mRNA表达的影响不显著.结论:JNK信号通路的激活可能参与了左归丸含药血清诱导的MC3T3-E1成骨前体细胞增殖,但左归丸含药血清诱导的Runx2mRNA高表达对JNK信号通路依赖不显著.     

左归丸含药血清对BMSCs成骨分化过程中Cx43表达及GJIC功能的影响

目的:研究左归丸含药血清对培养大鼠BMSCs成骨向诱导分化过程中Cx43表达及GJIC功能的影响。方法:密度梯度离心法制取BMSCs培养传代,通过血清药理学方法,设立正常对照A组、左归丸含药血清B组、缝隙连接阻滞C组。培养过程中进行细胞形态学观察;第14天分别采用RT-PCR、FRAP技术检测Cx43、β-catenin、BGPmRNA表达及细胞GJIC功能;第21天茜素红染色检测矿化结节形成情况。结果:左归丸含药血清能明显促进Cx43、β-catenin、BGPmRNA表达,与A组比较,P0.05;加用AGA后,Cx43、β-cateninmRNA表达无明显影响,而BGPmRNA明显下降,与B组比较,P0.05。FRAP检测镜下观察B组细胞内荧光恢复明显,其平均荧光恢复率与A、C组比较差异显著,P0.01。钙结节相对面积定量分析,B组显著高于A、C组,P0.05。结论:左归丸含药血清能增强BMSCs成骨向诱导分化过程中Cx43表达及GJIC功能,并与β-catenin、BGP基因在此过程中发挥协同作用。这可能是其促进BMSCs成骨分化成熟的重要机制。     

六味地黄丸含药血清对MC3T3-E1细胞增殖以及对Runx2、FOXO1 mRNA表达的影响

目的探讨六味地黄丸含药血清对MC3T3-E1细胞增殖以及对Runx2、FOXO1 mRNA表达的影响。方法制作六味地黄丸混悬液,对成年Wistar大鼠进行灌胃,获取六味地黄丸含药血清。常规培养MC3T3-E1细胞24 h后更换含10%不同浓度含药血清的培养基,分别培养48 h和72 h后用CCK-8法检测MC3T3-E1细胞的增殖;对MC3T3-E1细胞进行诱导培养22天后进行饥饿培养24h,随后更换含10%不同浓度的含药血清,培养72 h后检测Runx2、FOXO1 mRNA表达。结果六味地黄丸含药血清能促进MC3T3-E1细胞增殖,并且呈现一定的剂量依赖性;同时六味地黄丸含药血清各剂量组均能明显促进Runx2 mRNA的表达(P0.01),高剂量组的表达明显高于低剂量组(P0.01)。高剂量组的FOX01 mRNA表达明显高于其他3组(P0.01)。结论六味地黄丸含药血清能促进MC3T3-E1细胞增殖,同时能促进Runx2、FOXO1 mRNA表达。     

左归丸含药血清通过JNK信号通路诱导MC3T3成骨细胞分化的研究

目的 探讨JNK信号通路对左归丸(熟地、菟丝子、川牛膝、龟甲胶、鹿甲胶、山药、山茱萸、枸杞子)含药血清干预MC3T3成骨细胞分化的影响.方法 选用JNK特异抑制剂SP600125,制备大鼠含药血清,实验分为空白对照组、SP600125组、左归丸组、左归丸加SP600125组、倍美力组、倍美力加SP600125组.孵育48 h后,采用PNPP法检测碱性磷酸酶(ALP)活性,采用Western blot法分析ALP蛋白表达水平;孵育7 d,采用改良钙钴染色法检测ALP活性;孵育14 d,采用茜素红染色法测定矿化沉积情况.结果 与空白对照组比较,左归丸组显著促进MC3T3成骨细胞分化,明显上调ALP蛋白表达水平(P＜0.01);与左归丸组比较,左归丸加 SP600125组孵育48 h对ALP活性及蛋白影响不显著,但显著对抗左归丸含药血清对孵育7 d的ALP活性和孵育14d的矿化结节的促进作用(P＜0.01).结论 左归丸含药血清可能部分通过JNK信号通路干预MC3T3成骨细胞分化,在分化末期尤其依赖JNK通路.     

安胃汤含药血清通过调节PI3K/Akt信号通路促进MC细胞凋亡的研究

目的:探讨安胃汤含药血清对MC细胞(MNNG诱导人胃黏膜上皮细胞系(GES-1)恶性转化)PI3K/Akt信号通路相关因子及细胞凋亡影响。方法:根据中药复方血清药理学实验方法,以MC细胞为研究对象,设立空白组(A组)、安胃汤组(B组)、安胃汤+阻断剂组(C组)、阻断剂组(D组)。含药血清处理12、24、48 h后的各组细胞采用流式细胞术检测细胞凋亡率;Western Blot和Real-time PCR检测PI3Kα、AKT、XIAP蛋白及mRNA的表达。结果:A组细胞凋亡率比较低,B、C、D组细胞凋亡率有所增加,C组细胞凋亡率增加最为明显;与A组相比,B、C、D 3组细胞内PI3Kα、AKT、XIAP基因及蛋白表达有所降低(P0.01或P0.05)。结论:安胃汤能促进MC细胞细胞凋亡,可能与其通过调控PI3K/Akt通路,下调XIAP基因及蛋白有关。     

接骨1号方含药血清对MC3T3-E1细胞NF-κb信号通路的影响

目的:通过研究接骨1号方含药血清对MC3T3-E1细胞NF-κb信号通路的影响,探讨接骨1号方促进骨折愈合的可能机制。方法:分别以接骨1号方高、中、低剂量、阳性对照药补佳乐和生理盐水予大鼠灌胃以制备大鼠含药血清,共5组,分别为JG1-H组、JG1-M组、JG1-L组、Est组、Control组,对MC3T3-E1细胞进行干预,7 d后,观察细胞形态,并采用RealTime RT-PCR法检测骨保护素(osteoprotegerin,OPG)、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factorα,TNF-α)和核因子κb(Nuclear factorκb,NF-κb)mRNA表达,用Western blot法检测OPG、TNF-α和NF-κb蛋白的表达。结果:JG1-M组与Est组MC3T3-E1细胞OPG mRNA和蛋白表达水平均显著高于Control组(P0.01)。JG1-M组MC3T3-E1细胞TNF-α和NF-κb mRNA和蛋白的表达均水平低于Control组(P0.01)。结论:接骨1号方含药血清可能通过调控NF-κb信号通路促进MC3T3-E1细胞的成骨分化;接骨1号方可能通过抗炎促进骨折愈合。     

补阳还五汤通过调节血管平滑肌细胞Cx43作用于动脉粥样硬化的研究

目的:研究补阳还五汤抗同型半胱氨酸(Hcy)诱导血管平滑肌细胞(HUVSMC)增殖的作用及其机制。方法:以14.9g/kg补阳还五汤剂量连续灌胃SD大鼠1周,提取补阳还五汤含药血清,并与胎牛血清(FBS)按一定比例,配置成20%(20%补阳)、10%(10%补阳+10%FBS)、5%(5%补阳+15%FBS)补阳还五汤含药血清组组。血管平滑肌细胞长满培养瓶或培养板后,用同型半胱氨酸分组造模,将细胞随机分为10组:空白组、模型组、乙酰半胱氨酸(NAC)组、20%、10%、5%补阳还五汤含药血清组、NF-kB阻断剂PDTC组、MAPK阻断剂SB20组、ERK阻断剂PD98组、PKC阻断剂Stau组。蛋白质印迹法(Western blot)测定血管平滑肌细胞Cx43蛋白的表达量;RT-PCR技术检测各组血管平滑肌细胞Cx43 mRNA水平;建立血管内皮-平滑肌细胞共培养体系,Western blot分别检测内皮细胞和平滑肌细胞内Cx43的表达;电镜检测血管内皮-平滑肌细胞共培养体系细胞缝隙连接的变化。结果:Western blot实验中,平滑肌细胞与共培养体系中的内皮细胞、平滑肌细胞的Cx43蛋白表达水平,模型组与空白组比较,模型组中Cx43蛋白表达量均显著升高;乙酰半胱氨酸组,20%、10%、5%补阳还五汤含药血清组与模型组比较,Cx43蛋白表达显著下调。RT-PCR实验中,模型组与空白组比较,模型组中Cx43mRNA表达量显著升高;乙酰半胱氨酸组、20%、10%、5%补阳还五汤含药血清组与模型组比较,Cx43mRNA表达量显著降低。电镜检测细胞缝隙连接实验中:模型组与空白组比较,内皮-平滑肌细胞之间形成的缝隙连接遭到破坏,而20%补阳还五汤含药血清组却能形成与正常组相似的连接。结论:补阳还五汤可能通过下调Cx43蛋白以及其mRNA的表达,改善细胞之间的缝隙连接,减少血管平滑肌细胞增殖而发挥抗动脉粥样硬化的作用。     

莫诺苷对TNF-α诱导MC3T3-E1细胞炎症的保护作用及机制研究

目的研究莫诺苷对肿瘤坏死因子-α(TNF-α)诱导成骨细胞MC3T3-E1炎症的保护作用,探讨Caspase、MAPK和NF-κB通路调控机制。方法 TNF-α(50 ng/m L)诱导MC3T3-E1细胞,制备细胞炎症模型;MTT法检测莫诺苷对MC3T3-E1细胞增殖的影响,并检测不同浓度的莫诺苷对TNF-α诱导MC3T3-E1细胞活力的影响;ELISA法检测细胞上清液中炎性因子白细胞介素-1β(IL-1β)、IL-6的水平;Western blotting法检测Caspase-3、Caspase-9、p-ERK、p-JNK、p-p38、p-IκBα、IκBα和NF-κB等相关蛋白的表达。结果莫诺苷能够促进正常MC3T3-E1细胞增殖,TNF-α诱导MC3T3-E1细胞增殖受到抑制,而莫诺苷对TNF-α诱导MC3T3-E1细胞具有保护作用;莫诺苷可以抑制TNF-α诱导MC3T3-E1细胞IL-1β和IL-6的释放;降低Caspase-3、Caspase-9、p-ERK、p-JNK、p-p38、p-IκBα蛋白的表达,升高IκBα蛋白表达,对NF-κB p65无明显影响。结论莫诺苷对TNF-α诱导MC3T3-E1炎症细胞有保护作用,其机制为抑制炎性因子的释放、抑制MAPK和NF-κB通路的激活、抑制凋亡蛋白Caspase的表达,从而抑制MC3T3-E1细胞的凋亡。     

补肾活血固齿方对大鼠MC3T3-E1细胞BMP2表达及超微结构的影响

目的:研究补肾活血固齿方对小鼠颅顶前成骨细胞(MC3T3-E1细胞)BMP2表达及超微结构的影响,探讨该方剂治疗牙周炎的作用机理。方法:MC3T3-E1细胞分别于补肾活血固齿方含药血清、无药血清中培养24、48、72 h,ELISA法检测MC3T3-E1细胞BMP2的表达;培养14 d后,透射电镜观察MC3T3-E1细胞超微结构的变化。结果:含药血清组培养上清液的光密度值明显高于无药血清组,统计结果显示差异有显著性(P0.05)。MC3T3-E1细胞经药物作用后呈现成骨细胞样表型,细胞表面突起变多,核卵圆形、较大,核膜凹陷,核仁明显;胞质丰富,粗面内质网扩张明显,网腔内充满低电子密度絮状物;高尔基复合体、线粒体发达,具有良好的的分泌功能,细胞代谢活跃。结论:补肾活血固齿方能促进MC3T3-E1细胞分泌BMP2,参与诱导成骨作用;补肾活血固齿方能诱导MC3T3-E1细胞呈成骨细胞样表型,促进成骨细胞的分化生长。     

基于ER/ERK信号通路研究左归丸、左归丸去补阳药含药血清对成骨细胞功能的影响

目的:对比观察左归丸和左归丸去补阳药含药血清对成骨细胞功能的影响,从而部分阐明"阳中求阴"配伍防治骨质疏松的作用机制。方法:以成骨细胞MC3T3-E1为研究对象,制备左归丸、左归丸去补阳药含药血清,选用雌激素受体拮抗剂ICI182780共孵,阻断ER受体后检测左归丸、左归丸去补阳药含药血清对成骨细胞增殖、分化和矿化的影响。采用MTT法检测24 h、48 h、72 h左归丸、左归丸去补阳药含药血清对成骨细胞增殖的影响,采用改良钙钴染色法和茜素红染色法分别观察48 h左归丸、左归丸去补阳药含药血清对成骨细胞ALP活性和矿化结节的影响,采用Western-blot法检测48 h左归丸、左归丸去补阳药含药血清对ERα、ERK、p-ERK和Osterix蛋白表达的影响。结果:与空白对照组比较,左归丸组(9.68 g/kg)促进成骨细胞增殖,提高成骨细胞ALP活性和矿化结节数量,上调ERα、p-ERK和Osterix蛋白表达。ICI 182780阻断ER受体后,左归丸含药血清促成骨细胞增殖、分化和矿化的特性明显下降,ERα和p-ERK蛋白表达降低,相关转录因子Osterix的表达也被部分抑制。与空白对照组比较,左归丸去补阳药组(7.47 g/kg)未呈现促MC3T3-E1细胞增殖作用,可促进成骨细胞ALP活性和矿化结节形成数量增多,左归丸组明显优于左归丸去补阳药组,对ERα、p-ERK和Osterix蛋白表达影响不明显。结论:左归丸含药血清可以促进成骨细胞增殖、分化和矿化,机制可能与其上调成骨细胞ER受体激活ERK信号通路调控转录因子osterix有关;全方效果较好,部分揭示左归丸"阳中求阴"配伍防治骨质疏松的作用机制可能与其影响成骨细胞增殖和部分影响成骨细胞分化和矿化功能密切相关。     

六味地黄丸含药血清对自杀基因治疗黑色素瘤增效作用的缝隙连接机制初探

目的 探讨六味地黄丸含药血清对HSV-tk/GCV自杀基因系统杀伤小鼠黑色素细胞瘤B16细胞增效作用的缝隙连接机制。方法 制备六味地黄丸含药血清（分别为2.5%、5.0%、10.0%六味血清）及10.0%对照血清。 采用RT-PCR法检测六味地黄丸含药血清对B16细胞株的缝隙链接蛋白（Cx）26和Cx43 mRNA的影响,Western blot法和间接免疫荧光法检测其对B16细胞Cx26和Cx43蛋白表达的影响;RT-PCR检测Cx26－309、Cx26－337、Cx26－367、Cx26－2098 SiRNA对Cx26的干扰效率,选用干扰效率最高的Cx26－2098 SiRNA干扰Cx26基因后观察六味地黄丸联合HSV-tk/GCV的旁观者效应;MTT法检测细胞间缝隙连接通讯功能（gap junctional intercellular communication, GJIC）抑制剂甘草次酸（GA）对六味地黄丸联合tk/GCV系统对B16细胞杀伤作用的影响,实验设为对照血清组,2.5%、5.0%、10.0%六味血清组（简称低、中、高剂量组）及对照血清联合GCV组,低、中、高剂量联合GCV组,低、中、高剂量联合GCV加GA组。GCV终浓度为20 mol/L,GA终浓度为50 mol/L。结果 六味地黄丸含药血清能提高B16细胞中Cx43 mRNA及蛋白的表达,且具有量效依赖关系;对Cx26 mRNA与蛋白的表达具有双向调节作用,低剂量时具有抑制作用而高剂量是能上调其表达;SiRNA干扰Cx26基因表达后,六味地黄丸联合自杀基因治疗的旁观者效应与没有干扰前比较无明显的变化;低、中、高剂量联合GCV组在GA阻断前细胞抑制率（48.75%、59.39%、69.28%）与阻断后细胞抑制率（29.14%、38.71%、58.13%）比较,显著降低,差异有统计学意义（P<0.01）。结论 六味地黄丸含药血清对HSV-tk/GCV自杀基因系统杀伤恶性黑色素瘤B16细胞的增效作用与缝隙连接机制有关,可能是通过提高Cx26和Cx43等缝隙连接蛋白表达而达到协同增效作用。     

六味地黄丸含药血清对MC3T3-E1细胞骨钙素的影响及其对“异病同治”理论的启示

目的探讨六味地黄丸含药血清培养MC3T3-E1细胞后,对上清液中羧化、未羧化两种状态的骨钙素的作用,并探究六味地黄丸治疗骨质疏松症及糖尿病的共同物质基础。方法制作六味地黄丸混悬液,对成年Wistar大鼠进行灌胃,获取六味地黄丸含药血清,分为含药血清对照组、低剂量组、中剂量组和高剂量组。对MC3T3-E1细胞诱导培养22天后进行饥饿培养24 h,随后更换含10%不同浓度的含药血清,分别培养24 h、48 h、72 h后,各组吸出1 ml上清液,检测羧化及未羧化骨钙素;培养72 h后检测骨钙素mRNA表达。结果与对照组骨钙素mRNA表达比较,含药血清低、中、高剂量组骨钙素mRNA的表达均明显增加(P0.01)。上清液中未羧化骨钙素比较:含药血清中剂量、高剂量组在各时间点的含量均明显高于对照组和低剂量组(P0.05,P0.01)。上清液中羧化骨钙素比较:含药血清低剂量组在培养48 h时的含量明显高于对照组(P0.01);中剂量组和高剂量组在各时间点的含量均明显高于对照组(P0.01);同时中剂量组在培养24 h、72 h时也明显高于低剂量组(P0.05);高剂量组在培养72 h时明显高于低剂量组(P0.01)和中剂量组(P0.05)。结论六味地黄丸含药血清能促进MC3T3-E1细胞培养上清液中羧化与未羧化骨钙素的含量,提示骨钙素可能就是六味地黄丸治疗两种疾病,即异病同治的物质基础之一。     

从Cx26探究六味地黄丸增效肝癌自杀基因治疗的机制

目的:探讨六味地黄丸对大鼠肝癌CBRH7919细胞Cx26表达的影响,初步阐明其对自杀基因治疗的增效作用是否与缝隙连接机制相关。方法:应用血清药理学研究方法制备六味地黄丸含药血清。采用MTT法检测六味地黄丸含药血清联合单纯疱疹病毒-胸苷激酶/丙氧鸟苷(HSV-tk/GCV)自杀基因系统治疗的杀伤效应:应用蛋白印迹(Western blot)技术、间接免疫荧光法及荧光定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测其对CBRH7919细胞株Cx26蛋白及mRNA表达的影响。结果:①六味地黄丸含药血清联合自杀基因治疗组肝癌细胞存活率明显低于单纯自杀基因组(10%tk+/GCV加对照血清)(P<0.01),且联合作用均具有协同性(Q>1.15);②Western blot检测显示六味地黄丸含药血清能提高Cx26蛋白的表达,并有明显的量效关系;③间接免疫荧光法(FITC)法共聚焦显微镜观测显示近似的结果:蛋白定位于细胞膜和胞浆,尤其在细胞膜的表达明显增多,含药血清组的Cx26蛋白荧光强度比对照组明显增加(P<0.05)。结论:六味地黄丸增强自杀基因旁杀伤效应的机制与其促进肝癌细胞Cx26 mRNA及蛋白表达,增加膜上...     

左归丸抗乳腺癌转移及其作用机制

目的:观察左归丸的抗乳腺癌转移作用,探讨其作用机制。方法:采用股骨内注射法建立人乳腺癌细胞MDAMB-231骨转移裸鼠模型,受试裸鼠随机分为空白组(蒸馏水),左归丸低、高剂量(21,42 g·kg-1)组。连续给药8周后,采用巢式聚合酶链式反应(PCR)检测裸鼠骨髓组织中人细胞角蛋白(ck19)基因的表达,确定肿瘤转移情况;采用Oris法,检测左归丸含药血清对乳腺癌细胞MDA-MB-231体外迁移能力的影响;采用重组基底膜侵袭法,观察左归丸含药血清的体外抗侵袭作用;采用Alexa Fluor488标记的鬼笔环肽(Phalloidin)进行荧光染色,观察左归丸含药血清对乳腺癌细胞纤维型肌动蛋白(F-actin)聚合的影响;采用蛋白质印迹法(Western blot)检测左归丸含药血清对MDA-MB-231细胞甲状旁腺激素相关蛋白(PTHr P)和4型趋化因子受体(CXCR4)表达的影响。结果:与空白组比较,左归丸高、低剂量均可显著抑制小鼠骨髓组织中人ck19基因表达(P0.01)。Oris迁移表明,左归丸含药血清可显著抑制转化生长因子-β(TGF-β)诱导的MDA-MB-231细胞迁移;重组基底膜侵袭实验显示,左归丸含药血清也可显著抑制乳腺癌细胞对重组基底膜的侵袭能力。给药组侵袭细胞数较空白组显著降低(P0.01)。Phalloidin荧光染色结果显示,左归丸含药血清可显著抑制F-actin聚合,抑制F-actin聚合体的形成。Western blot结果表明,左归丸含药血清可显著抑制乳腺癌细胞PTHr P,CXCR4蛋白表达。结论:左归丸具有明显的抗乳腺癌骨转移作用,其机制与抑制肿瘤细胞PTHr P,CXCR4表达,从而直接抑制其体外运动活性相关。     

过表达及定点突变缝隙连接蛋白Cx43小鼠黑色素瘤细胞模型的构建

目的 构建小鼠黑色素瘤细胞（B16）过表达野生型及点突变型缝隙连接蛋白43（Connexin43,Cx43）细胞模型,为以缝隙连接（Gap Junction,GJ）为靶点的中药复方、中药单药及药物单体的研究提供可靠阳性对照和阴性对照。方法 构建野生型Cx43、突变型Cx43G21R、突变型Cx43G138R重组荧光蛋白融合慢病毒表达质粒,用定点突变技术获得Cx43G21R和Cx43G138R突变体,对上述3种质粒进行双酶切和测序鉴定,并分别包装病毒感染B16细胞,使B16细胞过表达野生型Cx43、突变型Cx43G21R、突变型Cx43G138R。Western blot检测Cx43蛋白表达水平变化,荧光示踪法观察缝隙连接通讯（Gap Junction Intercellular Communication,GJIC）功能变化。结果 ①酶切及测序证明,成功构建pLVCx43-mCherry、pLVCx43-mCherryG21R、pLVCx43- mCherryG138R重组荧光蛋白融合慢病毒表达质粒。②成功感染B16细胞并筛选稳定过表达Cx43、Cx43G21R、Cx43G138R细胞株,Western blot检测显示上述细胞株Cx43蛋白表达均高于对照组。③过表达野生型Cx43后B16细胞GJIC功能较对照组增强;过表达突变型Cx43后B16细胞GJIC功能较对照组减弱。结论 过表达野生型Cx43可增强B16细胞GJIC功能,过表达突变型Cx43可抑制B16细胞GJIC功能。     

西黄丸含药血清对人结直肠癌细胞SW480凋亡及Bcl-2、Bax蛋白表达的影响

目的:研究西黄丸对人结直肠癌细胞SW480凋亡的影响及其作用机制的初步探讨。方法:以人结直肠癌细胞SW480为研究对象,MTT法检测不同剂量西黄丸含药血清对SW480细胞活性的影响,并用流式细胞术检测西黄丸含药血清引起的细胞凋亡率改变;用Western blot的方法检测Bax和Bcl-2蛋白表达水平,初步探讨其凋亡机制。结果:西黄丸含药血清可浓度依赖性降低SW480的细胞活力并增加细胞凋亡率,Western blot结果显示西黄丸含药血清增加了Bax蛋白表达,抑制Bcl-2蛋白表达。结论:西黄丸含药血清可抑制SW480细胞活力、诱导细胞凋亡并减小Bcl-2、Bax蛋白表达比例,其机制可能与以线粒体为核心的凋亡途径有关。     

臭牡丹含药血清通过PI3K/Akt信号通路对肝癌细胞的影响

目的:从磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/丝氨酸苏氨酸蛋白激酶(Akt)信号通路角度探讨臭牡丹含药血清对肝癌MHCC97-H细胞的影响及可能的机制。方法:臭牡丹15%含药血清作用于MHCC97-H细胞,细胞增殖/毒性法(CCK-8)观察臭牡丹含药血清对细胞增殖的影响,以筛选最佳作用时间和浓度; Annexin V-FITC/碘化丙啶(PI)双染法检测细胞凋亡;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测臭牡丹含药血清作用于细胞72 h后对PI3K/Akt信号通路中关键蛋白中第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源的基因(PTEN),磷酸化Akt(p-Akt)和磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)蛋白表达的影响;实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测臭牡丹含药血清作用于细胞72 h后对核转录因子-κB(NF-κB)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)mRNA表达的影响。结果:CCK-8结果显示,与空白组比较,臭牡丹含药血清对肿瘤细胞的增殖抑制作用呈剂量和时间依赖性。其中高剂量组抑制作用最为明显,在24,48,72 h的最大抑制率分别达到28%,32%,43%;流式细胞术结果显示,与空白组比较,随着臭牡丹含药血清浓度的增加,细胞的生长均受不同程度抑制,细胞的凋亡比例亦相应增加,72 h干预组抑制作用显著(P 0. 01),臭牡丹含药血清组各时间段最大凋亡率达19. 48%,19. 72%(P 0. 05); Western blot结果显示,与空白组比较,臭牡丹含药血清干预下各组PTEN表达量均升高(P 0. 05),PI3K,p-Akt蛋白表达均减少(P 0. 05); Real-time PCR结果显示,与空白组比较,臭牡丹含药血清可以下调NF-κB mRNA表达,上调TNF-αmRNA的表达(P 0. 05)。结论:臭牡丹含药血清可以有效抑制MHCC97-H肝癌细胞增殖并促进其凋亡,可能与PI3K/Akt信号通路并影响其关键因子有关。