左归丸含药血清通过JNK信号通路诱导MC3T3成骨细胞分化的研究

目的 探讨JNK信号通路对左归丸(熟地、菟丝子、川牛膝、龟甲胶、鹿甲胶、山药、山茱萸、枸杞子)含药血清干预MC3T3成骨细胞分化的影响.方法 选用JNK特异抑制剂SP600125,制备大鼠含药血清,实验分为空白对照组、SP600125组、左归丸组、左归丸加SP600125组、倍美力组、倍美力加SP600125组.孵育48 h后,采用PNPP法检测碱性磷酸酶(ALP)活性,采用Western blot法分析ALP蛋白表达水平;孵育7 d,采用改良钙钴染色法检测ALP活性;孵育14 d,采用茜素红染色法测定矿化沉积情况.结果 与空白对照组比较,左归丸组显著促进MC3T3成骨细胞分化,明显上调ALP蛋白表达水平(P＜0.01);与左归丸组比较,左归丸加 SP600125组孵育48 h对ALP活性及蛋白影响不显著,但显著对抗左归丸含药血清对孵育7 d的ALP活性和孵育14d的矿化结节的促进作用(P＜0.01).结论 左归丸含药血清可能部分通过JNK信号通路干预MC3T3成骨细胞分化,在分化末期尤其依赖JNK通路.     

六味地黄丸含药血清对MC3T3-E1细胞增殖以及对Runx2、FOXO1 mRNA表达的影响

目的探讨六味地黄丸含药血清对MC3T3-E1细胞增殖以及对Runx2、FOXO1 mRNA表达的影响。方法制作六味地黄丸混悬液,对成年Wistar大鼠进行灌胃,获取六味地黄丸含药血清。常规培养MC3T3-E1细胞24 h后更换含10%不同浓度含药血清的培养基,分别培养48 h和72 h后用CCK-8法检测MC3T3-E1细胞的增殖;对MC3T3-E1细胞进行诱导培养22天后进行饥饿培养24h,随后更换含10%不同浓度的含药血清,培养72 h后检测Runx2、FOXO1 mRNA表达。结果六味地黄丸含药血清能促进MC3T3-E1细胞增殖,并且呈现一定的剂量依赖性;同时六味地黄丸含药血清各剂量组均能明显促进Runx2 mRNA的表达(P0.01),高剂量组的表达明显高于低剂量组(P0.01)。高剂量组的FOX01 mRNA表达明显高于其他3组(P0.01)。结论六味地黄丸含药血清能促进MC3T3-E1细胞增殖,同时能促进Runx2、FOXO1 mRNA表达。     

更正启事

2012年08期《中成药》中《左归丸含药血清通过JNK信号通路诱导MC3T3成骨细胞分化的研究》一文,第1433页英文摘要第4行"Blood cells"应为"Cells";第5行"SP6001250"应为"SP600125"。特此更正!     

左归丸含药血清对MC3T3-E1细胞分化过程中Cx43表达及GJIC功能的影响

目的:研究左归丸含药血清对培养MC3T3-E1细胞分化成熟过程中Cx43表达及GJIC功能的影响。方法:胰蛋白酶消化法传代培养MC3T3-E1细胞,通过血清药理学方法,设立正常对照组、左归丸组(5%、10%、15%)。分别用RT-PCR、Western blot法检测培养细胞第7、14、21天Cx43mRNA、蛋白表达;第21天划痕染料标记示踪法检测细胞GJIC功能。结果:随着培养时间增加,各组MC3T3-E1细胞Cx43mRNA、蛋白表达逐渐增强;GJIC染料标记检测中,可见绿色荧光在划痕两侧扩散,荧光定量分析存在组间差异。各浓度左归丸含药血清均可促进培养细胞的Cx43mRNA和蛋白表达、增强GJIC功能,并与含药浓度正性相关,其中以10%组作用最显著(P0.05或P0.01)。结论:左归丸含药血清能增强MC3T3-E1细胞Cx43mRNA、蛋白表达及GJIC功能,这可能是其促进MC3T3-E1细胞分化成熟的重要机制之一。     

接骨1号方含药血清对MC3T3-E1细胞NF-κb信号通路的影响

目的:通过研究接骨1号方含药血清对MC3T3-E1细胞NF-κb信号通路的影响,探讨接骨1号方促进骨折愈合的可能机制。方法:分别以接骨1号方高、中、低剂量、阳性对照药补佳乐和生理盐水予大鼠灌胃以制备大鼠含药血清,共5组,分别为JG1-H组、JG1-M组、JG1-L组、Est组、Control组,对MC3T3-E1细胞进行干预,7 d后,观察细胞形态,并采用RealTime RT-PCR法检测骨保护素(osteoprotegerin,OPG)、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factorα,TNF-α)和核因子κb(Nuclear factorκb,NF-κb)mRNA表达,用Western blot法检测OPG、TNF-α和NF-κb蛋白的表达。结果:JG1-M组与Est组MC3T3-E1细胞OPG mRNA和蛋白表达水平均显著高于Control组(P0.01)。JG1-M组MC3T3-E1细胞TNF-α和NF-κb mRNA和蛋白的表达均水平低于Control组(P0.01)。结论:接骨1号方含药血清可能通过调控NF-κb信号通路促进MC3T3-E1细胞的成骨分化;接骨1号方可能通过抗炎促进骨折愈合。     

基于分子对接的方法探讨桑根酮C对MC3T3-E1细胞的作用

目的:观察桑根酮C(SanC)对地塞米松(DEX)作用下小鼠MC3T3-E1成骨细胞增殖与分化的影响,并探讨其作用机制。方法:将SanC与同源建模所得的Runt-相关转录因子2(Runx2)蛋白结构进行分子对接。不同浓度SanC(8,16,32μmol·L^-1)和1μmol·L^-1DEX共同作用MC3T3-E1细胞,而后采用细胞增殖-毒性检测试剂盒(CCK-8)法检测SanC对MC3T3-E1成骨细胞增殖影响。试剂盒测定MC3T3-E1成骨细胞碱性磷酸酶(ALP)活性和茜素红染色检测骨矿化结节的形成。采用实时荧光定量聚合酶链反应(Real-time PCR)检测Runt-相关转录因子2(Runx2),ALP,和锌指结构转录因子(Osterix)mRNA的表达水平。蛋白免疫印迹法(Western blot)检测Runx2蛋白表达。结果:SanC与Runx2对接打分为-9.78。与正常组比较,DEX组显著降低细胞存活率(P<0.01),其中7 d存活率差异达到最大;与DEX组比较,SanC能显著促进MC3T3-E1的细胞增值(P<0.01),其中32μmol·L^-1SanC作用细胞7 d增殖率差异达到最大。与正常组比较,DEX组Runx2,ALP和Osterix mRNA的表达均有一定程度升高(P<0.05);与DEX组比较,不同浓度SanC组依赖性上调Runx2,ALP和Osterix mRNA的表达(P<0.01)。与正常组比较,DEX组Runx2蛋白表达明显下降(P<0.05);与DEX组比较,SanC干预下细胞Runx2蛋白表达显著升高(P<0.01)。结论:桑根酮C能促进MC3T3-E1成骨细胞增殖、分化和矿化,其机制可能与上调Runx2表达有关。     

左归丸通过线粒体途径抗叔丁基过氧化氢诱导的MC3T3-E1细胞凋亡

目的:观察左归丸对叔丁基过氧化氢诱导的MC3T3-E1细胞凋亡的保护效应,探讨其作用机制是否与其干预线粒体途径有关。方法:以成骨细胞MC3T3-E1为研究对象,制备左归丸含药血清,建立叔丁基过氧化氢(t-BHP)成骨细胞MC3T3-E1氧化应激模型,实验分为空白组,t-BHP组,左归丸+t-BHP组,补佳乐+t-BHP组。孵育24,48,72 h后,采用噻唑蓝(MTT)法检测左归丸含药血清对t-BHP诱导MC3T3-E1细胞存活的影响;孵育48 h后,采用吖啶橙溴乙啶(AO/EB)染色法检测细胞凋亡,采用Hoechst 33342染色法观察凋亡细胞核变化,采用罗丹明123荧光染色法观察线粒体膜电位的改变,采用蛋白质免疫印迹(Western blot)法分析线粒体蛋白家族B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2),Bcl-2相关X蛋白(Bax),半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)蛋白表达水平。结果:与空白组比较,t-BHP组显著抑制细胞增殖(P0.05,P0.01),细胞凋亡增加,线粒体膜电位降低,Bcl-2蛋白表达明显下调(P0.01);与t-BHP组比较,左归丸加t-BHP组促进暴露于t-BHP诱导的MC3T3-E1氧化损伤细胞的存活(P0.01),48 h者尤佳,逆转细胞凋亡情况,提高细胞线粒体膜电位,上调Bcl-2蛋白表达(P0.05),抑制Bax和Caspase-3蛋白表达(P0.01)。结论:左归丸含药血清能够抗t-BHP诱导的MC3T3-E1细胞凋亡,其作用机制可能与其干预线粒体途径有关。     

左归丸调控Cx43对血清饥饿诱导MC3T3-E1细胞凋亡的保护作用

目的:论证左归丸含药血清抗MC3T3-E1细胞凋亡的机制与其调控Cx43表达及功能有关。方法:将培养细胞分为:正常A组、对照B组、左归丸含药血清C组。后两组采用血清饥饿法诱导细胞凋亡。流式细胞仪检测细胞凋亡、Western blot法检测Caspase3蛋白表达;RT-PCR、Western blot法分别检测Cx43mRNA、蛋白表达;免疫荧光染色检测细胞爬片Cx43蛋白分布及定量;放免法检测细胞上清液c AMP含量。结果:左归丸可明显降低血清饥饿诱导的细胞凋亡、减少caspase3蛋白表达,B、C组比较P0.01或P0.05。血清饥饿还导致Cx43mRNA及蛋白表达、蛋白荧光分布及MOD值、细胞上清液c AMP含量显著减少,而左归丸可显著提高上述指标,B、C组比较P0.05。结论:左归丸含药血清通过调控Cx43表达及功能,发挥抗MC3T3-E1细胞凋亡的保护作用。     

沉默Cx43基因对左归丸促MC3T3-E1细胞分化作用的影响

目的:研究沉默Cx43基因对左归丸含药血清促MC3T3-E1细胞分化作用的影响。方法:采用慢病毒介导的RNA干扰技术沉默Cx43基因,将培养细胞分为正常对照A组、含药血清B组、基因沉默C组。细胞培养第3、5、7、9天进行ALP活性测定、第21天矿化结节茜素红染色,进行组间对比。结果:左归丸含药血清可以促进MC3T3-E1细胞的分化,与A组比较:ALP活性增强,其中第5、7、9天差异显著(P0.05);茜素红染色面积增加(P0.01)。C组与B组比较:ALP活性降低,其中第7、9天差异显著(P0.05);茜素红染色面积明显减少(P0.05)。结论:沉默细胞Cx43基因导致左归丸含药血清促MC3T3-E1细胞分化作用明显下降。     

莫诺苷对TNF-α诱导MC3T3-E1细胞炎症的保护作用及机制研究

目的研究莫诺苷对肿瘤坏死因子-α(TNF-α)诱导成骨细胞MC3T3-E1炎症的保护作用,探讨Caspase、MAPK和NF-κB通路调控机制。方法 TNF-α(50 ng/m L)诱导MC3T3-E1细胞,制备细胞炎症模型;MTT法检测莫诺苷对MC3T3-E1细胞增殖的影响,并检测不同浓度的莫诺苷对TNF-α诱导MC3T3-E1细胞活力的影响;ELISA法检测细胞上清液中炎性因子白细胞介素-1β(IL-1β)、IL-6的水平;Western blotting法检测Caspase-3、Caspase-9、p-ERK、p-JNK、p-p38、p-IκBα、IκBα和NF-κB等相关蛋白的表达。结果莫诺苷能够促进正常MC3T3-E1细胞增殖,TNF-α诱导MC3T3-E1细胞增殖受到抑制,而莫诺苷对TNF-α诱导MC3T3-E1细胞具有保护作用;莫诺苷可以抑制TNF-α诱导MC3T3-E1细胞IL-1β和IL-6的释放;降低Caspase-3、Caspase-9、p-ERK、p-JNK、p-p38、p-IκBα蛋白的表达,升高IκBα蛋白表达,对NF-κB p65无明显影响。结论莫诺苷对TNF-α诱导MC3T3-E1炎症细胞有保护作用,其机制为抑制炎性因子的释放、抑制MAPK和NF-κB通路的激活、抑制凋亡蛋白Caspase的表达,从而抑制MC3T3-E1细胞的凋亡。     

Effect of safflower seeds supplementation on stimulation of the proliferation, differentiation and mineralization of osteoblastic MC3T3-E1 cells

Anti-bone resorption properties of the Korean herbal formulation, Gami-Honghwain (HJ), which comprises Carthamus tinctorius L. seed and hominis placenta, were investigated. We demonstrate that the production of PGE2 is inhibited by 20-100 microg/ml HJ in nontransformed osteoblastic cells (MC3T3-E1 cells), indicating that HJ inhibits PGE2 production. The effect of HJ on the proliferation and osteoblastic differentiation in MC3T3-E1 was also studied. HJ dose-dependently increased DNA synthesis (significant at 20-100 microg/ml), and increased alkaline phosphatase (ALP) and prolyl hydroxylase activities of MC3T3-E1 cells (20-100 microg/ml), while anti-estrogen tamoxifen eliminated the stimulation of proliferation and ALP activity of MC3T3-E1 which was induced by HJ. These results indicate that HJ directly stimulates cell proliferation and differentiation of osteoblasts. Also, when we assessed the effects of HJ on osteoblastic differentiation in MC3T3-E1, HJ enhanced ALP activity and mineralization in a dose- and time-dependent fashion. This stimulatory effect of the HJ was observed at relatively low doses (significant at 20-100 microg/ml and maximal at 100 microg/ml). Northern blot analysis showed that the HJ (60 microg/ml) increased in bone morphogenetic protein-2 as well as ALP mRNA concentrations in MC3T3-E1 cells. HJ (100 microg/ml) slightly increased in type I collagen mRNA abundance throughout the culture period, whereas it markedly inhibited the gene expression of collagenase-1 between days 15 and 20 of culture. These results indicate that HJ has anabolic effect on bone through the promotion of osteoblastic differentiation, suggesting that it could be used for the treatment of common metabolic bone diseases.     

竹节参对MC3T3-E1成骨样细胞增殖与分化的影响

目的：研究竹节参不同提取物对体外培养成骨样细胞（MC3T3-E1）增殖、分化作用的影响。方法：采用MC3T3-E1细胞为体外药物筛选的细胞模型,用MTT法测定药物对成骨细胞的增殖作用,碱性磷酸酶（ALP）试剂盒测定ALP的活性,考察竹节参不同提取物对MC3T3-E1细胞增殖、分化作用的影响。结果：10^-1mg／mL的竹节参水提物和10^-4mg／mL的95％乙醇提取物能显著促进MC3T3-E1细胞的增殖和分化（P〈0．05）。结论：一定浓度的竹节参水提物和95％乙醇提取物能显著促进MC3T3-E1细胞的增殖和分化,该药物具有开发抗骨质疏松药物的潜力。     

复方丹参注射液对JNK信号通路调节人羊膜上皮细胞AQP3表达的影响

目的探讨复方丹参注射液调节人羊膜上皮细胞中水通道蛋白3（aquaporin 3,AQP3）的表达与c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase,JNK）信号通路的关系。方法分别取足月妊娠的正常羊水和羊水过少的人羊膜上皮细胞进行原代培养。将培养的正常羊水和羊水过少的人羊膜上皮细胞分别分成4个处理组：空白对照组（A组）、SP600125组（B组）、复方丹参注射液组（C组）和SP600125加复方丹参注射液组（D组）。采用cell counting kit-8（CCK-8）法检测各组细胞的活力,Western blot技术分析人羊膜上皮细胞中总JNK、磷酸化JNK（p-JNK）和AQP3蛋白的表达量。结果（1）在正常羊水及羊水过少人羊膜上皮细胞中：4组细胞活力和总JNK蛋白差异均无统计学意义（P〉0.05）。p-JNK差异有统计学意义（P〈0.05）。与A组比较,p-JNK在B组表达明显下降,而在C组中其表达明显上调（P〈0.05）。且p-JNK在D组中的表达较C组明显下降,但高于A组和B组（P〈0.05）。与A组比较,在正常羊水人羊膜上皮细胞中,C、D组中AQP3表达明显上调（P〈0.05）。但与C组比较,D组AQP3表达差异无统计学意义（P〉0.05）。而在羊水过少人羊膜上皮细胞中,B组中AQP3的表达明显下降（P〈0.05）,而C组中AQP3表达明显上调（P〈0.05）;D组中AQP3表达低于C组（P〈0.05）,但高于B组（P〈0.05）。结论羊水过少时,复方丹参注射液可通过激活JNK信号通路来调节人羊膜上皮细胞中AQP3表达的水平。     

针刺对强迫游泳应激大鼠海马c-jun氨基末端激酶信号通路的影响

目的:观察针刺对强迫游泳应激大鼠海马c-jun氨基末端激酶(JNK)信号转导通路影响,探讨针刺抗抑郁的作用机制。方法:SD大鼠随机分为空白组、空白+JNK通路阻断剂(SP 600125,以下简称SP)组、模型组、模型+SP组、针刺组、针刺+SP组、氟西汀组、氟西汀+SP组,每组6只。采用强迫游泳应激结合孤养法造模。针刺干预选取"百会""印堂"穴,每次20min,每天1次,共治疗2d;阳性对照药物给予氟西汀1.8mg/kg灌胃,每天1次,共治疗2d。通过游泳不动时间对大鼠进行行为学评价;采用Western blot法检测海马中JNK上游激酶MKK 4和MKK 7、JNK、磷酸化JNK(p-JNK)蛋白表达。结果:与空白组比较,空白+SP组游泳不动时间差异无统计学意义(P0.05),模型组游泳不动时间显著增加(P0.01);与模型组比较,模型+SP组、针刺组、针刺+SP组、氟西汀组、氟西汀+SP组游泳不动时间明显缩短(P0.05,P0.01)。不同组别之间JNK蛋白表达水平差异无统计学意义(均P0.05)。与空白组比较,模型组海马中MKK 4、MKK 7、p-JNK蛋白表达显著升高(均P0.01);与模型组比较,氟西汀+SP组MKK 4、MKK 7蛋白表达显著降低(均P0.05),其余组有降低趋势,但差异无统计学意义(均P0.05),模型+SP组、针刺组、针刺+SP组、氟西汀组、氟西汀+SP组p-JNK蛋白表达显著降低(P0.05,P0.01)。结论:针刺治疗能降低急性应激模型大鼠海马JNK的磷酸化水平及蛋白表达,有效抑制JNK信号转导通路活性,进而改善强迫游泳应激抑郁模型大鼠的行为学症状,这可能是针刺发挥抗抑郁效应的分子机制之一。     

Stimulative effects of Drynariae Rhizoma extracts on the proliferation and differentiation of osteoblastic MC3T3-E1 cells

Pharmacological factors are needed to prevent bone loss that occurs with increasing age. The chemical compounds that act on bone metabolism in herbal medicines, however, are poorly understood. Effects of traditional Korean medicine, Drynariae Rhizoma [Drynaria fortunei (kunze) J. Sm] extract (DR), on the osteoblastic proliferation and differentiation were investigated. The effect of DR, a natural phyto herb, on the proliferation and osteoblastic differentiation in non-transformed osteoblastic cells (MC3T3-E1) was studied. DR dose-dependently increased DNA synthesis (significant at 50-150 microg/ml). DR increased alkaline phosphatase (ALP) activity and prolyl hydroxylase activity of MC3T3-E1 cells (50-150 microg/ml). Antiestrogen tamoxifen eleminated the stimulation of proliferation and ALP activity of MC3T3-E1, which were induced by DR. DR at concentrations ranged from 30-100 microg/ml inhibited prostaglandin E2 production in MC3T3-E1. These results indicate that DR directly stimulates cell proliferation and differentiation of osteoblasts. These results also suggest and DR is effective for bone anti-resorptive action in bone cells.