携带人Oct4和EGFP基因慢病毒表达载体构建

目的 构建携带人Oct4和EGFP基因的慢病毒表达载体pFUOGW.方法 Sac Ⅱ线性化pLentiEF1a-Oct4-IRES-EGFP,回收片段并补平Sac Ⅱ切口,接着BamH Ⅰ酶切该片段,回收2.565 kb片段而获连接用Oct4-IRES-EGFP;EcoR Ⅰ线性化pFUGW,回收并补平EcoR Ⅰ切口,然后BamH Ⅰ酶切该片段,回收9.174 kb片段获连接用载体片段,最后使用DNA连接试剂盒(TaKaRa)中的Solution Ⅰ将其与连接用Oct4-IRES-EGFP连接,连接产物转化,次日挑选单菌落,提取质粒并行酶切鉴定.所构建载体命名为pFUOGW.获pFUOGW后,按Invitrogen公司推荐的标准程序进行慢病毒包装和确认慢病毒是否成功生产;携带Oct4和EGFP基因的慢病毒感染293FF细胞和鼻咽癌细胞株C666-1、CNEI和6-10B以建立相应病毒感染体系.结果 酶切鉴定证实成功构建了pFUOGW,按标准程序生产的携带Oct4和EGFP基因的慢病毒上清高效率感染鼻咽癌细胞株C666-1、CNE1和6-10B.结论 成功构建携带人Oct4和EGFP基因的慢病毒表达载体pFUOGW,为相关后续的研究打下良好的基础.     

正交实验法优选番石榴叶挥发油提取工艺

目的:研究番石榴叶挥发油的最佳提取工艺。方法:采用正交实验设计L9(34),以挥发油提取量为指标,确定最佳提取工艺。结果:番石榴叶粗粉加水8倍量,浸泡2h,提取5h,提取量最高。结论:该工艺为番石榴叶挥发油的最佳提取工艺。     

西黄丸含药血清对人结直肠癌细胞SW480凋亡及Bcl-2、Bax蛋白表达的影响

目的:研究西黄丸对人结直肠癌细胞SW480凋亡的影响及其作用机制的初步探讨。方法:以人结直肠癌细胞SW480为研究对象,MTT法检测不同剂量西黄丸含药血清对SW480细胞活性的影响,并用流式细胞术检测西黄丸含药血清引起的细胞凋亡率改变;用Western blot的方法检测Bax和Bcl-2蛋白表达水平,初步探讨其凋亡机制。结果:西黄丸含药血清可浓度依赖性降低SW480的细胞活力并增加细胞凋亡率,Western blot结果显示西黄丸含药血清增加了Bax蛋白表达,抑制Bcl-2蛋白表达。结论:西黄丸含药血清可抑制SW480细胞活力、诱导细胞凋亡并减小Bcl-2、Bax蛋白表达比例,其机制可能与以线粒体为核心的凋亡途径有关。     

IL-27在非小细胞肺癌患者外周血中的表达

目的探讨IL-27在非小细胞肺癌(Non-small-cell lung cancer,NSCLC)患者外周血中的表达。方法选取2012年12月²014年3月在我院就诊的NSCLC患者50例。根据NSCLC分期,分为NSCLCⅠ期组、NSCLCⅡ期组、NSCLCⅢ期组、NSCLCⅣ期组;同时选取8名健康志愿者作为对照组。采用酶联免疫吸附法检测各组研究对象外周血细胞因子IL-27、IL-12、IL-10的表达水平。结果各组外周血IL-27、IL-12、IL-10等炎症因子浓度进行比较,均存在统计学差异(p<0.05);其中NSCLCⅢ期和NSCLCⅣ期的IL-27和IL-12浓度分别较其他组明显降低(p<0.05),NSCLCⅢ期和NSCLCⅣ期的IL-10浓度分别较其他组明显升高(p<0.05)。外周血IL-27、IL-12浓度与NSCLC分期呈负相关(p<0.001),外周血IL-10浓度与NSCLC分期呈正相关(p<0.001)。结论 IL-27可能参与了NSCLC相关炎症反应,IL-27可能是NSCLC治疗的潜在药物。     

携带人Oct4和EGFP基因慢病毒表达载体构建

目的构建携带人Oct4和EGFP基因的慢病毒表达载体pFUOGW。方法SacⅡ线性化pLenti-EF1a-Oct4-IRES-EGFP,回收片段并补平SacⅡ切口,接着BamHⅠ酶切该片段,回收2.565kb片段而获连接用Oct4-IRES-EGFP;EcoRⅠ线性化pFUGW,回收并补平EcoRⅠ切口,然后BamHⅠ酶切该片段,回收9.174kb片段获连接用载体片段,最后使用DNA连接试剂盒（TaKaRa）中的SolutionⅠ将其与连接用Oct4-IRES-EGFP连接,连接产物转化,次日挑选单菌落,提取质粒并行酶切鉴定。所构建载体命名为pFUOGW。获pFUOGW后,按Invitrogen公司推荐的标准程序进行慢病毒包装和确认慢病毒是否成功生产;携带Oct4和EGFP基因的慢病毒感染293FT细胞和鼻咽癌细胞株C666-1、CNE1和6-10B以建立相应病毒感染体系。结果酶切鉴定证实成功构建了pFUOGW,按标准程序生产的携带Oct4和EGFP基因的慢病毒上清高效率感染鼻咽癌细胞株C666-1、CNE1和6-10B。结论成功构建携带人Oct4和EGFP基因的慢病毒表达载体pFUOGW,为相关后续的研究打下良好的基础。     

西黄丸含药血清对SW480人结肠癌细胞迁移及侵袭的影响

目的:研究西黄丸对人结肠癌细胞SW480迁移及侵袭的影响,并初步探讨其作用机制。方法:以人结肠癌细胞SW480为研究对象,细胞划痕试验检测不同剂量西黄丸含药血清对SW480细胞迁移的影响,并Transwell侵袭实验检测西黄丸含药血清对细胞侵袭能力的改变;用Western blot的方法检测细胞外调节蛋白激酶(ERK)和p-ERK蛋白表达水平,RTq PCR法检测E-钙黏蛋白(E-cadherin),多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶1(PARP-1)、波形蛋白(Vimentin)和转录因子Snail的mRNA水平。结果:与空白组比较,西黄丸含药血清可降低SW480细胞迁移及侵袭的能力,增加E-cadhenrin mRNA表达水平,并抑制PARP-1,Vimentin和Snail mRNA表达水平,明显降低ERK蛋白的磷酸化水平,均具有统计学意义(P0.05)。结论:西黄丸含药血清可抑制SW480细胞的体外侵袭及迁移,并影响上皮-间皮转化(EMT)相关基因E-cadherin,PARP-1,Vimentin和Snail的mRNA表达,其机制可能与ERK/MAPK信号通路有关,本研究为西黄丸抑制结肠癌转移提供了科学证据。     

大孔吸附树脂纯化番石榴叶总皂苷的工艺研究

目的:研究SA 1型大孔吸附树脂吸附提取番石榴叶总皂苷的工艺条件及参数.方法:以番石榴叶总皂苷为考察指标,研究树脂吸附容量、洗脱溶媒及其用量等工艺条件.结果:通过SA 1型大孔树脂吸附后,先经3倍BV(床体积)水洗,再以800 ml/L乙醇为洗脱溶媒.4倍BV洗脱效果最佳,总皂苷纯度可达55.3%.结论:此法能较好地分离纯化番石榴叶总皂苷,是简便、可行的提取方法.     

贝伐单抗联合培美曲塞维持治疗对晚期非鳞状非小细胞肺癌患者循环microRNA-19以及白细胞介素-27表达的影响

目的：探讨贝伐单抗联合培美曲塞维持治疗晚期非鳞状非小细胞肺癌疗效及对循环microRNA（ miR）-19和白细胞介素（ interleukin,IL）-27表达水平的影响。方法选择2013年3月至2014年3月入住该院的经一线含铂类方案化疗获得控制的晚期非鳞状非小细胞肺癌患者45例,遵循知情同意原则分为培美曲塞组（25例）和贝伐单抗联合培美曲塞组（20例）;分别观察1年内两组疗效以及患者外周血miR-19、IL-27的表达。结果培美曲塞联合贝伐单抗组和培美曲塞组的疾病控制率分别为80％和48％,总有效率分别为45％和24％,两组间疾病控制率和总有效率比较均存在统计学差异（P＜0．05）;培美曲塞联合贝伐单抗组外周血miR-19表达约是培美曲塞组的0．57倍,两组间相比存在统计学差异（P＜0．05）。与培美曲塞组相比,培美曲塞联合贝伐单抗组外周血IL-27表达升高,两组间相比存在统计学差异（P＜0．05）。结论贝伐单抗联合培美曲赛维持治疗有助于改善晚期非鳞状非小细胞肺癌的治疗效果,降低外周血miR-19、升高IL-27的表达。     

Sestrin2在miR-19诱导的非小细胞肺癌细胞上皮-间质转化中的表达及六神丸干预研究

目的 探讨Sestrin2在六神丸调控miR-19诱导的非小细胞肺癌细胞上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)中的作用.方法 实验分为对照组、miR-19过表达组、六神丸组.对照组为常规血清培养的A549细胞;miR-19过表达组为常规血清培养的过表达miR-19 A549细胞;六神丸组予以六神丸含药血清干预过表达miR-19 A549细胞.48 h后分别以CCK-8检测A549细胞增殖,Transwell小室检测A549细胞迁移能力,实时荧光定量PCR(quantitative Real-time PCR,qRT-PCR)检测miR-19表达,蛋白印迹检测Sestrin2、PTEN以及EMT标记分子E-cadherin、Vimentin的表达.结果 细胞计数试剂盒-8(cell counting kit-8,CCK-8)检测结果显示,六神丸组A549细胞增殖速度较对照组、miR-19过表达组明显减慢;Transwell小室实验显示,六神丸组A549细胞迁移数量较miR-19过表达组、对照组明显减少;qRT-PCR检测结果显示,六神丸组A549细胞中miR-19表达较miR 19过表达组、对照组明显降低;Western blot检测结果显示,与对照组、miR-19过表达组相比,六神丸组A549细胞中Sestrin2、E-cadherin、PTEN表达明显上调,Vimentin表达明显下调.结论 六神丸能够抑制miR-19诱发的人肺腺癌细胞株A549发生EMT,与激活Sestrin2信号通路有关.