人正常软骨细胞和骨性关节炎软骨细胞体外培养对照研究

目的:对人正常软骨细胞和骨关节炎软骨细胞进行体外培养,并就其2组在传代过程中生物学特性变化进行比较和评价。方法:酶两步顺序消化法消化关节软骨分离细胞;体外传代培养观察细胞形态、生长,MTT法测定增殖,甲苯胺蓝和Ⅱ型胶原免疫组化染色,从蛋白和基因水平检测Ⅱ型胶原、蛋白多糖的变化,以及用流式细胞仪检测细胞凋亡。结果:①骨性关节炎软骨细胞形态似成纤维细胞,生长速度明显较正常软骨细胞慢。②MTT检测骨关节炎组2、4、6代软骨细胞增殖均低于正常组(P0.05),Ⅱ型胶原免疫组化和甲苯胺蓝O染色均较弱,传至第4代软骨细胞生物学特性基本消失。③2、4代骨关节炎软骨细胞凋亡率明显高于正常软骨细胞(P0.05)④各代骨性关节炎软骨细胞Ⅱ型胶原和蛋白多糖表达量都不如正常软骨细胞。结论:体外培养的人骨性关节炎软骨细胞符合软骨细胞退变的表现,能很好的为骨关节炎细胞水平的研究提供最佳实验对象。     

桃仁膝康丸治疗骨性关节炎机制的网络药理学分析与验证

目的:以网络药理学方法探讨桃仁膝康丸治疗骨性关节炎的可能作用机制。方法:通过中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP)搜索和筛选出桃仁膝康丸活性成分及作用靶点,检索GeneCards、OMIM和CTD数据库获得与骨性关节炎相关的非重复靶点,取交集获取中药抗骨性关节炎相关的药物活性成分靶点,使用String软件构建蛋白质-蛋白质相互作用网络,利用Cytoscape 3.8.2软件构建蛋白质-蛋白质相互作用网络图,筛选核心靶点和构建药物-活性成分-骨性关节炎相关靶点网络;借助DAVID数据库进行基因本体论(GO)富集分析和京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析;将活性成分与预测疾病核心靶点进行分子对接验证;免疫印迹法(Western Blot)验证对细胞凋亡效应蛋白半胱氨酸蛋白酶(Caspase,CASP)3靶点的干预。结果:从桃仁膝康丸中筛选出53个活性成分,主要作用于骨性关节炎相关55个的靶点,靶标作用主要涉及细胞凋亡、炎症、细胞自噬、细胞老化、活性氧代谢、免疫生物过程和通路;分子对接结果发现活性成分与核心靶标结合性能良好;Western Blot结果显示,桃仁膝康丸能显著抑制CASP3活化。结论:桃仁膝康丸治疗骨性关节炎是多靶点、多通路的复杂机制过程,可能主要与抗细胞凋亡、抗炎、诱导细胞自噬、阻滞细胞老化、抗氧化、抑制免疫相关。     

基于网络药理学与分子对接探讨木瓜治疗膝骨关节炎的分子机制

目的:基于网络药理学探索木瓜治疗膝骨性关节炎的分子作用机制。方法:基于口服生物利用度(OB)及药物相似性(DL),通过中药系统药理学数据库(TCMSP)筛选木瓜的主要活性成分。运用GeneCards、OMIM数据库建立膝骨性关节炎靶标数据库。通过Cytoscape 3.7.1软件构建"活性成分-作用靶标-疾病"可视化交互网络;运用STRING数据库构建蛋白互作网络,分析相关蛋白互作关系;对核心靶点进行京都基因与基因百科全书(KEGG)通路及基因本体(GO)生物过程富集分析。通过Discovery Studio软件对药物活性成分与疾病靶点进行分子对接验证。结果:筛选得到木瓜活性成分3个,涉及44个作用靶点。网络分析结果表明,靶点主要涉及调节细胞代谢、凋亡等生物学过程,通过调节细胞凋亡、肿瘤坏死因子(TNF)、p53、核转录因子-κB(NF-κB)、糖基化终末产物(AGE)及其受体(RAGE)等信号通路来发挥治疗膝骨关节炎的作用。分子对接结果表明,木瓜活性成分与膝骨性关节炎的血管内皮生长因子A(VEGFA)、白细胞介素-6(IL-6)、雌激素受体1(ESR1)等靶点对接吻合度较好。结论:木瓜治疗膝骨性关节炎具有多系统、多成分、多靶点的特点;其可能的作用机制包括控制炎症,调控关节软骨代谢、生长和修复,促进细胞增殖、分化,抑制细胞凋亡和抵抗氧化应激等以达到控制疾病发生发展的目的;木瓜中槲皮素、白桦脂酸、表儿茶酸等活性成分可能是其治疗膝骨性关节炎的物质基础。     

caspase-3在骨性关节炎发病中的作用

目的探讨骨性关节炎(0A)发病机制,为临床治疗OA提供理论依据。方法超负荷运动法构建OA模型,并用HE染色观察关节组织形态改变、TUNEL检测软骨细胞凋亡、荧光分光光度计分析软骨细胞capase-3蛋白活性、RT-PCR来检测capase-3 mRNA的表达量。结果①形态学:与对照组相比,OA模型的关节软骨echt分级评分较高,并且与OA模型超负荷运动量呈正相关;②随关节损伤加重,OA各组细胞凋亡、细胞内caspase-3蛋白活性及caspase-3-mRNA表达量增加。结论超负荷运动是导致骨性关节炎发生的原因之一,caspase-3激活引起的细胞凋亡在骨性关节炎的发生中起重要作用。     

刺老苞根皮黄酮对兔骨性关节炎软骨细胞增殖与凋亡影响的研究△

目的：通过观察刺老苞根皮黄酮对新西兰兔骨性关节炎模型的软骨细胞增殖与凋亡基因表达的影响,初步探索其干预软骨细胞代谢的作用机制。方法：取5月龄新西兰兔骨性关节炎模型的膝关节软骨建立软骨细胞体外培养体系,分别采用MrITll法、TUNEL法、免疫组化法对细胞增殖、凋亡及细胞周期调控基因Bax、Bcl-2、Caspase-3、p53mRNA的表达进行检测。结果：不同剂量组刺老苞根皮黄酮可显著促进软骨细胞体外增殖,并可通过减弱软骨细胞Bax、Caspase-3、p53mRNA的表达,增强Bcl-2mRNA的表达来减缓软骨细胞凋亡进程。结论：刺老苞根皮黄酮可有效调控兔骨性关节炎软骨细胞代谢,增强细胞活性,延缓凋亡,具有研发成为骨性关节炎治疗药物的潜能。     

虾青素对兔骨性关节炎软骨细胞增殖与凋亡影响的研究

目的通过观察虾青素对新西兰兔骨性关节炎模型的软骨细胞增殖与凋亡基因表达的影响,初步探索其干预软骨细胞代谢的作用机制。方法取5月龄新西兰兔骨性关节炎模型的膝关节软骨建立软骨细胞体外培养体系,分别采用MTT法、TUNEL法、免疫组化法对细胞增殖、凋亡及细胞周期调控基因Bax、Bcl-2、Caspase-3、p53 mRNA的表达进行检测。结果不同剂量组虾青素可显著促进软骨细胞体外增殖,并可通过减弱软骨细胞Bax、Caspase-3、p53 mRNA的表达,增强Bcl-2 mRNA的表达来减缓软骨细胞凋亡进程。结论虾青素可有效调控兔骨性关节炎软骨细胞代谢,增强细胞活性,延缓凋亡,具有研发成为骨性关节炎治疗药物的潜能。     

鹿茸多肽对兔骨性关节炎软骨细胞的影响

目的:观察鹿茸多肽对兔骨性关节炎软骨细胞的影响。方法:参考Hulth法建立骨性关节炎模型,给予不同浓度的鹿茸多肽进行干预,分别进行MTT法检测、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测,获得鹿茸多肽对软骨细胞作用。结果:鹿茸多肽对骨性关节炎软骨细胞有一定的增殖作用,骨性关节炎软骨细胞直接分泌到胞外的基质金属蛋白酶含量变化不明显,骨性关节炎软骨细胞核酸中金属蛋白酶有一定表达。结论:骨性关节炎软骨细胞在正常分化及增殖发生改变过程中,其软骨基质的降解是金属蛋白酶与其它因子协同作用的结果;鹿茸多肽有促进骨性关节炎软骨细胞增殖作用,并可抑制骨性关节炎软骨细胞中金属蛋白酶的过度表达,可能对治疗骨性关节炎有较好的作用。     

姜黄素治疗骨性关节炎药理的研究进展＊

姜黄素是中药姜黄的主要活性成分，大量药理研究提示姜黄素具备成为临床治疗骨性关节炎药物的潜力。其作用机制主要包括通过阻断炎症因子介导的NF-κB、NLRP3等信号通路抑制炎症和通过清除自由基、增强抗氧化酶活性抑制氧化，保护软骨免收损伤；通过上调整合素等蛋白水平促进软骨基质修复；通过促进自噬和增加抗凋亡蛋白活性抑制软骨细胞凋亡；通过调节Wnt信号通路影响软骨细胞增殖等。多个临床随机、对照试验亦支持其治疗骨性关节炎的效果。现综述近年来有关姜黄素治疗骨性关节炎研究的成果、问题与对策，为进一步研究与应用提供理论依据。     

补肾活血中药龙鳖制剂干预野生型TDP43介导的骨性关节炎软骨细胞病变的作用研究

目的:分析补肾活血中药龙鳖对TDP-43引起骨性关节炎应急反应的软骨细胞病变的干预作用。方法:通过构建TDP43慢病毒载体并转染人软骨细胞,流式细胞检测分析凋亡水平,连续细胞计数分析其细胞增殖水平,荧光定量PCR检测关键基因表达水平;采用软骨细胞培养液中加入低、中、高剂量龙鳖进行干预,分析TDP43慢病毒转染软骨细胞后的凋亡和增殖生长水平。结果:人软骨细胞转染包装好的TDP43慢病毒后,高表达TDP43基因和I型胶原蛋白α1。TDP43慢病毒转染的软骨细胞体外连续培养软骨细胞7 d后,软骨细胞出现晚期凋亡和死亡现象而抑制了细胞增殖。龙鳖加入培养后软骨细胞呈生长趋势,TDP43慢病毒转染的软骨细胞凋亡显著下降而显著提高了其增殖水平。结论:转染TDP43慢病毒软骨细胞表达TDP43引起了细胞凋亡和抑制其增殖,TDP43可能在骨性关节炎发病过程中取到负调控的作用,而中药龙鳖制剂可显著改善这一过程。     

髋关节正常软骨与骨性关节炎软骨相关因子表达的对照研究

目的:对人髋关节正常关节软骨和骨关节炎关节软骨进行对比研究,对骨性关节炎生物学特性及炎症因子变化进行比较和评价。方法:选取股骨颈骨折排除关节炎的病例及骨性关节炎病例各22例,分为2组,正常关节软骨组及骨性关节炎软骨组。1)大体及组织染色的方法(甲苯胺蓝和Masson染色)观察骨性关节炎组及正常软骨组的组织形态、糖胺多糖及胶原蛋白含量。2)Western blot检测两组关节软骨中CollagenⅡ,Aggrecan,MMP-13,Caspase3和Cleaved caspase3蛋白表达量。3)ELISA法检测两组关节液中TNF-α的表达水平。结果:1)两组组织染色分别显示蛋白多糖和胶原纤维含量:骨性关节炎组比正常关节软骨组均明显减少。2)Western blot检测显示MMP-13,Caspase3和Cleaved caspase3各蛋白含量在骨性关节炎组中明显升高,差异有统计学意义(P0.05)。3)Western blot检测显示Ⅱ型胶原和蛋白多糖蛋白表达量在骨性关节炎组中明显下降,差异有统计学意义(P0.05)。4)ELISA法检测提示骨性关节炎组关节液中TNF-α的表达水平较正常组明显上升,差异有统计学意义(P0.05)。结论:骨性关节炎的病理过程是多种炎症因子调节下引起关节软骨细胞的凋亡,进而引起的软骨基质成分合成-分解代谢的平衡破坏的过程。     

膝关节骨性关节炎病变与细胞凋亡及相关基因表达关系

软骨细胞凋亡在骨性关节炎的发病中具有重要作用,其凋亡的途径有NO途径和Fas途径;主要受Bcl-2基因家族、Bax、P53、和ICE基因家族调控;软骨细胞外基质的降解,可诱导软骨细胞凋亡。     

“双固一通”温针灸对实验性兔膝骨性关节炎软骨细胞凋亡的影响

目的:研究"双固一通"温针灸在预防兔膝关节骨性关节炎过程中对兔膝关节软骨细胞凋亡的影响。方法:24只日本大耳白兔随机分为"双固一通"温针灸组、模型组和正常组,每组8只。采用结扎股静脉法建立兔膝骨性关节炎模型,"双固一通"温针灸组在造模开始时采用"双固一通"温针灸法,对关元(CV 4)、足三里(ST 36)、内膝眼(EX-LE4)、犊鼻(ST 35)和阳陵泉(GB 34)等穴进行预防性治疗;正常组不做任何处理,正常喂养。在造模8周后,各组分别通过透射电镜观察兔膝关节软骨细胞的超微结构,TUNEL染色光镜下观察软骨细胞凋亡情况。结果:"双固一通"温针灸组兔膝关节软骨细胞超微结构接近正常组,模型组软骨细胞轮廓不清楚,胞膜坏死崩解,胞浆内细胞器消失,细胞裂解为致密颗粒样物质,细胞固缩、变形,甚至出现核分裂,染色质浓聚;"双固一通"温针灸组和模型组软骨细胞凋亡指数高于正常组(P<0.01),"双固一通"温针灸组软骨细胞凋亡指数低于模型组(P<0.01)。结论:"双固一通"温针灸可抑制实验性兔膝骨性关节炎软骨细胞过度凋亡,从而对兔膝骨性关节炎起防治作用。     

以改良Hulth法建立兔膝骨性关节炎关节软骨的病理变化

目的：观察以改良Hulth法建立的兔膝骨性关节炎关节软骨的病理变化,以探讨其病变机制。方法：采用改良Hulth法建立兔膝骨性关节炎模型,利用＂测定双足平衡设备＂检测和评价兔膝关节功能变化,肉眼观察兔膝关节大体结构。组织切片苏木精-伊红染色,光镜下观察关节软骨组织结构,应用显微电脑测量软件测量关节软骨厚度。运用TUNEL法检测软骨细胞的凋亡,并应用透射电镜观察关节软骨超微结构的变化。结果：模型组右侧（患侧）膝关节蜷缩、无力,检测显示以左侧后足承重为主。模型组兔膝关节软骨出现退变的表现,软骨细胞过度凋亡,其凋亡指数明显高于正常组（P〈0.05）。模型组膝关节软骨厚度较正常组有明显减小（P〈0.05）。模型组关节软骨超微结构明显受损,软骨细胞出现核固缩,线粒体肿胀,粗面内质网扩张、脱颗粒;软骨基质内胶原纤维断裂溶解,结构模糊。结论：采用改良Hulth法可以成功复制膝骨性关节炎模型,模拟临床膝骨性关节炎的病理变化。     

督脉电针对颅脑损伤大鼠48h后差异蛋白组学的机理研究

目的:观察督脉电针对颅脑损伤大鼠差异蛋白组学变化的实验研究。方法:大鼠随机分为空白组、模型组、电针组,每组15只,共45只。参照Feeney等研制的鼠颅脑创伤模具改良式打击装置造模。术后48 h取损伤区颅脑组织称重,保存。对样本蛋白进行提取、定量、蛋白双向电泳图像分析,找出差异点进行质谱分析和数据库检索。结果:成功鉴定出7种蛋白质:假定蛋白、热休克蛋白8、微管蛋白β-5、锌指蛋白233、分泌颗粒素Ⅱ、醛缩酶A、热休克蛋白70。结论:针刺对急性颅脑损伤大鼠具有治疗效果。鉴定出的蛋白质可能通过引起炎症细胞浸润、神经细胞凋亡等途径参与了CCI的损伤及修复过程。     

加味阳和汤对膝骨性关节炎软骨细胞凋亡的影响研究

目的:观察加味阳和汤对膝骨关节炎兔关节软骨骨形态发生蛋白-2(BMP2)及Sry相关组蛋白9(Sox9)表达的影响。方法:将健康新西兰大白兔随机分为正常组、模型组和实验组。除正常组外,其余2组动物均按照改良赫尔特法(Hulth法)制作膝骨关节炎模型后,分组处理,4,6,8周后取材,制作标本,行免疫组化染色观察Ⅱ型胶原(ColⅡ)的变化、实时聚合酶链反应(PCR)监测软骨组织中BMP2和Sox9的表达情况、TUNEL监测软骨组织中软骨细胞凋亡情况。结果:正常组Ⅱ型胶原的表达量最高,模型组表达量最少,骨性关节炎时间越长阳性染色越浅,同一时间段内实验组染色较好,且分布较均匀;BMP2在正常软骨中少量表达,而在骨性关节炎软骨中有大量表达,骨性关节炎时间越久,BMP2的表达量越多,同一时间段内实验组的BMP2的表达量比模型组低;而Sox9在正常组中有大量表达,而在模型组中表达量明显减少,在同一时间段内实验组均较模型组的表达量增高。正常组软骨中凋亡的软骨细胞数量较少,而在模型组中同一时间段内软骨细胞凋亡数量较正常组明显增加,骨性关节炎时间越久凋亡细胞数量越多,实验组经治疗后细胞调亡数量减少。结论:加味阳和汤能够下调膝关节中BMP2的表达量,上调Sox9的表达量,从而减缓骨性关节炎软骨退变,促进Ⅱ型胶原的表达,进而减少软骨细胞的凋亡。     

温补肾阳药对激素依赖性肾阳虚动物肝线粒体蛋白质组影响的研究

 目的利用双向凝胶内差异显示电泳技术,分析温补肾阳药对激素依赖性肾阳虚动物肝线粒体蛋白质组影响。方法正常大鼠、肾阳虚大鼠及温补肾阳药治疗大鼠肝线粒体蛋白质样品分别用荧光染料Cy2,Cy3,Cy5标记,经双向电泳后用不同波长光激发扫描后得到不同样品的蛋白质组图谱,经DeCyder软件分析,以肾阳虚动物与正常动物肝线粒体蛋白质相差1.2倍以上的蛋白作为差异蛋白,共获得16个差异蛋白质,经质谱测定和与蛋白质文库比对,其中11个蛋白质得到鉴定。结果肾阳虚动物由于肾上腺皮质功能受损,引起热休克蛋白60和70含量增加,可能起到调整处于应激状态的细胞存活、保护细胞免受损伤的作用;肾阳虚动物糖代谢和脂代谢功能降低,而蛋白质代谢和核酸代谢功能增强,表现为二氢硫辛酰胺脱氢酶和脂酰辅酶A脱氢酶活性降低,而肌氨酸脱氢酶、氨甲酰磷酸合成酶和亚硫酸氧化酶活性增加;肾阳虚动物由于三羧酸循环和脂肪酸β-氧化功能障碍,引起ATP合酶、醛脱氢酶和NADH脱氢酶活性代偿性增加,试图通过增加ATP的产量以缓解能量代谢的不足;但肾阳虚动物由于鸟氨酸氨基转移酶活性降低,导致储存能量的肌酸合成降低,使产生的ATP大部分通过热能形式消耗掉,从而导致肾阳虚的临床虚寒症状。应用温补肾阳药治疗后使热休克蛋白60更趋增加,可能加强对细胞的保护作用;温补肾阳药增加二氢硫辛酰胺脱氢酶的活性,可通过改善糖代谢和促进三羧酸循环功能使机体的能量代谢增强;温补肾阳药还可以通过增加ATP合酶和醛脱氢酶的含量,使ATP的产量增加,缓解能量代谢功能障碍。结论温补肾阳药可以通过调整线粒体内多种与能量代谢相关蛋白质表达而起到治疗肾阳虚的作用。     

基于网络药理学探讨牛膝治疗膝骨性关节炎的有效物质与作用机制研究

目的:采用网络药理学和生物系信息学方法筛选中药牛膝治疗膝骨性关节炎的主要成分、作用靶点和作用机制。方法:通过中药系统药理学数据库和分析平台获取牛膝化学成分,根据口服药物生物利用度和类药性分别筛选其有效活性成分并预测其作用靶点;通过Gene Cards、OMIM数据库检索膝骨性关节炎发病相关基因,应用VENNY 2. 1. 0构建牛膝治疗膝骨性关节炎靶点;应用Cytoscape 3. 7. 1软件构建药物-成分-靶点-疾病调控网络;通过SPRING构建PPI网络图并进行核心网络可视化展示;将药物-疾病关键靶点蛋白进行GO功能和KEGG通路富集分析。结果:槲皮素、山奈酚、黄芩素是牛膝治疗膝骨性关节炎的关键化合物,IL-6、IL-1β、JUN、CXCL8、CCL2、IL-10是牛膝治疗膝骨性关节炎的关键靶点,GO富集分析显示牛膝治疗膝骨性关节炎关键靶点涉及生物过程条目有1080条,细胞组成条目有8条,分子功能条目有36条,KEGG通路分析显示AGEs-RAGE、IL-17、TNF是牛膝治疗膝骨性关节炎的主要机制通路。结论:牛膝可以通过多成分、多靶点、多通路机制协同治疗膝骨性关节炎。     

六味地黄汤对甲亢型肾阴虚大鼠肝线粒体蛋白质组的影响

目的 应用双向电泳技术和质谱技术研究六味地黄汤对甲亢型肾阴虚大鼠肝线粒体蛋向质组的影响.方法 双向电泳分离甲状腺素造成的肾阴虚模型和六味地黄汤治疗大鼠肝线粒体蛋白质,银染后扫描得到蛋白质组图谱,用Image Master2D6.0软件进行差异蛋白质组分析,筛选差异在2倍以上的蛋白质进行质谱鉴定和生物信息学分析.结果 大鼠Major urinary protein precursor、Peroxiredoxin-6、内质网蛋白29前体、大鼠转甲状腺素蛋白D链表达升高,78 kDa葡萄糖调节蛋白前体、谷胱甘肽硫转移酶Mu 1、热休克蛋白60、肽基脯氨酰顺反式异构酶、核转录因子-κB 2、H~+-转运ATP合酶、BNIP1 protein表达均降低.结论 六味地黄汤滋阴补肾作用机理可能与下调线粒体内H~+-转运ATP合酶表达量从而减缓能量代谢、抑制NF-κB过量表达和活化以调节炎性细胞因子紊乱状态和凋亡抑制状态、上调PDX6表达对抗氧自由基损伤以及增强性激素分泌水平相关.     

中药外治膝骨关节炎作用机制的研究进展

膝骨性关节炎是常见的关节病之一,临床上其治疗方法多种多样。目前,西医治疗措施尚存在一定的局限性,而中医外治法运用整体观念、辨证论治为膝骨性关节炎的治疗及防治开辟一个广阔的前景。本文通过检索近年来中医外治法治疗膝骨性关节炎的相关研究,分别从抑制炎性因子表达;促进软骨细胞增殖、抑制软骨细胞凋亡;细胞外基质的降解与合成;促进透明质酸的分泌,减少血清中透明质酸的含量;改善局部微循环,降低骨内高压等方面对其加以阐述,综述其研究进展,进一步为膝骨性关节炎在临床治疗上提供更好的参考和指导。     

川芎嗪注射液对体外培养软骨细胞影响的实验研究

目的探讨川芎嗪对骨性关节炎的药理效应及作用机理.方法采用家兔关节软骨细胞体外培养模型,加入不同浓度的川芎嗪药物,观察软骨细胞的增殖及总蛋白的合成.结果川芎嗪不影响软骨细胞的活性.8%的川芎嗪可显著提高体外培养关节软骨细胞的增殖.4%～16%的川芎嗪对细胞蛋白质合成有促进作用,与对照组相比有非常显著意义.结论川芎嗪的有效成分可促进软骨细胞分泌合成代谢因子,刺激细胞增殖和蛋白质合成.