蝎毒抗癌多肽组分Ⅲ的分离方法研究

目的：探索蝎毒抗癌多肽组分Ⅲ的分离和纯化方法：方法：蝎毒经预处理后,分别采用ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦ阳离子交换凝胶柱层析法和ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦ阳离子交换凝胶柱ｅｐｈａｄｅｘＧ－５０凝胶柱联合层析法,分离ＡＰ－Ⅲ,用ＨＰＬＣ仪检测２种方法分离出的ＡＰ－Ⅲ的纯度及产率。结果：单独用ｅｐｈａｒｏｓｅＦＦ阳离了交换凝胶柱分离,ＡＰ－Ⅲ产率为２．２４％,纯度为８９％。ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－５０凝胶柱与Ｓｅｐ     

Searose FF凝胶柱分离参数变化对蝎毒抗癌多肽纯化的影响

目的优选蝎毒抗癌多肽(antineoplasticpolypeptidefromButhusmartensiivenom,APBMV)组分Ⅲ(antineoplas-cpolypeptide-ⅢfromAPBMV,AP-Ⅲ)的分离参数。方法采用不同长度的SepharoseFF阳离子交换凝胶柱及不同的样品洗脱速度,比较AP-Ⅲ的分离效果。结果当柱长为em,直径为5cm,流速为1．0ml／min时,可分离出6个峰,AP-Ⅲ纯度为89％;分别以0．8,0．5和0．2ml／min流速进行层析,可分别分离出6,4,3个峰,AP-Ⅲ相应的纯度为89％,85％,83％。当柱长为12．5cm,而其他条件相同时,均得到2个峰,相应的AP-Ⅲ纯度分别为83％,82％,％和78％。结论分离、纯化AP-Ⅲ较理想参数为柱长25cm,直径5em,流速0．8ml／min,梯度洗脱时间1200min。     

蝎毒抗癌多肽及其分离组分分析及鉴定方法

目的 :探讨蝎毒抗癌多肽 (antineoplasticpolypeptidefromButhusmartensiivenom ,APBMV)及其分离组分的分析及鉴定方法。方法 :采用SepharoseFF阳离子交换凝胶柱 (2 5cm× 5cm交换柱 ,流速 0 .8ml/min ,梯度洗脱 12 0 0min)层析法分离APBMV ,用高效毛细管电泳 (highperformancecapillaryelectrophoresis,HPCE)及高效液相色谱法 (highperformanceliquidchromatography ,HPLC)分析检测。结果 :用SepharoseFF阳离子交换凝胶层析可将APBMV分离为 2个峰。经HPCE、HPLC分析显示 ,APBMV主要成分为峰Ⅰ～Ⅳ ,其分离组分分别以峰Ⅰ或峰Ⅲ为主 ,其纯度分别为86 .35 %、6 9.5 7%。结论 :SepharoseFF用于进一步分离APBMV可望获得较高纯度的单一有效成分 ,HPCE及HPLC均可较好地显示蝎毒中小分子多肽的组成及相对含量 ,其结果基本一致     

SepharoseFF凝胶柱分离参数变化对蝎毒抗癌多肽纯化的影响

目的：优选毒抗癌多肽组分Ⅲ的分离参数,方法：Ｅ 同长度的ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦ阳离子交换凝胶柱及不同样品洗脱速度,比较ＡＰ－Ⅲ的分离效果。结果：当柱长为２５ｃｍ,直径为５ｃｍ,流速为１．０ｍｌ／ｍｉｎ时,可分离,ＡＰ－Ⅲ纯度为８９％;分别０．８,０．５和０．２ｍｌ／ｍｉｎ流速进行层析,可分别同６,４,３个峰,ＡＰ－Ⅲ相应的纯度为８９％,８５％,８３％。当柱长为１２．５ｃｍ,而其他条件相同时,得到     

Sepharose FF凝胶柱分离参数变化对蝎毒抗癌多肽纯化的影响

目的 :优选蝎毒抗癌多肽 (antineoplasticpolypeptidefromButhusmartensiivenom ,APBMV)组分Ⅲ (antineoplas ticpolypeptide ⅢfromAPBMV ,AP Ⅲ )的分离参数。方法 :采用不同长度的SepharoseFF阳离子交换凝胶柱及不同的样品洗脱速度 ,比较AP Ⅲ的分离效果。结果 :当柱长为 2 5cm ,直径为 5cm ,流速为 1 .0ml/min时 ,可分离出 6个峰 ,AP Ⅲ纯度为 89% ;分别以 0 .8,0 .5和 0 .2ml/min流速进行层析 ,可分别分离出 6 ,4,3个峰 ,AP Ⅲ相应的纯度为89% ,85 %、83%。当柱长为 1 2 .5cm ,而其他条件相同时 ,均得到 2个峰 ,相应的AP Ⅲ纯度分别为 83% ,82 % ,80 %和 78%。结论 :分离、纯化AP Ⅲ较理想参数为柱长 2 5cm ,直径 5cm ,流速 0 .8ml/min ,梯度洗脱时间 1 2 0 0min。     

蝎毒及其分离组分对4种肿瘤细胞生长的抑制作用

目的:观察蝎毒(scorpion venom,SV)及其分离组分对4种人肿瘤细胞(肺癌A549细胞、人低分化胃腺癌细胞BGC-823、人肝癌细胞SMMC-7721、人骨髓细胞白血病细胞HL-60)生长的抑制作用.方法:采用Sephadex G-50柱层析法分离蝎毒;用MTT法检测肿瘤细胞的存活率.分别以丝裂霉素C(MMC)及顺铂(C-DDP)为阳性对照药,以蝎毒及其组分1 mg/L、10mg/L和100mg/L的浓度处理4种人肿瘤细胞,作用48 h后,分别观察蝎毒及其分离各组分对上述细胞的影响.结果:用Sephadex G-50柱层析法分得6个峰(AP Ⅰ1,APⅠ2,APⅡ,APⅢ1,APⅢ2,APⅣ),其中蝎毒组分APⅢ1(antineoplastic polypeptideⅢ1)对HL-60,SMMC-7721,BGC和A549细胞生长有明显的抑制作用,与对照组比较差异有显著性(P＜0.05,或P＜0.01).对A549细胞和HL-60细胞具有较好的剂量-效应关系.结论:蝎毒分离6个组分中,蝎毒组分APⅢ1对HL-60,SMMC-7721,BGC和A549 4种人肿瘤细胞具有明显的生长抑制作用,剂量效应关系明显.     

转基因西洋参冠瘿组织中多糖的分离和纯化

目的分离纯化转基因西洋参冠瘿组织中多糖组分,为从该转基因材料中寻找重要生物活性前体多糖药物提供科学依据。方法用水醇提取法,以DEAE Sepharose FF和Sephacryl S-100柱色谱进行多糖的分离纯化,采用高效液相色谱测定单糖组成,色谱和光谱学方法鉴定其纯度和化学结构。结果分离得到4个精多糖(PPQ50-1、PPQ50-2、PPQ70-1和PPQ70-2),凝胶色谱法(Sephadex G-200)和旋光法证实了它们为化学均一性多糖;凝胶色谱法测得4种精多糖的相对分子质量分别为4.7×104,2.9×105,7.5×104和1.3×105;对得量较多的PPQ50-2和PPQ70-2进行了结构分析,证明二者均为葡聚糖;并利用NaIO4氧化反应和核磁共振谱等方法对PPQ50-2的化学结构进行了初步的糖基键合分析。结论首次从转基因西洋参冠瘿组织中分离得到4种化学均一性多糖成分,其中PPQ50-2和PPQ70-2均为葡聚糖。     

重组人内皮抑素层析复性的相关研究

研究了由大肠杆菌表达的重组人内皮抑素(Recombinant human endostatin,rhES)的复性、纯化过程.比较先层析复性后纯化(工艺1)和先纯化后层析复性(工艺2)两种工艺的结果表明:工艺1所得rhES的收率和活性回收率分别为64.44%和213.19%,与工艺2相比分别提高8.70%和33.04%.工艺1中,研究了3种凝胶过滤柱复性及复性pH和上样蛋白浓度对复性的影响,并优化相关工艺.结果表明:在pH9.0,rhES浓度3.91 mg/mL的条件下,采用双梯度凝胶过滤Sephacryl S-100 HR进行层析复性,Sephadex G-25脱盐后,用SP Sepharose FF阳离子交换吸附纯化,获得活性回收率为213.19%,HPLC纯度为97.07%的rhES,其IC50为1.58 ug/mL.     

华支睾吸虫成虫抗原纯化及鉴定

用葡聚糖凝胶Sephadex G-200柱层析法、三氯醋酸-乙醇提取物DEAE-Cellulose(DE52)柱层析法、尿素提取物Sepharose 4B柱层析法对华支睾吸虫成虫可溶性抗原进行部分纯化,获得8种不同的抗原活性组分.并用免疫电泳、聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳(PAGE)、薄层等电聚焦电泳、微板法动力学酶联免疫吸附试验进行鉴定.认为经纯化的抗原组分较粗抗原更适宜于临床诊断及考核疗效     

重组人瘦素的分离纯化

目的：探索毕赤酵母表达的人瘦素的非亲和层析纯化方法。方法：采用强阴离子交换柱(Sepharose Qfast flow)和疏水层析柱(Phenyl Sepharose 6 fast flow)在pH7．5的条件下进行纯化。结果：经Q柱一步纯化后，产物纯度由42．3％到达89．6％，随后通过疏水层析纯化后，产物纯度达到96．2％。经SDS—PAGE证实为单一蛋白条带。结论：通过上述手段已成功分离纯化得到纯度较高的由毕赤酵母表达的重组人瘦素。     

蜜蜂毒中蜂毒素的分离纯化方法及含量测定

目的：从蜜蜂毒中分离纯化蜂毒素（melittin),建立以SDS-聚丙烯酰 胺凝胶电泳(SDS－PAGE）及HPLC进行蜂毒素定性定量分析的方法。方法：用Sephadex G-25、Sephadex G-50、Sephadex G-75三步层析法从蜜蜂毒中分离纯化蜂毒素,以SDS－PAGE定性,以HPLC进行含量测定。结果：样品经SDS－PAGE测定为单一条带,相对分子质量约3000。HPLC含量测定,平均回收率为95．97％,相对标准差（RSD）为1．07％。结论：以上述分离纯化法可制得高纯度的蜂毒素,检测方法准确、可靠、简单。     

仓鼠经口给予亚砷酸盐后血浆中砷结合蛋白的纯化

目的：探索用凝胶过滤柱和阴离子交换柱,结合电感耦合等离子质谱仪分离纯化砷结合蛋白,为阐明砷的毒理机制提供技术支持。
方法：通过HPLC-ICP-MS技术,采用KW-803色谱柱、凝胶过滤柱和离子交换柱分离纯化仓鼠血浆中的砷结合蛋白;SDS-PAGE凝胶电泳分析由HPLC-ICP-MS系统凝胶过滤柱和离子交换柱获得的每个蛋白样本。
结果：①仓鼠单次经口给予三价亚砷酸（iAsⅢ）后,运用三步法即利用凝胶过滤、KW-803色谱柱和阴离子交换等色谱柱联用HPLC-ICP-MS,最后纯化得到了仓鼠血浆中砷结合蛋白;②SDS-PAGE凝胶电泳分析由HPLC-ICP-MS系统联用不同凝胶过滤柱和离子交换柱获得的每个蛋白样本,检测到砷结合蛋白分子量大约40~50 kD。
结论：凝胶过滤柱和阴离子交换柱,结合电感耦合等离子质谱仪是分离纯化动物血浆或组织上清砷结合蛋白简便快速的方法。     

蝎毒促增殖肽在大鼠骨髓间充质干细胞上靶蛋白的初步研究

目的研究蝎毒促增殖肽Bmkpp在大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)中的靶点。方法采用Sepha-dex G-50凝胶层析和CM-Sepharose Fast Flow弱阳离子交换层析从东亚钳蝎蝎毒中分离纯化出蝎毒促增殖肽Bmkpp,RP-HPLC检测,酶解-质谱鉴定;提取大鼠BMSCs全蛋白、膜蛋白、胞浆蛋白后上样到Bmkpp亲和层析柱,洗脱收集靶蛋白峰,超滤离心法脱盐浓缩;SDS-PAGE电泳分析洗脱蛋白。结果分离纯化出Bmkpp和其相邻的峰4,RP-HPLC检测分离纯化的Bmkpp纯度达95%。酶解质谱法鉴定其与Bmkpp标准品的主要成分一致。一步亲和层析洗脱峰均为2个,电泳结果显示胞浆洗脱蛋白条带较多,但细胞膜无结合蛋白条带。改变盐浓度分步梯度洗脱全蛋白共得4个峰,1 mol/L NaCl盐浓度分步洗脱全蛋白于13、14、40、260 kD处有4条较明显的电泳条带。结论 Bmkpp在BMSCs上作用于多个靶点并有其特异性的靶标。     

广西产圆斑蝰蛇毒神经生长因子的分离纯化及鉴定

目的 从蝰蛇蛇毒中分离纯化神经生长因子(NGF)。方法 粗毒采用CM52阳离子交换柱层析，DEAE Sephadex A-50阴离子交换柱层析及Sephadex G-75凝胶过滤进行分离纯化。洗脱峰利用PCI2细胞测定活性，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦圆盘电泳(EFG)等方法，进行理化性质的鉴定。结果 从粗毒6．0g中得到电泳纯的神经生长因子3．64mg，分子量为36kD，由两个亚基通过二硫键交联组成二体结构。等电点pI为6．7，在0．5～5．0μg／mL时，对PCI2细胞有良好的促进分化作用。结论 本法可从广西产圆斑蝰蛇毒粗毒中得到电泳纯的神经生长因子。     

凝胶过滤色谱-蒸发光散射法监测麦冬多糖色谱分离的研究

目的 探讨高效凝胶过滤色谱-蒸发光散射检测法（HPGPC-ELSD）用于监测多糖分离纯化的可行性和优点。方法 以麦冬多糖为模型多糖,比较DEAE Sepharose^TM Fast Flow、Sephadex G-50和G-25柱色谱的纯化效果,比较分别以HPGPC-ELSD和传统的蒽酮-硫酸法测定结果为收集标准时的纯化情况。结果 通过HPGPC-ELSD测定确知,DEAE Sepharose可将麦冬多糖粗提物中的非中性糖部分除去; Sephadex G-50和G-25均不能够很有效地将粗多糖中的麦冬多糖与低聚糖和单糖分离。结合HPGPC-ELSD和蒽酮-硫酸法的优点,将其合理组合用于监测麦冬多糖的凝胶色谱分离,可以同时确保多糖色谱分离纯化的速度和质量。结论 以HPGPC-ELSD测定结果作为收集标准特别适合于较难分离或纯化要求较高的多糖类成分的分离纯化。     

细胞间粘附分子—1^125I标记及其纯度、免疫活性的鉴定

目的：建立细胞间粘附分子－1（intracellular adhesion molecule-1 ICAM-1)^125I标记方法及鉴定其纯度和免疫活性。方法：用氯胺－T法标记ICAM－1,用Sephadex G-50柱层析分离,用纸层析法鉴定^125I-ICAM-1的纯度,放免法检测其免疫活性,结果：^125I-ICAM-1比活度为77．84uCi/ug蛋白,标记率为65．54％,^125I-Na的放化纯度为97．27％,^125I-ICAM-1能够与ICAM－1－Ab的最大结合为88．64％,并且随ICAM－1－Ab滴度的降低而增高。结论：成功建立^125I标记ICAM－1的方法,并且^125I-ICAM-1具有一定的免疫活性。     

福建产舟山眼镜蛇毒细胞毒素的快速分离纯化及鉴定

目的 从舟山眼镜蛇毒中分离纯化细胞毒素(CTX)，并鉴定其理化性质。方法 采用SP—Sephadex C-25阳离子交换色谱及Sephasil Peptide C18反相高效液相色谱法从舟山眼镜蛇毒中分离纯化CTX，SDS—PAGE(Tris—Tricine系统)鉴定纯度，Edman降解法测定N端氨基酸序列。结果 粗毒经阳离子交换色谱，得到14个蛋白峰，其中第X～XⅢ峰具CTX活性；再分别经反相色谱纯化，得到4个CTX．总得率为32.48％；SDS—PAGE显示为均一蛋白，分子量依次为：7．28，7．33，7．24和7．38kD；测定它们N端20个氨基酸序列。结论 采用阳离子交换和反相高效液相色谱可快速、高效地从眼镜蛇毒中获得4个CTX纯品。     

凝胶过滤法和离心法测定盐酸川芎嗪脂质体包封率比较

目的：比较凝胶过滤法和离心法测定盐酸川芎嗪脂质体包封率。方法：用葡聚糖凝胶Sephadex G-50装柱,分离盐酸川芎嗪脂质体和游离药物;另外用转速为15000r/min的高速离心机分离脂质体和游离药物,HPLC法测定盐酸川芎嗪药物浓度,计算包封率。结果：两种测定包封率的方法结果一致,没有显著性的差异（P〉0.05）。结论：可用离心法代替凝胶过滤法方便快速地测定盐酸川芎嗪脂质体包封率。     

家兔肝脏中锌-金硫蛋白提取工艺的研究

目的 研究硫酸锌诱导的家兔肝脏锌-金属硫蛋白(Zn-MT)的提取工艺。方法 选用正交试验法对硫酸锌诱导的兔肝锌-金属硫蛋白的提取工艺进行优选，以原子吸收法测得锌提取量和紫外分光光度法测得巯基活性及杂蛋白浓度为评价指标，选用L9(3^4)正交表进行正交实验。考察影响提取锌-金属硫蛋白的4个因素分别为：pH8．6的Tris-HCl缓冲溶液和乙醇-氯仿(1．03：0．08)溶液作为提取剂的用量、80℃水浴变性时间、超声强度及时问。并且对提取液用Sephadex G-50凝胶柱色谱法分离纯化了Zn-MT，考察提取工艺对其分离纯化效果的影响。结果 最佳方案为：每克兔肝用3mL缓冲溶液和2mL乙醇-氯仿溶液。80℃水浴变性6min，中等超声强度提取20min。凝胶柱色谱法纯化得到Zn-MT粗品产率约为2．5mg／g肝，而提取工艺中杂蛋白溶出量可影响Zn-MT的分离纯化效果。结论 为常规实验室制备Zn-MT提供了简便可靠的方法。     

蝎毒抗癌多肽及其纯化组分Ⅰ及Ⅲ的毒性观察

目的观察蝎毒抗癌多肽(APBMV)纯化组分Ⅰ(AP-Ⅰ)及Ⅲ(AP-Ⅲ)与蝎毒抗癌多肽之间的毒性差别,为前二者药效学研究提供新的实验依据.方法取昆明种小鼠180只,随机分为18组,每组10只,腹腔一次注射0.2ml/20g不同浓度的APBMV(1～6组)、AP-Ⅰ(7～12组)及AP-Ⅲ(13～18组),观察动物的行为学改变,并取出死亡动物脏器进行病理学观察,按照综合计算法得出AP-Ⅰ、AP-Ⅲ与APBMV的LD50和95%可信区间.结果小鼠注射高浓度的APBMV、AP-Ⅰ或AP-Ⅲ后,在2min后即出现明显的烦躁、尖叫、嘶咬、多涎,继而呆滞、呼吸不规则、颈毛直立等行为学改变,随着给药时间的延长,动物会表现行动迟缓、竖尾、腹泻、喘息性呼吸,后肢强直,窒息直至死亡.而其他各组在3min后才出现程度不同的毒性反应.高浓度组动物在25min内全部死亡,其他各组部分动物在60min内相继死亡.死亡和处死动物内脏无明显病理学改变.APBMV、AP-Ⅰ或AP-Ⅲ的LD50和95%可信区间分别为1.386,1.118,1.145和(1.386±0.247),(1.118±0.194),(1.145±20.198).结论[HTSSAPBMV经进一步纯化后,其有效成分AP-Ⅰ及AP-Ⅲ毒性均有显著提高.