实验性牙移动大鼠外周血内皮祖细胞的培养

背景:观察血管内皮祖细胞在牙周血管改建中的作用规律对于研究正畸牙周改建机制具有重要意义.目的:对牙移动大鼠外周血内皮祖细胞进行体外分离、培养及鉴定,探讨牙齿移动足否可动员骨髓内皮祖细胞进入外周血.设计、时间及地点:细胞体外分离培养及生物学指标检测,随机对照动物实验.于2007-09/2008-04在吉林省口腔生物医学工程重点实验室完成.材料:24只Wistar大鼠.随机分为实验组和对照组,每组12只.方法:实验组建立大鼠牙移动模型,对照组置牵拉装置但不加力.加力第2天取两组动物外周血制作细胞涂片,检测其中CD133阳性细胞数.同时以Percoll密度梯度分离提取其外周血单个核细胞,培养全第12天,取两组细胞爬片进行相关指标检测.主要观察指标:以免疫细胞化学染色和免疫荧光化学染色检测细胞表面标志物,荧光化学检测细胞吸收乙酰化低密度脂蛋白及荆豆凝集素1情况,MTT法检测细胞增殖情况.结果:实验组细胞涂片中CD133阳性细胞率明显高于对照组(P＜0.05).所培养细胞可同时吸收Dil标记的乙酰化低密度脂蛋白、FITC标记的荆豆凝集素1,呈CD133、Ⅷ因子、CD34阳性.实验组细胞增殖活性高于对照组(P＜0.05).结论:实验初步证实了实验性牙移动可动员大鼠骨髓内皮祖细胞进入外周血.     

应用体外扩增法对兔骨髓来源内皮祖细胞的分离培养和鉴定

目的拟从兔的骨髓中通过体外扩增法分离培养出血管内皮祖细胞,为进一步研究自体血管内皮祖细胞移植促进血管内皮的修复提供细胞学基础.方法实验于2005-03/2006-02在解放军第二军医大学长征医院内科实验室完成.①DiL标记的乙酰化低密度脂蛋白(molecular probes公司),FITC标记的凝结素BS-1(vector公司),鼠抗人CD34抗体(Biolegend公司),兔抗人Flk-1抗体(Biolegeng公司),鼠抗人CD133单抗(R&D公司).②选用新西兰大白兔8只,抽取骨髓,密度离心法分离骨髓单个核细胞.接种密度为1×106/cm2,加入含有血管内皮生长因子、碱性成纤维生长因子的M199培养基中体外扩增培养7 d,观察细胞生长情况及增殖能力.③通过DiL标记的乙酰化低密度脂蛋白和FITC标记的凝集素BS-1双染法鉴定血管内皮祖细胞,显示红色荧光的为吞噬了乙酰化低密度脂蛋白的细胞,绿色荧光为结合BS-1的细胞,双染色为橙色荧光.④免疫荧光染色及流式细胞仪检测CD133,CD34,Flk-1 的表达.结果(①细胞形态观察新分离的骨髓单个核细胞呈圆形,培养72 h后可见贴壁细胞呈集落样生长,细胞呈圆形或不规则形,核分裂相明显,至培养第7天成片生长的细胞集落相互连接,呈梭形的内皮样细胞.②血管内皮祖细胞的增髓能力培养2～4 d血管内皮祖细胞增殖较快,之后增殖速度减缓,生长曲线呈典型"S"形外观,培养第6,7天血管内皮祖细胞生长再次增快,吸光度值分别达到0.58±0.15和0.62±0.23.③乙酰化低密度脂蛋白和凝集素BS-1双染法鉴定血管内皮祖细胞结果在血管内皮祖细 胞的胞质中,出现与乙酰化低密度脂蛋白结合的红色荧光聚集,阳性率达95%以上;与凝集素BS-1结合率几乎达100%;二者双染色率达90%以上.④血管内皮祖细胞免疫组化及流式细胞仪检测结果细胞表面标志物CD133,Flk-1,CD34均呈阳性.结论体外扩增法成功地从兔骨髓中分离培养出具有血管内皮祖细胞特征的细胞群体.     

人脐血和外周血内皮祖细胞的分离培养和鉴定

背景：国内外有关内皮祖细胞的分离培养和鉴定方面的文章很多,但是人脐血和外周血内皮祖细胞的鉴别方面文章不多。目的：从人脐血和外周血中分离出内皮祖细胞,并对其进行培养和鉴定。方法：选取密度梯度离心法从脐血和外周血中分离获得单个核细胞,按照1×10^6／cm^2的浓度种植于预先铺有纤维连接蛋白的培养板中,用含血管内皮生长因子的M199培养基进行诱导培养。结果与结论：人脐血和外周血中存在内皮祖细胞,浓度梯度离心联合贴壁筛选获得的单个核细胞在血管内皮生长因子的诱导培养下可分化成内皮祖细胞,内皮祖细胞表达CD34、CD133、CD105、KDR和CD31,能吞噬乙酰化低密度脂蛋白,结合荆豆凝集素1,它们可作为体外分选内皮祖细胞的标志。     

紫绀型先天性心脏病患儿外周血内皮祖细胞的体外分离培养和鉴定

背景:一些基础研究成果对于新生血管形成和内皮祖细胞的自动募集机制已做出了合理的解释,体外培养的内皮祖细胞可分化为成熟的内皮细胞,有助于血管内皮修复。目的:拟建立从紫绀型先天性心脏病患儿外周血获取内皮祖细胞的方法。设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2007-08/2008-04在中南大学湘雅二医院完成。材料:外周血来源于2007-10/12中南大学湘雅二医院胸外科收治的15例法洛四联症患儿,安静状态下末梢氧饱和度为(78.0±5.0)%。方法:采用Ficoll密度梯度离心法从外周血中分离单个核细胞,以含体积分数为0.2的胎牛血清、4mg/L牛脑垂体提取物、2mmol/L谷氨酰胺、100U/mL氨苄青霉素、100g/L硫酸链霉素的M199培养基进行体外诱导分化,调整细胞密度为2×109L-1,接种至预铺人纤维连接蛋白的6孔培养板,置于37℃、体积分数为0.05的CO2饱和湿度条件下,贴壁法纯化培养10d。主要观察指标:细胞形态和生长情况,Dil标记的乙酰化低密度脂蛋白/FITC标记的荆豆凝集素双荧光染色鉴定结果,vWF、CD34及CD31免疫组化鉴定结果,PE标记CD133抗体与藻蓝蛋白标记KDR抗体免疫荧光鉴定结果,透射电镜观察内皮祖细胞特征细胞器。结果:接种后0.5h细胞贴壁生长,培养第7天形成典型的细胞集落,第14天呈铺路石样外观,细胞数量级可达108。培养第10天,贴壁细胞中70%呈Dil标记的乙酰化低密度脂蛋白/FITC-UEA-Ⅰ双阳性,为正在分化的内皮祖细胞;vWF、CD34及CD31免疫组化染色均呈阳性表达;PE标记CD133抗体呈红色荧光,藻蓝蛋白标记KDR抗体呈蓝色荧光。透射电镜可见内皮祖细胞特征性幼稚线粒体及Weibel-Palade小体。结论:实验成功从紫绀型先天性心脏病患儿外周血中分离培养并获取高纯度的内皮祖细胞,且在体外稳定快速扩增。     

体外扩增法分离培养兔骨髓来源的血管内皮祖细胞

背景:体外扩增法培养血管内皮祖细胞操作简便、费用低廉是实验中获取内皮祖细胞的主要方法。目的:拟从兔的骨髓中通过体外扩增法分离培养出血管内皮祖细胞,为进一步观察自体血管内皮祖细胞移植促进血管内皮的修复提供细胞学基础。设计、时间及地点:开放性实验,于2005-03/2006-02在解放军第二军医大学长征医院内科实验室完成。材料:6~8月龄新西兰大白兔8只,雌雄不拘,体质量(2.5±0.5)kg,抽取骨髓,密度离心法分离骨髓单个核细胞方法:将骨髓单个核细胞接种于密度为1×106cm-2,加入含有血管内皮细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子的M199培养基中体外扩增培养7d,通过DiL标记的乙酰化低密度脂蛋白和FITC标记的凝集素BS-1双染法鉴定血管内皮祖细胞,显示红色荧光的为吞噬了乙酰化低密度脂蛋白的细胞,绿色荧光为结合BS-1的细胞,双染色为橙色荧光。免疫荧光染色及流式细胞仪检测CD133,CD34,Flk-1的表达。主要观察指标:①细胞形态观察。②血管内皮祖细胞的增殖能力。③乙酰化低密度脂蛋白和凝集素BS-1双染法鉴定血管内皮祖细胞结果。④血管内皮祖细胞免疫组织化学鉴定结果。⑤血管内皮祖细胞表面标志物流式细胞仪检测结果。结果:①细胞形态观察:新分离的骨髓单个核细胞呈圆形,培养72h后可见贴壁细胞呈集落样生长,细胞呈圆形或不规则形,核分裂相明显,至培养第7天成片生长的细胞集落相互连接,呈梭形的内皮样细胞。②血管内皮祖细胞的增殖能力:培养2~4d血管内皮祖细胞增殖较快,之后增殖速度减缓,生长曲线呈典型"S"形外观,培养第6,7天血管内皮祖细胞生长再次增快,吸光度值分别达到0.58±0.15和0.62±0.23。③在血管内皮祖细胞的胞质中,出现与乙酰化低密度脂蛋白结合的红色荧光聚集,阳性率达95%以上;与凝集素BS-1结合率几乎达100%;两者双染色率达90%以上。④血管内皮祖细胞免疫组织化学及流式细胞仪检测细胞表面标志物CD133,FlK-1,CD34均呈阳性。结论:体外扩增法成功地从兔骨髓中分离培养出具有血管内皮祖细胞特征的细胞群体。     

利用自体血清培养人外周血内皮祖细胞

背景:传统方法培养人外周血来源内皮祖细胞操作复杂,费用大,细胞获得率较低。目的:利用自体血清培养人外周血来源内皮祖细胞,并鉴定其功能。方法:采用密度梯度离心法从人外周血分离得到单个核细胞,体外培养分化为内皮祖细胞。按培养基条件不同分为EGM-2MV组、添加自体血清组(M199+体积分数10%自体血清+胰岛素样生长因子)、添加胎牛血清组(M199+体积分数10%胎牛血清+血管内皮细胞生长因子+碱性成纤维细胞生长因子+胰岛素样生长因子+表皮生长因子)。观察内皮祖细胞增殖、迁移能力;采用细胞形态观察、双荧光染色法及流式细胞仪等技术对培养的内皮祖细胞进行鉴定。结果与结论:培养第7天,EBM-2MV组和添加自体血清组细胞增殖能力和迁移率都优于添加胎牛血清组(P<0.05)。每组细胞经结合Dil标记的乙酰化低密度脂蛋白和异硫氰酸荧光素标记的荆豆凝集素双色荧光染色鉴定后双阳性率>80%,免疫细胞化学检测显示每组细胞CD133,CD34和KDR的表达均为阳性。证实在M199培养液中添加自体血清是一种简单、高效的培养内皮祖细胞方法。     

两种分离培养小鼠骨髓来源内皮祖细胞方法的比较

目的 比较密度梯度离心法及全骨髓培养法分离培养内皮祖细胞的差异。方法 取4周雄性近交系C57BL/6J小鼠骨髓,分别使用密度梯度离心法及全骨髓培养法培养,观察细胞贴壁情况和细胞形态,并行DiI acLDL及FITC UEA I双染、vWF、eNOS及细胞表面标志检测。结果 密度梯度离心法培养细胞可形成典型铺路石样改变及形成血管样结构;而全骨髓培养法贴壁细胞形态多样,较多呈长梭形铺展生长,部分细胞呈类圆形及纺锤形。比较两种方法培养细胞摄取DiI acLDL、结合FITC UEA I双阳性率以及vWF、eNOS及细胞表面标志表达阳性率,差别均有统计学意义（P〈005）。应用密度梯度离心法,随着培养时间延长,表达CD34、CD133及FLk 1细胞逐渐增多（P〈005）。结论 密度梯度离心法及全骨髓培养法在EGM 2MV培养体系下均可培养出内皮祖细胞,但密度梯度离心法较全骨髓培养法培养的内皮祖细胞纯度高。     

绵羊骨髓来源内皮祖细胞的培养与鉴定

背景:当今,组织工程化静脉瓣的研究刚刚起步,种子细胞的选择是其关键,内皮祖细胞可以作为组织工程化静脉瓣体外构建理想的种子细胞.目的:通过体外培养与鉴定绵羊骨髓来源内皮祖细胞,探讨绵羊骨髓来源内皮祖细胞培养方法,为绵羊组织工程静脉瓣种子细胞选择提供实验基础.方法:绵羊骨髓经条件培养基进行选择培养获取骨髓单个核细胞,传代扩增后用磁珠分选出CD133+细胞再培养,流式细胞检测确认分前细胞CD133的表达情况;分选传代后绘制细胞生长曲线观察细胞生长能力,用免疫细胞化学检测细胞特异性分了CD133,D34,VWF的表达情况;FITC标记BS-1-Lectin和Dil标记ac-LDL标记细胞检测细胞吞噬功能.结果与结论:绵羊骨髓单个核细胞原代培养2 d细胞开始贴壁,7 d细胞完全融合,传代后第2天进入对数生长期,传代3～5 d形成为典型的铺路石样,传代后第7 d细胞进入增殖平台期;细胞传代后磁珠分选率为12.6%,流式细胞仪检测显示CD133阳性率为12.64%:免疫细胞化学检测显示细胞呈CD133、CD34、血管性血友病因子阳性表达.细胞能同时吞噬FITC-labeledBS-1-lectin,Dil-ac-LDL阳性率达85.3%.证实实验成功地从绵羊骨髓单个核细胞中分离培养出内皮祖细胞.     

人外周血内皮祖细胞的培养与鉴定

目的:探讨人外周血内皮祖细胞体外诱导分化及鉴定的方法,为自体外周血内皮祖细胞移植的临床应用打基础。方法:实验于2004-09/2005-05在解放军第四军医大学西京医院肝胆外科实验室完成。采集献血员抗凝外周血,经Ficoll密度梯度离心法获取单个核细胞,在含有体积分数为0.1胎牛血清、20μg/L的血管内皮细胞生长因子和4μg/L的碱性成纤维细胞生长因子的M199培养液中培养和扩增,分别在培养的第6和14天,流式细胞仪检测其KDR,CD133,CD34和vWF阳性率,并通过检测其对异硫氰酸荧光素标记的荆豆凝集素的吸附和内吞DiI-acLDL来进行细胞功能学的鉴定。结果:①人外周血单个核细胞经体外诱导分化,培养第6天的贴壁细胞表达KDR,CD133,CD34和vWF,流式细胞仪检测其阳性率分别为(46.4±9.3)%、(33.8±11.7)%、(73.5±6.3)%和(38.9±8.2)%,能特异性吸附异硫氰酸荧光素标记的荆豆凝集素并内吞DiI-acLDL。②培养第14天的贴壁细胞表达KDR,CD34和vWF,不表达CD133,流式细胞仪检测其阳性率分别为(81.5±7.6)%、(88.9±5.4)%和(78.3±13.6)%,能特异性吸附异硫氰酸荧光素标记的荆豆凝集素并内吞DiI-acLDL。结论:外周血来源的单个核细胞在一定的培养条件下可以分化为内皮祖细胞,为自体外周血内皮祖细胞移植的临床应用打下基础。     

兔骨髓源性血管内皮祖细胞的分离、培养及鉴定

本研究探讨兔骨髓源性血管内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPC)的分离、培养及鉴定方法。抽取兔骨髓细胞,用梯度密度离心法获得单个核细胞,以内皮细胞培养液培养,通过细胞形态观察、免疫组织化学试验、流式细胞术以及内皮祖细胞吞噬功能进行鉴定。结果表明,新分离的骨髓单个核细胞呈圆形,培养48小时后可见贴壁细胞呈集落样生长,细胞呈圆形或不规则形,核分裂相明显,至培养第7天成片生长的细胞集落相互连接呈梭形的内皮样细胞。内皮祖细胞免疫组织化学检测结果显示CD133(+),CD34(+),Ⅷ因子(++),KDR(++);流式细胞术鉴定结果显示CD133的阳性率为(18.23±7.12)%,CD34的阳性率为(47.71±14.85)%,CD31的阳性率为(71.61±13.51)%,KDR的阳性率为(87.24±11.40)%。细胞吞噬功能鉴定说明超过80%的贴壁细胞都特异性地摄取了Dil-acLDL和FITC-UEA-1。结论:密度梯度离心法体外分离兔骨髓源的单个核细胞,在一定的诱导培养条件下能分化成为血管内皮祖细胞。     

人脐带血内皮祖细胞与血管内皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子共培养及其增殖和迁移能力

背景：目前组织工程心脏瓣膜再内皮化种子细胞主要来源于成熟内皮细胞,内皮祖细胞作为内皮细胞的前体细胞越来越受到人们的关注。目的：分离和扩增人脐带血内皮祖细胞,观测其体外生物学特性。方法：密度梯度离心法分离新鲜的脐血中单个核细胞,在含血管内皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子的培养液中培养扩增,通过形态学、免疫荧光和流式细胞仪等对贴壁细胞进行鉴定;并与脐静脉内皮细胞进行增殖和迁移能力比较。结果与结论：随着培养和诱导时间延长,贴壁细胞形态发生明显的改变,从小圆形变成梭形,逐渐分化成典型成熟内皮细胞的鹅卵石样形态,并可形成特征性的克隆;体外诱导7d后90%以上贴壁细胞呈Dil-ac-LDL和FITC-UEA-I双阳性;贴壁细胞流式细胞仪分析显示：培养7d的细胞VEGFR-2、CD34和CD133表达分别占（77.4±4.9）%、（52.4±6.6）%和（19.4±2.1）%,培养28d的细胞VEGFR-2和CD34表达分别占（81.1±7.4）%和（7.6±3.1）%,而未检测到CD133表达;人内皮祖细胞增殖和迁移能力明显高于人脐静脉内皮细胞（P〈0.05）,并且细胞数量可扩增达109L-1。结果显示用密度梯度离心法和贴壁筛选法,可从人脐带血分离、纯化内皮祖细胞;内皮祖细胞可诱导分化为内皮细胞,增殖和迁移能力都很强。     

大鼠骨髓与外周血来源内皮祖细胞生物学特性比较

背景：内皮祖细胞不仅参与胚胎血管生成,也参与出生后血管发生和血管内膜损伤后修复,对治疗缺血性疾病意义重大,但目前对内皮祖细胞的分离、培养、鉴定还存在争议。目的：体外分离、培养大鼠骨髓与外周血来源的内皮祖细胞,并比较其生物学特性。方法：密度梯度离心法分离SD大鼠骨髓和外周血单个核细胞,接种于纤维连接蛋白铺被的培养瓶中贴壁培养,用加入血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子及表皮生长因子的完全培养基诱导培养,对获得的贴壁细胞进行细胞形态学,免疫细胞化学染色,流式细胞仪,透射电镜,以及Dil-acLDL、FITC-UEA-1双荧光染色法检测。结果与结论：骨髓来源的内皮祖细胞数量多,集落状生长,增殖能力强;外周血来源的内皮祖细胞数量较少,散在生长,消化后能贴壁但不能传代。两种不同来源的内皮祖细胞免疫细胞化学检测贴壁细胞CDl33、CD34、FIk-1、Ⅷ因子在不同时段呈阳性表达;激光共聚焦显微镜观察,Dil-acLDL、FITC-UEA-1均为双染。透射电镜检查外周血来源的内皮祖细胞发现W-P小体。提示大鼠骨髓和外周血均能分离培养出内皮祖细胞,但前者是早期内皮祖细胞,后者为晚期内皮祖细胞,两者生物学特性各不相同。     

全骨髓培养法扩增小鼠内皮祖细胞

背景：对于小型实验动物,通过分离骨髓单个核细胞进行内皮祖细胞培养、扩增的方法较为繁琐。目的：探讨采用全骨髓培养方式扩增小型动物内皮祖细胞的可行性。方法：采用全骨髓培养分离C57BL/6小鼠内皮祖细胞,培养第7天行DiL-acLDL和FITC-UEA-1双荧光染色检测,并利用流式细胞仪检测其CD34、FLK-1表达情况。同时检测其体外血管生成能力,黏附、增殖和迁移能力。设立骨髓单个核细胞培养法为对照。结果与结论：全骨髓培养至第2天便可见早期内皮祖细胞集落形成,第7天时可见大量短梭状内皮祖细胞,其具有吞噬DiL-acLDL及结合FITC-UEA-1的能力,内皮祖细胞在基质胶上同样能够形成血管样结构,培养至第2周晚期内皮祖细胞集落出现,迅速生长形成典型的铺路石样,并能够在体外传代培养,细胞数量、细胞表面CD34、FLK-1表达、体外黏附、增殖和迁移能力及晚期集落出现时间与对照组差异无显著性意义（P〉0.05）。说明采用全骨髓培养的方式能够实现小型动物内皮祖细胞的筛选扩增,且操作简便。     

离心管贴壁细胞对人脐血单个核细胞体外培养成功率的影响

背景：在常规的脐血间充质干细胞密度梯度离心分离过程中,离心管壁有大量单个核贴壁细胞,这些早期的贴壁细胞是否与脐血间充质干细胞的体外培养成功率低存在一定的联系呢？目的：比较4种方法分离人脐血单个核细胞的体外培养成功率,观察离心管贴壁细胞对人脐血单个核细胞体外培养成功率的影响。方法：取足月健康顺产新生儿脐血36份,随机分为4组,每组9份,于采集后6h内分别采用甲基纤维素沉降法（A组）、密度梯度离心分离法（B组）、甲基纤维素联合密度梯度离心分离法（C组）、甲基纤维素联合改良密度梯度离心分离法（D组）分离出单个核细胞,锥虫蓝染色检测细胞活力,用细胞计数板进行细胞计数,调整细胞浓度为1×109L-1～2×109L-1,接种于含体积分数为10%胎牛血清的低糖DMEM培养基中培养和传代,相差显微镜下观察脐血单个核细胞的形态。收集第3代脐血单个核细胞,采用细胞计数板进行计数,计算扩增倍数,采用流式细胞仪鉴定细胞免疫表型。结果与结论：36份脐血中,成功分离33份脐血单个核细胞,B组有3份分离失败。33份中共22份原代培养中出现大量贴壁细胞,其中A组8份,B组2份,C组5份,D组7份。9份（27%）培养出能融合且可稳定传代的成纤维样细胞,其中A组3份,B组0份,C组1份,D组5份。4组脐血单个核细胞在原代培养5～7d后均可见数量不等的贴壁细胞,呈梭形成纤维样细胞或（和）圆形巨核样细胞。A组与D组于原代培养三四周可见成纤维样细胞集落形成,细胞形态与骨髓间充质干细胞相似,呈较均一的长梭形,可稳定培养至60～90d形态无明显变化。流式细胞仪免疫检测,第3代脐血单个核细胞不表达或弱表达CD34、CD45和CD106等造血干细胞和内皮细胞标志,但显著表达CD29、CD105等间充质干细胞表面标志。结果显示离心管贴壁细胞可显著提高脐血单个核细胞的体外培养成功率,而甲基纤维素联合改良的密度梯度离心分离法,可充分回收离心管贴壁细胞,利于脐血单个核细胞的体外扩增和稳定传代。     

巴曲酶可影响人外周血内皮祖细胞定向分化及增殖能力

背景：近年来内皮祖细胞促进机体血管新生方面的重要作用已形成共识,但内皮祖细胞的定向分化和扩增的问题是影响其疗效和广泛开展的主要原因。目的：观察人外周血内皮祖细胞体外分离、纯化、扩增和诱导分化为内皮细胞的可行性。方法：用密度梯度离心法从外周血获取单个核细胞,接种于包被有人纤维连接蛋白的细胞培养板中,培养6d后,收集贴壁细胞。以血管内皮细胞生长因子和碱性成纤维细胞生长因子对贴壁细胞进行诱导培养。另外,分别以0.05,0.1,0.2BU/mL巴曲酶培养贴壁细胞,观察内皮祖细胞的增殖能力。结果与结论：经血管内皮细胞生长因子和碱性成纤维细胞生长因子诱导后的细胞形态上表现内皮细胞特征,经流式细胞仪测定表达血管内皮细胞特有表面标志CD31和vWF,说明诱导后的细胞为内皮细胞。巴曲酶在体外培养条件下可增加血内皮祖细胞的数量,以0.1BU/mL浓度作用显著,且作用时间与血内皮祖细胞增殖能力的改善呈正相关。     

前列腺癌干细胞分离方法的对比及筛选

背景：前列腺癌干细胞是前列腺癌复发侵袭的重要原因,目前研究难点在于前列腺癌干细胞分离技术效率较低。目的：探索高效地从人前列腺癌PC-3及LNCap细胞株分离前列腺癌干细胞的方法。方法：采用含血清贴壁培养法及无血清悬浮培养法培养PC-3及LNCap细胞株,然后利用流式细胞表面标记CD133及CD44检测两种细胞在不同培养条件下可获取前列腺癌干细胞的比例,同时采用诱导分化实验初步鉴定前列腺癌干细胞特性。结果与结论：PC-3及LNCap细胞能在添加生长因子的无血清培养基中形成悬浮细胞球,接种在含血清培养基后可以诱导分化为贴壁细胞;无血清培养组的CD44^＋/CD133^＋细胞比例：PC-3为0.59%,LNCap为1.71%,含血清培养组中的CD44^＋/CD133^＋细胞比例：PC-3为0.32%,LNCap为0.73%,其中LNCap细胞采用两种方法所获的CD44^＋/CD133^＋细胞均高于PC-3所获的的细胞（P〈0.05）,在两种细胞中无血清悬浮培养和含血清贴壁培养差异无显著性意义（P〉0.05）,但无血清悬浮培养周期长,获得细胞数相对较少,直接影响分选后肿瘤干细胞功能测定。因此可以证实含血清贴壁培养LNCap细胞较无血清悬浮培养法更能高效快捷的获取前列腺癌干细胞。     

骨髓基质细胞联合细胞因子对脐血单个核细胞表面抗原表达的影响

背景：课题组已建立胎儿骨髓基质细胞联合细胞因子的造血细胞体外培养体系,该培养体系能否有效扩增各个发育阶段的造血细胞有待验证。目的：观察骨髓基质细胞联合细胞因子培养体系对脐血单个核细胞表面抗原CD133、CD34表达的影响。方法：将从脐血标本中分离出来的单个核细胞接种于无血清培养体系,实验分为3组：①F组：干细胞因子＋Flt3配体＋促血小板生成素＋单个核细胞。②S组：基质细胞＋单个核细胞。③SF组：基质细胞＋干细胞因子＋Flt3配体＋促血小板生成素＋单个核细胞。在第0,6,10,14天检测有核细胞总数、CD133^＋、CD34^＋、CD133^＋CD34^＋细胞数以及集落形成单位数。结果与结论：SF组有核细胞总数在各个检测时间点均比其他两组高;除了第14天外,第6、10天两个时间点SF组中CD133^＋、CD34^＋、CD133^＋CD34^＋细胞及集落形成单位数均高于其他组;含骨髓基质细胞的S组和SF组中CD133＋细胞/有核细胞、CD34＋细胞/有核细胞、CD133＋CD34＋细胞/有核细胞的比例保持在较高的水平。结果说明骨髓基质细胞联合细胞因子能有效的扩增脐血单个核细胞及其中的CD133^＋、CD34^＋、CD133^＋CD34^＋细胞,基质细胞对维持造血干细胞的原始性具有重要的作用。     

密度梯度离心法体外培养骨髓间充质干细胞的分化能力

背景：骨髓间充质干细胞具有多向分化能力,是目前极具潜力的种子细胞及基因治疗的靶细胞。目的：体外培养兔骨髓来源间充质干细胞,了解其生物学特性。方法：采用密度梯度离心法培养兔骨髓间充质干细胞,对细胞的形态及生长特性进行观察,应用流式细胞仪检测细胞表面抗原CD29、CD34、CD44、CD45、CD166、HLA-DR表达,并进行相关生物学特性鉴定。结果与结论：密度梯度离心法能分离培养出纯度较高的骨髓间充质干细胞,流式细胞仪检测骨髓间充质干细胞表达CD29、CD44、CD166,不表达CD34、CD45、HLA-DR。在适当的条件下能够诱导分化成为成骨细胞、软骨细胞等。     

不同来源骨髓间充质干细胞对CD34~＋细胞增殖的影响

背景：作者前期研究显示,银屑病患者与正常人骨髓间充质干细胞的生物学特性、免疫学反应及抗原提呈功能有明显差异,而与流产胎儿骨髓间充质干细胞无明显差异。目的：观察不同来源骨髓间充质干细胞对正常人骨髓CD34^＋细胞增殖的影响。方法：密度梯度离心法分离银屑病患者和流产胎儿骨髓单一核细胞并培养、传代,传至第2代72h后收集培养上清液,流式细胞仪鉴定骨髓CD34^＋细胞及骨髓间充质干细胞纯度。倒置显微镜下观察培养细胞的生长状态,细胞磁珠分选仪分选出的正常人骨髓CD34^＋细胞加入骨髓间充质干细胞培养上清液培养24h后,四甲基偶氮唑盐比色法检测骨髓CD34^＋细胞的增殖活性。结果与结论：CD34^＋细胞加入银屑病患者和流产胎儿骨髓间充质干细胞培养上清培养24h后,细胞形态无差别。银屑病患者和流产胎儿骨髓间充质干细胞培养上清液对正常人骨髓CD34^＋细胞增殖的影响差异无显著性意义（P〉0.05）。